使用流式细胞术检测 HEK293T 细胞外囊泡摄取的动力学和特异性

介绍

由于天然和工程细胞外囊泡 (EV) 的治疗和诊断效用，细胞外囊泡研究是一个新兴领域。 EV 的直径范围从 50 到 1000 nm，由所有细胞类型产生，并且富含跨膜蛋白，包括 CD63、CD81 和 CD9；脂质;蛋白质；和 DNA、RNA、mRNA 和 microRNA [1,2,3,4,5]。 EV 含量，尤其是活性 mRNA 和 miRNA，已经通过靶细胞的从头翻译和翻译后调节来调节受体细胞 [4, 6]。了解并修改动力学 EV 摄取和内化最终将导致 EV 内容物以足够高的浓度优化递送至靶细胞以产生治疗益处。

曾经被认为是“细胞垃圾”，EVs 已被用作细胞疗法的替代品，因为它具有许多优点，包括其生物相容性、低免疫原性和毒性、重复给药的能力、多种给药途径以及递送药物的潜力和基因疗法[3]。我们小组之前曾报道过神经干细胞衍生的 EVs 在中风和创伤性脑损伤中的积极作用。在鼠和猪中风模型中，EV 改善了中风后的组织和功能恢复 [3, 7, 8]。我们还表明 EV 在啮齿动物创伤性脑损伤模型中具有神经保护作用和功能益处 [9]。尽管有这些观察到的效果和 EV 的未来潜力，但对 EV 摄取特异性和动力学知之甚少，这可能会阻碍 EV 疗法转化为临床。

EV 也被设计为转移载体，并装有治疗剂，包括基因疗法和化合物，作为纳米颗粒疗法和递送载体的替代品 [4, 10,11,12]。 HEK293T 细胞因其固有的快速增殖、高 EV 产量和易于基因操作而被广泛用作 EV 生产细胞 [13,14,15,16,17]。 HEK293T EVs 提供基因疗法，包括用于乳腺癌的 miRNA 疗法 [12]，并已用于在神经鞘瘤模型中提供化学疗法和治疗性蛋白质构建体 [18]。与体外评估细胞毒性的合成纳米颗粒研究类似，MTT 毒性试验显示卸载的 HEK293T EV 的毒性较低，随后在加载化疗药物时具有较高的细胞毒性 [10, 18,19,20,21]。由于HEK293T EVs的大量利用，我们在本研究中分析了它们的动力学和特异性。

选择性或特异性摄取是指 EV 靶向特定细胞类型的天然能力。关于 EV 内化机制的大量证据，对摄取特异性几乎没有共识 [22]。通常 EV 表现出与其亲本细胞相似的受体细胞的选择性摄取，上皮细胞比其他受体细胞内化更多的上皮衍生 EV [23, 24]，而间充质干细胞 (MSC) 内化更多的 MSC 衍生 EV与其他细胞系体外[24]。然而，其他研究发现 EV 被所有细胞类型内化，并且在体内给药时表现出非选择性的生物分布 [22, 25]。尽管 EV 具有巨大的治疗潜力和兴趣，但对 EV 摄取特异性的理解仍存在不足。通过更好地理解EV摄取特异性，我们可以适当地选择被感兴趣的受体细胞选择性内化的EV生产细胞，从而提高EV的治疗适用性。

EV 摄取结果相互矛盾的一个潜在原因是测量平台缺乏标准化，包括剂量和时间效应的分析。最近，国际细胞外囊泡学会 (ISEV) 专家组发布了一份立场文件，强调需要分析剂量和时间，以及其他影响 EV 摄取的混杂因素 [26]。该小组表示，“一个剂量并不适合所有情况”，该剂量可能会影响 EV 摄取或选择性 [26]。增加 HEK293T EV 的剂量会改变体内的生物分布模式 [27]。血清来源的 EVs 的吸收曲线因剂量而显着改变 [28]。此外，EV 与受体细胞的共孵育时间范围为 15 min 到 48 h [24, 29,30,31,32,33] 可能会改变摄取测量。如果被 EV 研究人员和行业采用，确定标准剂量和时间曲线以帮助确定最小有效剂量的可量化且可靠的过程可能会导致更可靠和有用的研究。

