优化成像流式细胞术以量化HEK293T细胞外囊泡摄取动力学与特异性

摘要

细胞外囊泡（EVs）是大多数细胞类型自然分泌的纳米级脂质双层囊泡，作为通讯机制递送蛋白质、脂质、遗传物质。尽管EVs具治疗潜力，但关于EV摄取动力学与特异性信息有限。本研究优化基于成像流式细胞术（IFC）的平台，高通量定量评估剂量、时间、受体细胞特异性对人胚肾细胞（HEK293T）EV内化的影响。结果显示：HEK293T EV摄取为主动过程，呈剂量与时间依赖性；量化体外摄取选择性，发现HEK293T EVs被同源细胞以更高数量内化；神经干细胞内化HEK293T EVs显著多于成熟神经元，提示干细胞/祖细胞因代谢活性高于终末分化细胞，可能具有更高主动EV内化速率。表征EV摄取（特异性、剂量时间依赖性、动力学分析）将助于开发靶向高效的EV基疗法。

引言

细胞外囊泡研究因天然和工程化EVs的治疗诊断效用而蓬勃发展。EVs直径50-1000 nm，所有细胞类型产生，富含跨膜蛋白（CD63、CD81、CD9）、脂质、蛋白质、DNA、RNA、mRNA、microRNA。EV内容物（特别是活性mRNA和miRNA）通过全新翻译和翻译后调控靶细胞，被牵涉调节受体细胞。理解并修饰EV摄取动力学与内化最终将优化EV内容物向靶细胞递送，达到治疗获益所需浓度。

EVs曾被认为是“细胞垃圾”，现因生物相容性好、低免疫原性毒性、可重复给药、多给药途径、潜力递送药物基因疗法等优势成为细胞疗法替代方案。我们团队前期报道神经干细胞源EVs在卒中和创伤性脑损伤中有积极效果。小鼠和猪卒中模型中EVs改善卒中后组织功能恢复。啮齿类创伤性脑损伤模型显示EVs神经保护与功能获益。尽管观察到这些效果与未来潜力，但对EV摄取特异性与动力学知之甚少，阻碍EV疗法临床转化。

EVs也被工程化为转移载体，负载基因疗法、化学化合物等治疗剂，作为纳米颗粒疗法和递送载体替代。HEK293T细胞因增殖快、EV产量高、易遗传操作，广泛用作EV生产细胞。HEK293T EVs递送乳腺癌miRNA疗法，在神经鞘瘤模型递送化疗药物和治疗蛋白构建体。类似合成纳米颗粒细胞毒性体外研究，MTT实验显示未负载HEK293T EVs低毒性，负载化疗药物后高细胞毒性。鉴于HEK293T EVs广泛应用，本研究分析其动力学与特异性。

选择性/特异性摄取指EV天然靶向特定细胞类型能力。关于EV内化机制证据丰富但摄取特异性共识少。常见现象：EVs表现出对亲本细胞相似受体细胞的选择性摄取，上皮细胞内化上皮源EVs多于其他受体细胞；间充质干细胞（MSC）体外内化MSC源EVs显著多于其他细胞系。但也有研究发现EVs被所有细胞类型内化，体内给药显示非选择性生物分布。尽管EV治疗潜力巨大，对EV摄取特异性理解仍缺乏。更好理解EV摄取特异性可适当选择选择性内化目标受体细胞的EV生产细胞，提升EV治疗适用性。

EV摄取结果冲突的潜在原因包括测量平台缺乏标准化，包括剂量时间效应分析。最近国际细胞外囊泡学会（ISEV）专家组发布立场文件，强调分析剂量、时间等混杂因素对EV摄取的影响。指出“单一剂量不适用所有”，剂量可能影响EV摄取或选择性。提高HEK293T EVs剂量改变体内生物分布模式。血清源EVs摄取谱随剂量显著改变。此外，EVs与受体细胞共孵育时间从15分钟到48小时不等，可能改变摄取测量。若EV研究者和产业采用可量化可靠流程确定标准剂量时间曲线识别最小有效剂量，将带来更稳健有用研究。

