用于体内 CT 成像和肾脏清除特性的新型生物相容性 Au Nanostars@PEG 纳米颗粒

背景

过去十年见证了纳米粒子在纳米生物技术中的快速发展，因为它们的组成材料多样，表面积大[1, 2]。在这些纳米粒子中，Au以其优异的生物相容性和亲和力在生物医学领域有着广泛的应用[3, 4]。近年来，Au纳米粒子由于其原子序数较大、贵金属、化学惰性以及不易与体内蛋白质发生反应而被广泛应用于CT成像[5,6,7]。

CT 成像是一种无创的临床诊断工具，通过不同密度和厚度的 X 射线发生器对不同组织或器官的衰减程度不同，形成不同组织或器官分布的灰度图像对比度，从而对不同组织或器官的相对位置进行对比。病变和形状的大小发生变化 [8,9,10,11]。目前临床应用的CT造影剂主要是碘化合物，它是一种小分子化合物，包括有机碘和无机碘小分子化合物，如重氮酸盐（diatrizoic acid，DTA）和碘海醇（Omnipaque）[12]。但含碘化合物的小分子碘基造影剂去除作用仅需极短的显像时间，且肾毒性不低[13, 14]。在临床实践中，肾功能恶化是碘化放射性造影剂的一种并发症 [15]。因此，纳米材料的发展为解决这些问题提供了新的思路和方法。最近的研究也证实纳米颗粒CT对比剂可以有效延长成像时间，减弱肾脏毒性，并且比碘基对比剂具有更好的X射线衰减，如金纳米颗粒和纳米银颗粒用作CT造影剂已引起研究人员的注意[16,17,18]。树枝状大分子纳米平台不仅作为碘造影剂的修饰小分子，而且作为模板包和不同无机纳米粒子的稳定性，改善造影剂的血液循环时间，使其更好地用于CT成像[19]。

在本研究中，我们制备了 PEG 功能化的 Au 纳米星纳米粒子 (AuNS@PEG)；由于与相同尺寸的普通Au纳米颗粒相比具有更大的表面积，Au nanostar可以大大增强CT成像。用 PEG 功能化后，Au 纳米星纳米粒子可以提高其生物相容性和肾脏清除性能。使用各种方法，包括 TEM、EDX、XPS、MTT 和流式细胞术，确定 AuNS@PEG 纳米粒子的特性和生物相容性。此外，组织学分析和血液学研究已用于测试 AuNS@PEG 纳米粒子的体内毒性，结果证实了 AuNS@PEG 纳米粒子良好的生物相容性。此外，体外和体内 CT 成像实验也展示了 AuNS@PEG 纳米粒子优异的 CT 成像能力。所有这些结果表明，合成的造影剂 AuNS@PEG 纳米粒子作为一种潜在的候选者，可广泛用于 CT 成像，并具有良好的肾脏清除性能。

方法

包括任何相关细节在内的所有实验方案均经中国辽宁省锦州医科大学区域伦理委员会批准。

材料和仪器

除非另有说明，所有化学品均购自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) 并直接使用。

合成的纳米粒子通过透射电子显微镜 (TEM) 和能量色散 X 射线 (EDX) 分析使用 200 kV 加速电压 (Tecnai G2 Twin, FEI, Hillsboro, OR) 进行表征。 TEM 样品是通过在formvar/碳涂覆的铜网上干燥稀释的纳米颗粒溶液来制备的。通过将一滴稀释的胶体溶液沉积在碳网格上并让液体在室温下在空气中干燥来制备样品。 UV-vis 吸收光谱在 Shimadzu UV-2450 UV/Vis/NIR 分光光度计上记录。动态光散射 (DLS) 测量在 Malvern Zetasizer NANO ZS 上进行，温度为 25°C。

Au Nanostars/PEG (AuNS@PEG) 纳米粒子的合成

根据先前的报告 [20,21,22]，通过种子介导的生长方法合成了 Au 纳米星 (Au NS)，并稍作调整。通常，根据先前的报道[23]，通过 HAuCl4 的化学还原合成直径为 10 nm 的 Au 晶种； 6 毫升 HAuCl4 溶液 (w /v 1%) 加入 140 ml 超纯水中并在搅拌的同时加热至沸腾。然后，快速注入 0.75 ml 油胺，并将所得混合物再煮沸 2 小时。 Au胶体自然冷却至室温；将 60 ml 环己烷加入到胶体中，并将​​溶液磁力搅拌另外 1 h。随后，将 1.5 ml NaOH (4 M) 注入混合物中，同时剧烈搅拌另外 30 分钟。使混合物分层。通过加入乙醇沉淀包含在上层中的Au纳米种子。沉淀用乙醇和水交替纯化一次，然后分散在水中。