以前，研究人员使用标准流式细胞术以及包括共聚焦显微镜在内的各种形式的低通量显微镜来分析 EV 摄取 [32,33,34]。然而，这些技术有几个限制。共聚焦显微镜既费时又主观。传统流式细胞仪设计用于测量细胞范围内的生物颗粒，无法区分 EV 群或巧合，并且由于触发而增加了噪音 [35,36,37,38]。正如 ISEV 小组所提到的，人们越来越意识到传统流式细胞术的物理局限性，并强调了对检测限在 100 nm 范围内的专业流式细胞术的需求 [26, 38]。成像流式细胞术 (IFC) 将流式细胞术的高通量定量特性与荧光成像技术相结合，该技术可以分辨直径低至 100 nm 的固有小荧光颗粒 [38]。 IFC 功能可实现低噪声/背景、减少集群和带电耦合设备以提高图像清晰度 [37, 39]。这些特征有助于开发一种门控策略，以高通量方式通过视觉确认表征 EV 和摄取，作为准确和可量化的 EV 摄取平台 [36, 37, 40]。

在这项研究中，表达 CD63-eGFP 的 HEK293T 细胞由于它们在治疗开发中的常见用途而被用作 EV 生产的供体细胞系。分离出的荧光 EV 与受体细胞系（包括神经细胞和内皮细胞）共培养。使用 IFC 对摄取进行量化，从而形成一个标准化平台来测量体外细胞系统的重要动力学 EV 摄取和内化特征。此外，我们提供了量化不同条件和培养细胞系中荧光 EV 摄取的过程的数据，以阐明选择性 EV 摄取。

材料和方法

细胞培养

人胚肾细胞（HEK293T）购自ATCC，在含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM中培养。人神经干细胞 (hNSC)、SH-SY5Y 神经细胞、C3A 肝上皮细胞、人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) 和神经元均在标准条件下于 37 °C、5% CO2 条件下培养，然后进行细胞外囊泡摄取分析.

EV 标记和隔离

CD63-eGFP 质粒 DNA 来自 Addgene (#62964)。 CD63-pEGFP C2 是 Paul Luzio 的礼物（Addgene 质粒 #62964）。 HEK293T 细胞在 10 cm 培养皿中培养至 70% 汇合，并根据制造商的说明使用 Lipofectamine 2000 转染 10 μg 质粒 DNA。转染后 24 小时，将培养基更换为不含胎牛血清的标准 HEK293T 培养基并连续收集 3 天。如前所述 [3]，HEK293T 培养基通过 0.22-μm 过滤器过滤，并使用 100-kDa 再生纤维素 Amicon 离心过滤装置通过超滤富集，并用 PBS++ 洗涤两次。 EV 浓缩至 1 mL，并根据制造商的协议（英国马尔文）在 Nanosight NS300 上测量浓度和尺寸分布。 EVs 是从不同的 HEK293T 培养容器中分离出来的，每个容器被认为是单独的生物重复，每个生物重复内有 3 个技术重复（每个条件下至少有 9 个样本）。

摄取分析

在标准培养条件下，在 37 °C 下，将受体细胞系以 60% 汇合度接种在 6 孔板中 24 小时。在细胞外囊泡共培养之前，将标准培养基改为无胎牛血清 (FBS-) 培养基。以不同剂量和时间点将绿色荧光蛋白 (GFP) 标记的 EV 施用于细胞。共培养后，将细胞重悬于 5% 胰蛋白酶中并浓缩至每 50 μL 约 100 万个细胞用于流式细胞术。 37 摄氏度是我们检测中 EV 摄取实验的标准，因为它一直是用于细胞培养和体外 EV 摄取平台的标准 [31, 41,42,43,44]。

抑制试验

冷测定

EV 与受体细胞在 4 °C 下共培养，以有效地“暂停”细胞培养物的生长并抑制活性过程 [45]。 4 摄氏度抑制所有活性形式的 EV 摄取 [31, 41,42,43,44]。

固定检测

受体细胞在冰上固定在 4% 多聚甲醛中 30 min，并在与 EV 共培养前立即用 PBS 洗涤，以抑制所有活性形式的 EV 摄取。

ImageStreamX 获取

使用 INSPIRE 软件在 ImageStreamX Mark II 成像流式细胞仪（Luminex Corporation，Seattle，Washington）上进行采集。至少获得了 5000–10,000 个细胞事件。每个生物样品在三个技术重复孔中复制，并在 ISx 上单独采集。在通道 1 上收集明场图像，在通道 6 上收集侧向散射 (785 nm)。绿色荧光蛋白 (GFP) 被 488 nm 氩激光以 200 mW 激发，并在通道 2 (480-560 nm) 上收集荧光。每个样品放大倍数为60倍，采集率低，灵敏度高。

IDEAS 分析

使用IDEAS软件（Luminex）进行数据和图像分析。门控策略如下：

1. 1.