此前研究者使用标准流式细胞术及各种低通量显微镜（如共聚焦显微镜）分析EV摄取。但这些技术有局限：共聚焦显微镜耗时主观；传统流式细胞仪设计测量细胞级生物颗粒，无法区分EV集群或重合，触发噪声增加。ISEV专家组提到传统流式细胞术物理局限性日益受关注，呼吁检测限达100 nm范围的专用流式细胞术。成像流式细胞术（IFC）结合流式细胞术高通量定量性与荧光成像技术，可分辨固有微小荧光颗粒（至100 nm直径）。IFC特性带来低噪声/背景、减少集群、电荷耦合器件成像清晰度。这些特性助于开发门控策略表征EVs与摄取，高通量视觉确认，作为准确可量化EV摄取平台。

本研究利用表达CD63-eGFP的HEK293T细胞作为供体细胞系产生EVs，因其在治疗开发中常用。分离荧光EVs与受体细胞系（神经、内皮细胞）共培养。用IFC量化摄取，建立标准化平台测量体外细胞系重要动力学EV摄取内化特征。进一步提供量化不同条件和培养细胞系荧光EV摄取过程，阐明选择性EV摄取。

材料与方法

细胞培养

人胚肾细胞（HEK293T）购自ATCC，培养于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的DMEM中。人神经干细胞（hNSC）、SH-SY5Y神经细胞、C3A肝上皮细胞、人脐静脉内皮细胞（HUVEC）、神经元均在标准条件37°C、5% CO₂下培养，随后进行EV摄取实验。

EV标记与分离

CD63-eGFP质粒DNA购自Addgene (#62964)。CD63-pEGFP C2为Paul Luzio赠予（Addgene质粒#62964）。HEK293T细胞培养至10 cm培养皿70%融合度，用Lipofectamine 2000按说明转染10 μg质粒DNA。转染24小时后更换无胎牛血清标准HEK293T培养基，连续收集3天。如前所述，HEK293T培养基经0.22 μm滤膜过滤，用100 kDa再生纤维素Amicon离心超滤装置超滤富集，PBS++洗涤两次。浓缩至1 mL，按厂家协议用Nanosight NS300测量浓度与粒径分布（Malvern, UK）。EVs从不同HEK293T培养容器分离，每容器视为独立生物学重复，每生物学重复内三技术重复（每条件至少九个样本）。

摄取实验

受体细胞系6孔板以60%融合度接种24小时，标准条件37°C。共培养前更换无胎牛血清（FBS⁻）培养基。绿色荧光蛋白（GFP）标记EVs按不同剂量时间点加入细胞。共培养后，细胞用5%胰蛋白酶重悬，浓缩至约百万细胞/50 μL用于流式细胞术。37°C为实验标准温度，因其为细胞培养和体外EV摄取平台标准。

抑制实验

低温实验

EVs与受体细胞在4°C共培养，有效“暂停”细胞生长抑制主动过程。4°C抑制所有主动形式EV摄取。

固定实验

受体细胞4%多聚甲醛冰上固定30分钟，PBS洗涤后立即与EVs共培养，抑制所有主动形式EV摄取。

ImageStreamX采集

在ImageStreamX Mark II成像流式细胞仪（Luminex Corporation, Seattle, Washington）上用INSPIRE软件采集。每样本获取至少5000-10,000细胞事件。每生物学样本三技术重复孔单独采集。明场图像收集于通道1，侧向散射（785 nm）通道6。GFP经488 nm氩离子激光200 mW激发，荧光收集于通道2（480-560 nm）。所有样本用60×放大率，低采集速率以高灵敏度。

IDEAS分析

数据与图像分析用IDEAS软件（Luminex）。门控策略：

1. 聚焦门：用梯度RMS值消除非聚焦视野细胞。
2. 聚焦细胞门：用明场面积vs明场长宽比消除双细胞与碎片。门控数据建立直方图生成统计参考，测量荧光强度（图像所有像素和）、最大像素强度（图像最亮像素强度）、斑点计数值（内部算法）。斑点计数特征用适用IDEAS向导生成。斑点计数、平均强度、最大像素比按公式（有EVs输出值/无EVs输出值）计算。

统计分析

所有定量数据用GraphPad Prism 8.1.2分析，三重复实验。数据呈均值±标准误（SEM）。统计学显著性用非配对T检验或单因素方差分析（ANOVA）配合Tukey或Dunnett事后多重比较（与对照比较）。p < 0.05视为显著。

结果

CD63-eGFP标记HEK293T细胞外囊泡特性

为产生荧光标记EVs分析动力学与摄取，HEK293T细胞转染携带CD63-eGFP融合蛋白质粒。CD63是富集于外泌体膜的四次跨膜蛋白，是EV荧光标记最佳靶点。收集HEK293T培养上清，按前文分离EVs。比较CD63-eGFP转染HEK293T EVs与非转染HEK293T EVs粒径分布。对照和转染EVs平均中位直径分别为110.28 nm和103.616 nm（纳米追踪软件测量），与报道HEK293T EVs尺寸一致。中位直径（p=0.1615）和分布（p=0.4225）无显著差异。eGFP标记未改变HEK293T EVs大小（图1b）。

IFC实验确定CD63-eGFP是否与EVs结合。荧光阴性对照：缓冲液中1.34 μM微球（图1c顶）经488 nm激发无荧光，但明场（BF）和侧向散射（SSC）可见。未标记HEK293T EVs在BF、GFP、SSC均阴性，提示尺寸小于BF阈值且无荧光（图1c中）。BF无信号指示EV尺寸<300 nm，暗示EV集群极少。最后，CD63-eGFP标记EVs在BF阴性、GFP通道阳性，标志HEK293T EVs荧光阳性（图1c底）。GFP通道阳性信号可能指示单个EV或荧光EV群体。综上，分离HEK293T EVs具标准尺寸和蛋白标志物谱，符合既往HEK293T外泌体报道，eGFP标记未改变EV大小。

用商业化流式细胞术法测定常见EV标志物，确定整体EV四次跨膜蛋白谱。对照和CD63-eGFP表达HEK293T分离EVs对标准EV标志物CD9、CD63、CD81阳性（相对荧光单位，图1d）。如前报道，CD29也存在于HEK293T EVs和CD63-eGFP转染HEK293T EVs表面。结果表明HEK293T EV分离标记方法产生具有常见HEK293T外泌体标志物的EVs。

HEK293T EVs主动摄取

进行两种抑制内化实验。HEK293T EVs与受体细胞4°C（低温）共培养，或受体细胞经多聚甲醛固定（固定）后共培养。处理组较生理条件（37°C）共培养组eGFP标记EVs在受体细胞中存在量降低（图2a）。低温和固定抑制实验显著降低受体细胞荧光信号斑点计数（低温：p=0.0127，固定：p=0.0078）、强度（低温：p=0.0105，固定：p=0.0374）、最大像素（低温：p=0.0159，固定：p=0.0149），表明抑制EV摄取。推断eGFP定位和输出参数增加标志HEK293T EVs内化，后续摄取实验基于此。