   使用梯度RMS值确定聚焦门以消除不在聚焦范围内的细胞。

2. 2.

   使用面积明场与纵横比明场对聚焦的细胞进行门控以消除双峰和碎片。门控数据用于创建直方图并生成统计参考，测量荧光强度（图像中所有像素的总和）、最大像素强度（图像中最亮像素的强度）以及通过每个样本的内部算法的斑点计数值。点计数特征是使用适用的 IDEAS 向导生成的。点数、平均强度和最大像素比由公式（含EVs的输出值/不含EVs的输出值）计算。

统计数据

所有定量数据均通过 GraphPad Prism 8.1.2（圣地亚哥，加利福尼亚）进行分析，一式三份。数据表示为平均值 ± 平均值的标准误差（SEM）。使用未配对的 T 确定统计显着性 检验或单因素方差分析 (ANOVA) 与 Tukey 或 Dunnett 的多重比较事后与对照进行比较。 p <0.05 被认为是显着的。

结果

CD63-eGFP–标记的 HEK293T 细胞外囊泡特性

为了生成荧光标记的 EV，用于分析细胞外囊泡的动力学和摄取，用携带 CD63-eGFP 融合蛋白的质粒转染 HEK293T 细胞。 CD63 是一种四跨膜蛋白，通常富含外泌体的膜，使其成为 EV 荧光标记的最佳靶点 [46, 47]。从 HEK293T 细胞培养物中收集用过的培养基，并如先前报道的那样分离 EV [8]。我们比较了从 CD63-eGFP 转染的 HEK293T 细胞与未转染的 HEK293T 细胞中分离的 EV 的大小和分布。对照和 CD63-eGFP 转染的 HEK293T EVs 的平均中值直径分别为 110.28 nm 和 103.616 nm，由纳米跟踪软件测量（图 1a），这与报道的 HEK293T EVs 的大小一致 [13, 15, 27 , 48]。中值直径无显着差异 (p =0.1615) 和分布 (p =0.4225) 从未转染和 CD63-eGFP 转染的 HEK293T 细胞中分离的 EV。 eGFP 标记没有改变 HEK293T EVs 的大小（图 1b）。

用 CD63-eGFP 标记的 HEK293T EV 的表征。从表达 CD63-eGFP 细胞培养基的 HEK293T（对照）和 HEK293T 中分离出 EV。 一 通过纳米跟踪软件记录的代表性 EV 尺寸分布。 b 量化转染与非转染 HEK293T EV 的平均直径分布。 c 阴性对照珠、HEK293T 对照 EV 和 CD63-eGFP 标记的 EV 的 IFC 图像。 BF 表示明场，GFP 表示绿色荧光蛋白（488 nm 激发激光），SSC 表示侧向散射。 GFP 通道中的正 eGFP 表示荧光 HEK293T EV。 d 未转染的 HEK293T EV 和 HEK293T CD63-eGFP EV 的基于流式细胞术的 MACSPlex 表面标记表达。两个 EV 源的 CD29、CD9、CD63 和 CD81 均呈阳性，如以相对荧光测量（用 X 表示阳性）。条形代表平均值 ± SEM； N =3;未配对 T 检验。不详表示 p> 0.05