HEK293T EV剂量依赖性摄取

为建立IFC平台标准剂量曲线，HEK293T EVs与HEK293T受体细胞在37°C下按0-20,000 EVs/细胞递增剂量共培养。代表性IFC图像显随EV剂量升高eGFP荧光视觉增加（图3a）。最低可检测EV数为6000 EVs/共培养HEK293T细胞。此水平斑点计数（p=0.0012）、强度（p=0.0075）、最大像素（p=0.0005）显著高于无EV细胞（图3b-d）。因此6000 HEK293T EVs/细胞为实验条件下摄取低阈值。同理，10,000和20,000 EVs斑点计数（10,000：p=0.0009；20,000：p<0.0001）、强度（10,000：p<0.0001；20,000：p<0.0001）、最大像素（10,000：p<0.0001；20,000：p<0.0001）均显著高于无EV细胞。高剂量组间比较：6000 vs 10,000斑点计数（p=0.999）、强度（p=0.8482）、最大像素（p=0.6056）无显著差异；10,000 vs 20,000斑点计数（p=0.0927）、强度（p=0.999）、最大像素（p=0.5281）无显著差异。6000 vs 20,000斑点计数（p=0.0787）、强度（p=0.8083）无显著差异，但最大像素有显著差异（p=0.0140）。总体产率曲线所有参数（斑点、强度、最大像素，p<0.0001）显著剂量依赖。表明HEK293T EV摄取剂量依赖，最小阈值6000 EVs/细胞。

HEK293T EV时间依赖性摄取

用6000 EVs/细胞，HEK293T EVs与HEK293T细胞共培养不同时间（5分钟至24小时）后IFC分析。EV暴露长度关键影响受体细胞可见荧光量，12小时后下降（图4a）。初始30分钟共培养斑点计数显著增加（p=0.0081）提示EV摄取趋势，但强度（p=0.3073）、最大像素（p=0.0952）无显著性（图4b-d）。2小时共培养斑点计数（p=0.0028）、强度（p=0.0420）、最大像素（p=0.0006）显著高于无EV对照。4小时共培养所有参数均大于对照（斑点计数：p=0.0003，强度：p<0.0001，最大像素：p<0.0001）。强度和最大像素在4、12、24小时持续高于对照。4小时与12小时共培养无参数差异（斑点：p=0.999，强度：p=0.5797，最大像素：p=0.2489）。但12小时至24小时强度（p=0.0191）、最大像素（p=0.0027）下降（图4c,d）。类似剂量曲线，HEK293T EV摄取时间依赖，4小时孵育持续摄取，12小时峰值。综上，标准化后续摄取实验：6000 EVs/细胞播种剂量，4小时共培养。

多细胞系HEK293T EV摄取比较

检验EV摄取为选择性过程假设：EVs优先被亲本同源细胞摄取。用IFC测试：HEK293T EVs与HEK293T细胞或其他细胞系共培养：上皮（C3A肝细胞）、内皮（HUVEC）、神经（SH-SY5Y胶质母细胞瘤细胞）。HEK293T细胞eGFP荧光丰度高于其他细胞类型（图5a）。与C3A和HUVEC比，HEK293T细胞共培养HEK293T EVs荧光强度显著更高（C3A：p=0.0321；HUVEC：p=0.0055）（图5c）。此外HEK293T细胞最大像素显著高于所有其他受体细胞系（C3A：p=0.0221；HUVEC：p=0.0079；SH-SY5Y：p=0.0486）（图5d）。强度方面，SH-SY5Y细胞共培养HEK293T EVs显著高于HUVEC（p=0.0304）。结果支持体外HEK293T EVs对HEK293T细胞选择性摄取优于其他细胞系。

神经细胞分化状态与HEK293T EV内化

鉴于EVs涉及神经疾病治疗递送，用人神经干细胞（hNSCs）和成熟人神经元作为受体细胞系，检验受体细胞分化状态是否影响EV选择性摄取。IFC代表性图像显两种细胞类型均有摄取视觉证据，但hNSCs中eGFP定位最多（图6a）。hNSCs共培养HEK293T EVs斑点计数（p=0.0082）和最大像素（p=0.0083）显著高于成熟神经元。结果提示神经细胞分化状态影响HEK293T EV摄取。