进行 IFC 测定以确定 CD63-eGFP 是否与 EV 相关。作为荧光阴性对照，缓冲溶液中的 1.34 μM 珠子（图 1c，顶部）在暴露于 488 nm 激发波长时缺乏荧光，但在明场 (BF) 和侧向散射 (SSC) 中可见。未标记的 HEK293T EV 在 BF、GFP 和 SSC 中呈阴性，表明其体积小，低于 BF 阈值且缺乏荧光（图 1d，中间）。 BF 中的缺失意味着 EV 尺寸小于 300 nm，这表明 EV 的聚集最小。最后，CD63-eGFP 标记的 EV 在 BF 中为阴性，在 GFP 通道中为阳性，表示 HEK293T EV 的阳性荧光（图 1c，底部）。 GFP 通道中的阳性信号可能表示单个 EV 或一组荧光 EV。总的来说，这些结果表明分离的 HEK293T EVs 具有标准的大小和蛋白质标记谱，与之前关于 HEK293T 外泌体的报道一致，并且 eGFP 标记不会改变 HEK293T EVs 的大小 [5, 27]。

使用市售的基于流式细胞术的方法来测量常见的 EV 标记物，我们确定了整体 EV 四跨膜蛋白谱 [5]。从对照和表达 CD63-eGFP 的 HEK293T 细胞中分离出的 HEK293T EV 对标准 EV 标记物呈阳性，包括 CD9、CD63 和 CD81，如以相对荧光单位测量的（图 1d）。正如之前报道的那样，在 HEK293T EV 和 CD63-eGFP 转染的 HEK293T EV 的表面也发现了 CD29 [5]。这些结果表明HEK293T EV的分离和标记方法导致EV具有常见的HEK293T外泌体标记。

HEK293T EV 的积极使用

进行了两种抑制性内化测定。 HEK293T EVs 与受体细胞在 4 °C（冷）或与先前用多聚甲醛固定的受体细胞（固定）共培养。与在生理条件下与 EV 共培养的受体细胞相比，这些处理减少了受体细胞中 eGFP 标记的 EV 的存在（图 2a）。冷和固定抑制试验减少了斑点计数（冷：p =0.0127，固定：p =0.0078)，强度（冷：p =0.0105，固定：p =0.0374)，以及最大像素（冷：p =0.0159，固定：p =0.0149) 的受体细胞中未经处理的荧光信号，表明 EV 摄取受到抑制。这些结果推断 eGFP 定位和输出参数的增加表明 HEK293T EVs 被内化用于以下摄取测定。

EV 内化抑制试验。 HEK293T 细胞在各种条件下与 HEK293T EV 共培养。对照 (37 °C) 是指在生理学 37 °C 环境中共培养。冷是指在 4 °C 的环境中共培养。固定抑制是指在共培养之前将受体细胞固定为 PFA 的测定。 一 受体细胞的代表性 IFC 图像。第 1 列 BF 表示明场。第 2 列，GFP，表示绿色荧光蛋白（488 nm 激发激光），第 3 列表示 BF 和 GFP 的合并。对照显示代表 EV 内化的阳性 GFP。 b –d 通过斑点计数、平均荧光强度和最大像素对与对照相比的抑制测定进行量化。条形代表平均值 ± SEM； N =3;与对照相比，单向方差分析与 Tukey 事后检验相比较。 *p <0.05； ***p <0.01

剂量相关的 HEK293T EV 吸收

为了开发 IFC 平台的标准剂量曲线，HEK293T EVs 与 HEK293T 受体细胞在 37 °C 下以每个细胞 0 到 20,000 个 EVs 的递增剂量共培养。具有代表性的 IFC 图像显示出 eGFP 荧光随着 EV 剂量增加而在视觉上增加（图 3a）。每个共培养的 HEK293T 细胞可检测到的最低 EV 数量为 6000 个。在此级别，点数 (p =0.0012), 强度 (p =0.0075) 和最大像素 (p =0.0005) 测量值显着高于没有 EV 的受体细胞（图 3b-d）。因此，在我们的实验条件下，6000 HEK293T EV 的剂量是摄取的低阈值。同样，10,000 和 20,000 EV 的剂量具有更高的斑点数（10,000：p =0.0009； 20,000：p <0.0001), 强度 (10,000:p <0.0001； 20,000：p <0.0001) 和最大像素 (10,000:p <0.0001； 20,000：p <0.0001) 与没有 EV 的细胞相比。在较高剂量之间进行比较，斑点计数没有显着差异（6000 对 10,000：p =0.999，10,000 对 20,000：p =0.0927)，强度（6000 vs. 10,000：p =0.8482，10,000 对 20,000：p =0.999)，以及最大像素数（6000 对 10,000：p =0.6056，10,000 对 20,000：p =0.5281) 介于 6000 和 10,000 之间，以及 10,000 对 20,000。同样，在 6000 和 20,000 之间进行比较，点数也没有统计差异 (p =0.0787) 和强度 (p =0.8083)。最大像素在 6000 和 20,000 之间存在显着差异 (p =0.0140)。总体而言，产量曲线在所有参数（点、强度、最大像素、p <0.0001)。这些结果表明，HEK293T EV 的摄取是剂量依赖性的，每个细胞的最低阈值为 6000 HEK293T EV。