讨论

EV体外摄取标准化流程

国际EV专家组强调需有效确定EV摄取实验最小有效剂量，本研究开发可被领域有效采用的系统。分析EV摄取面临挑战：如我们和他人观察到，改变EV剂量和暴露时间结果会不同。我们将HEK293T EV剂量和浓度作为动力学变量处理。体外最小有效剂量可更一致预测EVs体内生物分布，用于开发更一致体内给药参数用于EV疗法递送。小鼠EV体内生物分布研究中，增加HEK293T EVs剂量导致器官相对EV分布转移。类似既往膀胱癌EVs体外研究，HEK293T EVs显示强剂量依赖，本研究最小有效剂量6000 EVs。我们首创用单位细胞颗粒数作灵敏剂量度量，更好关联单位体重颗粒数体内模型。数据显示6000 EVs后剂量饱和极限，潜在指导未来体内剂量范围研究：高剂量可能效益有限。

测量EV摄取另一混杂变量是潜在时间效应。本系统发现强时间依赖，2小时早期摄取，12-24小时潜在下降。类似发现：膀胱癌细胞、肿瘤细胞等研究报道时间依赖，摄取早至15分钟至24小时。HEK293T EVs 24小时共培养较低值可能因细胞分裂或早期内化EVs再循环/降解。因EVs被内化后分解或释放，长孵育可能产生不准确内化读数。本研究首创用IFC提供HEK293T EV摄取时间依赖产率曲线视觉定量证据。

ISEV立场文件建议EV标记选择可能影响摄取，需采用少干扰技术如本研究GFP标记法。调查显示72%研究者称脂质染料实验不可靠除非用适当对照。EV染料不稳定关联小EV含量甚至增加囊泡大小。错误标记脂蛋白、蛋白质污染、染料聚集导致假阳性。因此我们融合CD63与eGFP标记HEK293T EVs。类似其他蛋白标记报道，HEK293T EVs GFP阳性，直径无观察差异，保持标准EV表面蛋白组成。尽管如此，需注意用特定EV蛋白标记可能限制追踪仅表达相应标记的EV亚型。其他潜在限制：荧光强度依赖蛋白表达水平、EV膜标记效率、光源激发强度。但IFC灵敏，在100 nm范围准确可视化检测低荧光强度CD63-GFP颗粒。

选择性摄取

EVs展示蛋白及其他信号可能赋予选择性摄取。EV生物生成首步为质膜内陷，EV膜含与供体细胞膜相似蛋白、受体、粘附分子、整合素。供体细胞调控的EV膜脂质组成和四次跨膜蛋白可能贡献EV与受体细胞趋向性。MSC EVs选择性转运内容物入MSCs，尽管更接近单核细胞。相反，也有报道天然EVs被任何细胞类型等量摄取，无论EV来源，利用成像或功能敲低实验。用IFC平台我们发现HEK293T EVs被HEK293T细胞摄取量大于其他报道细胞系，提示固有EV摄取特异性。通过此结果和IFC通用性，可适当选择分析EV来源靶向特定受体细胞。据我们所知，这是首个利用成像流式细胞术分析HEK293T EVs特异性研究。

除自身选择性，受体细胞分化状态被假设影响EV摄取。我团队及他人显示EVs中枢神经系统治疗效应，已知调节神经发育和成年细胞功能。本研究首次发现神经元分化状态影响EV摄取：人神经干细胞摄取HEK293T EVs显著多于成熟神经元。未成熟hNSCs比静止成熟神经元更主动内化外源EVs。因hNSCs培养中高增殖，可能非特异性内化营养物和EVs。类似未成熟树突状细胞内化EVs水平高于成熟树突状细胞。但髓系前体细胞研究发现成熟树突状细胞和巨噬细胞内化EVs多于未成熟树突状细胞和单核细胞，差异归因于进一步分化髓系细胞吞噬活性。基于体外证据支持选择性摄取，HEK293T EVs未来可用于调节未分化神经元治疗应用。

结论

总之，我们进一步开发了量化HEK293T EV摄取动力学的定量高通量平台。该平台可扩展至其他供体EVs、受体细胞类型、脂质体和合成纳米颗粒递送载体实验。重要的是，我们发现HEK293T EV摄取为选择性过程，对HEK293T细胞具有特异性。此处开发IFC实验可更好定义体内剂量递增和生物分布研究参数，为预测EV摄取体内结果模型提供关键信息。