HEK293T EV 吸收具有剂量效应，最低阈值为 6000 EV。 HEK293T 细胞与 HEK293T EVS 以从 0 到 20,000/细胞递增的剂量共培养。 一 具有各自 EV 剂量的受体细胞的代表性 IFC 图像。 GFP 定位表示 HEK293T EV 的吸收。 b –d 通过斑点计数、平均荧光强度和最大像素比对与对照组和每组相比的剂量测定进行量化。条形代表平均值 ± SEM； N =3;单向方差分析之后是 Tukey 的事后检验。 *p <0.05； ***p <0.01

HEK293T EV 时间吸收

每个细胞使用 6000 EVs，HEK293T EVs 与 HEK293T 细胞共培养，在 IFC 之前增加时间长度，范围从 5 min 到 24 h。 EV 暴露的时间在受体细胞中可见荧光的数量中起着关键作用，在 12 h 后下降（图 4a）。最初，共培养 30 分钟显示斑点计数显着增加 (p =0.0081) 表明 EV 吸收的可能趋势，但在其他吸收参数中没有（强度：p =0.3073，最大像素：p =0.0952）（图 4b-d）。在共培养 2 h 时，斑点计数显着增加 (p =0.0028), 强度 (p =0.0420) 和最大像素 (p =0.0006) 与没有 EV 的受体细胞相比。同样，在共培养 4 h 时，所有参数都大于对照（点数：p =0.0003，强度：p <0.0001，最大像素：p <0.0001)。在共培养 4、12 和 24 h 时，强度和最大像素继续高于对照。共培养 4 和 12 h 之间的任何摄取参数没有差异（点：p =0.999，强度：p =0.5797；最大像素：p =0.2489）。然而，强度 (p =0.0191) 和最大像素 (p =0. 0027) 在共培养的 12 和 24 h 之间下降（图 4c、d）。与剂量曲线类似，HEK293T EV 摄取是时间依赖性的，在孵育 4 h 时具有一致的 EV 摄取，并在 12 h 达到峰值。总的来说，每个细胞接种 6000 EVs 的剂量和 4 h 的共培养已被标准化用于以下摄取测定。

HEK293T EV 的吸收与时间有关。 HEK293T 细胞与 6000 HEK293T EVs/细胞共培养以增加时间长度。 一 分别代表受体细胞的 IFC 图像。 GFP 定位意味着 HEK293T EV 吸收增加。 b –d 通过斑点计数、平均荧光强度和最大像素比对与对照组和每组进行比较的时间过程分析进行量化。条形代表平均值 ± SEM； N =3;单向方差分析之后是 Tukey 的事后检验。 *p <0.05； ***p <0.01

多种细胞系对 HEK293T EV 的比较摄取

EV 摄取是一个选择性过程，其中 EV 优先被自身来源的细胞摄取的假设已使用 IFC 进行了测试。 HEK293T EVs 与 HEK293T 细胞或其他细胞系共培养：上皮细胞（C3A 肝细胞）、内皮细胞（人脐静脉内皮细胞）和神经细胞（SH-SY5Y 胶质母细胞瘤细胞）。与其他细胞类型相比，HEK293T 细胞中的 eGFP 荧光更丰富（图 5a）。与 C3A 和 HUVECs 相比，HEK293T 细胞具有显着更高的荧光强度（C3A：p =0.0321； HUVEC：p =0.0055)（图 5c），当与 HEK293T EV 共培养时。此外，HEK293T 细胞具有更高的最大像素（C3A：p =0.0221； HUVEC：p =0.0079； SH-SY5Y：p =0.0486)（图 5d）与所有其他受体细胞系（图 5b）相比。关于强度，当与 HEK293T EVs 共培养时，SH-SY5Y 细胞显着高于 HUVECs (p =0.0304)。这些结果支持HEK293T细胞与体外其他细胞系相比选择性摄取HEK293T EV。

HEK293T EV 显示出对 HEK293T 细胞的摄取偏好。 HEK293T EVs 与 HEK293T 细胞、C3A 上皮细胞、人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) 和 SY5Y 神经细胞共培养。 一 与 HEK293T EV 共培养的受体细胞的代表性 IFC 图像。 b –d 通过斑点计数、平均荧光强度和最大像素比对 EV 摄取偏好测定与对照和彼此进行比较的量化。条形代表平均值 ± SEM； N =3;单向方差分析之后是 Tukey 的事后检验。 *p <0.05； ***p <0.01

神经细胞分化状态和HEK293T EV内化

由于 EV 已被用于针对神经疾病的治疗和递送目的，因此人类神经干细胞 (hNSC) 和成熟的人类神经元被用作我们系统中的受体细胞系，以检查受体细胞的分化状态是否在选择性摄取中起作用电动汽车。来自 IFC 的代表性图像显示了两种细胞类型吸收的视觉证据，但在 hNSC 中具有最大的 eGFP 定位（图 6a）。与 HEK293T EV 共培养的 hNSCs 具有更高的斑点数 (p =0.0082) 和最大像素 (p =0.0083) 与成熟神经元相比。总之，这些结果表明神经细胞的分化状态影响HEK293T EVs的摄取。

神经分化状态影响 HEK293T EV 摄取。 HEK293T EVs 与成熟的人类神经元和人类神经干细胞共培养。 一 与 HEK293T EV 共培养的受体细胞的代表性 IFC 图像。 b –d 通过斑点计数、平均荧光强度和最大像素比对 EV 摄取偏好测定与对照和彼此进行比较的量化。条形代表平均值 ± SEM； N =3;未配对的 T 测试。 *p <0.05； ***p <0.01 与 0 EVs 相比（对照）

讨论

EV体外摄取标准化流程

一组国际电动汽车专家强调需要有效地确定用于摄取测定的电动汽车的最小有效剂量，在这里我们开发了一个可以被该领域有效采用的系统 [26]。分析电动汽车的吸收量时存在挑战。例如，正如我们和其他人所观察到的，如果 EV 剂量和暴露时间改变，结果可能会有所不同 [26]。我们将 HEK293T EV 剂量和浓度作为动力学变量。此外，体外最小有效剂量可以更一致地预测 EV 的体内生物分布，并用于为 EV 治疗和递送开发更一致的体内剂量参数。在体内小鼠 EV 生物分布研究中，增加 HEK293T EV 的剂量导致器官中相对 EV 分布的变化 [27]。与之前使用膀胱癌 EV 进行的体外研究中的发现类似 [39]，HEK293T EV 显示出强烈的剂量依赖性，在我们的研究中，6000 EV 的最小有效剂量为 6000。我们是第一个使用每细胞颗粒作为体外敏感剂量测量的公司，这与使用每体重颗粒的体内模型更好地相关联。我们的数据还表明 6000 次 EV 后的剂量饱和极限，通过表明更高剂量可能带来的益处有限，可能为未来的体内剂量范围研究提供信息。

测量 EV 吸收的另一个混杂变量是对 EV 吸收的潜在时间影响。在我们的系统中，我们发现早在 2 h 就具有很强的时间依赖性，并且在 12 到 24 h 之间可能会下降。与我们的发现类似，在少数使用膀胱癌细胞、肿瘤细胞和其他细胞的研究中报告了时间依赖性，这些细胞在 15 min 到 24 h 之间吸收 [29,30,31,32,33,39,43,49]。正如 HEK293T EVs 所见，共培养 24 h 的较低值可能是细胞分裂或早期时间点内化的 EVs 回收/降解的结果 [50]。具体来说，由于 EV 已被证明是内化然后分解或内化然后在 24 小时后释放，较长的孵育时间可能会产生不准确的内化读数 [31, 50]。我们的研究首次使用 IFC 为 HEK293T EV 吸收的时间依赖性收益率曲线提供视觉和定量证据。

正如 ISEV 立场文件所暗示的那样，EV 标签的选择可能会影响吸收，因此需要使用破坏性较小的技术，例如我们研究中使用的 GFP 标记方法。具体而言，72% 的参与调查的研究人员声称，除非使用适当的控制，否则脂质染料实验是不可靠的 [26]。 EV 染料与小 EV 含量不可靠相关，甚至可能增加囊泡大小。错误标记的脂蛋白和蛋白质含量以及染料聚集的污染导致了假阳性 [51, 52]。因此，我们将 CD63 与 eGFP 融合以标记 HEK293T EV。 Similar to other reports of protein tagging, HEK293T EVs were GFP positive with no observed differences in diameter and maintained standard EV surface protein composition [38, 46]. Despite this, it is important to note that labeling EVs with specific EV proteins may limit the tracking to only a few subtypes of EVs expressing the respective markers. Other potential limitations may be that the fluorescence intensity is dependent on protein expression level, the efficiency of EV membrane labeling, and excitation strength of the light source [53]. However, IFC is sensitive, detecting low fluorescence intensity with accurate visualization of CD63-GFP particles at the 100-nm range [38, 54].

Selective Uptake

EVs display proteins and other signals that may confer selective uptake [22, 23, 55]. Since the first step of EV biogenesis is the invagination of the plasma membrane, the EV membrane contains similar proteins, receptors, adhesion molecules, and integrins when compared with the donor cell membrane [22, 24, 55]. The lipid composition and tetraspanin proteins on EV membranes regulated by donor cells may contribute to EV tropisms with recipient cells [23, 34, 56]. MSC EVs selectively transported contents into MSCs, despite closer proximity to monocytes [24]. In contrast, others report that natural EVs were taken up equally by any cell type, regardless of EV origin [11, 22, 25, 57] when utilizing imaging or functional knockdown assays. Using the IFC platform, we found that HEK293T extracellular vesicles are taken up at greater quantities by HEK293T cells than other reported cell lines, thus suggesting an inherent EV uptake specificity. Through this outcome and the versatility of IFC, EV sources can be appropriately selected and analyzed for targeting specific recipient cells. To our knowledge, this is the first study utilizing imaging flow cytometry to analyze the specificity of HEK293T EVs.

In addition to self-selectivity, differentiation status of recipient cells has been hypothesized to play a role in uptake of EVs [32, 58, 59]. As our group and others have shown, EVs have therapeutic effects in the central nervous system and are known to modulate cell functions in neuronal development and adults [3, 7,8,9, 60]. Here for the first time, differentiation status of neurons affected EV uptake, where human neural stem cells had significantly greater uptake of HEK293T EVs compared to mature neurons. Immature hNSCs more actively internalize exogenous EVs than quiescent mature neurons. Since hNSCs are highly proliferative cells in culture, they may nonspecifically internalize nutrients and EVs. Similarly, immature dendritic cells internalized EVs at higher levels than mature dendritic cells [32, 59]. However, another study with myeloid precursor cells found that the mature dendritic cells and macrophages internalized more EVs than immature dendritic cells and monocytes [58]. The observed differences can be attributed to the phagocytic activity of further differentiated myeloid cells. Due to the in vitro evidence supporting selective uptake, HEK293T EVs can be used to modulate undifferentiated neurons in future therapeutic applications.

结论

In summary, we have further developed a quantitative and high-throughput platform for quantifying HEK293T EV uptake kinetics. This platform can be extended to other donor EVs and recipient cell types and assays for liposomes and synthetic nanoparticle delivery vectors. Significantly, we found that HEK293T EV uptake is a selective process, with specificity towards HEK293T cells. The IFC assays developed here can be used to better define parameters used in in vivo dose escalation and biodistribution studies and provide instrumental information for a predictive model of EV uptake outcomes in vivo.

数据和材料的可用性

The datasets generated and/or analyzed during the current study are available from the corresponding author on reasonable request.

缩写

EV:

Extracellular vesicles

HEK293T:

Human embryonic kidney cell line

IFC:

Imaging flow cytometry

hNSC:

Human neural stem cell

GFP：

Green fluorescent protein

BF：

Bright field

SSC:

Side scatter

ISEV:

International Society of Extracellular Vesicles