根据之前的工作，通过将 AgNO3（1 ml，3 mM）和抗坏血酸（500 μl，0.1 M）与 100 ml 含有 0.25 mM HAuCl4，1 mM 的溶液快速同时混合，合成直径约为 50 nm 的 Au 纳米星HCl 和 1.5 毫升金纳米球种子。然后，大量过量加入硫醇化聚乙二醇（PEG，6 kDa）聚合物以钝化纳米颗粒表面。将混合溶液连续搅拌 24 小时，然后通过 3 个离心/再分散在水中的循环收集获得的 AuNS@PEG 纳米粒子。形成的AuNS@PEG纳米颗粒再分散在水中备用。

细胞培养和 AuNS@PEG 纳米粒子暴露

从大鼠脊髓组织收集神经胶质细胞。将细胞在含有 10% 胎牛血清、100 U/ml 青霉素和 100 μg/ml 链霉素的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM) (Gibco，美国) 中培养，在 37°C 下在 5% CO2 的加湿培养箱中培养。将细胞接种在培养板中，然后在特定浓度（50、100、200、500 和 1000 ppm）下暴露于 AuNS@PEG 纳米粒子 2 小时。以不含AuNS@PEG纳米颗粒的DMEM为对照组。

动物和治疗

这项工作是严格按照美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南中的建议进行的。该协议经中国锦州医科大学动物实验伦理委员会批准（许可证号：LMU-2013-368）。雄性 Sprague Dawley 大鼠（180-200 g）购自锦州医科大学动物中心（许可证号：SCXK 2009-0004）。所有大鼠均在无特定病原体实验室的温控室 (25.0 ± 0.2 °C) 中喂养，光照时间为 12 小时/12 小时，光照/黑暗光照周期为 50%，湿度为 50%。大鼠自由进食和饮水。

选择人道的终点，通过安乐死来最小化或终止实验动物的疼痛或痛苦，包括吸入剂、非吸入剂和物理方法，而不是等待它们死亡作为终点。在这项工作中，将大鼠分为两组：（1）对照组：通过腹腔注射水合氯醛溶液（10wt%）麻醉大鼠，然后通过尾静脉注射 800 μL 磷酸盐缓冲盐水。 (2)实验：大鼠腹腔注射水合氯醛溶液(10wt%)麻醉，尾静脉注射AuNS@PEG纳米颗粒溶液800μL(200μg/ml)。在 H&E 研究中，大鼠在没有事先麻醉的情况下通过颈椎脱臼处死，并立即解剖它们的心脏、肝脏、肾脏、脾脏和肠道，储存在 - 80°C，并在干冰上的异戊烷中快速冷冻直至进一步已处理。

细胞活力测定

对数期神经胶质细胞以 1×10 ⁴ 接种在 96 孔板上 100 μl 细胞悬液中的每孔细胞数。将磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 添加到周围的孔中。将板在 37°C 和 5% CO 2 下孵育 24 小时以允许细胞粘附。然后将细胞分为四组：对照组细胞在含10%胎牛血清的DMEM中培养；在 AuNS@PEG 纳米颗粒组中，将 0、25、50、100、200、500 或 1000 ppm AuNS@PEG 纳米颗粒添加到培养基中； 24 小时后在倒置相差显微镜（Leica，Heidelberger，Germany）下观察细胞。随后，将 20 μl MTT（Sigma，St. Louis，MO，USA）添加到每个孔中 4 小时。去除培养基，并将细胞与 150 μl 二甲基亚砜在 37°C 下孵育 10 分钟。使用酶标仪（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）在 490 nm 处测量光密度 (OD) 值。

流式细胞术

细胞在 6 孔板中孵育 24 小时，然后如上所述分组和处理。使用胰蛋白酶制备单细胞悬液并以 300g 离心 3 分钟。去除上清液后，将细胞用预冷的 PBS 洗涤两次，并在 1 ml 膜联蛋白 V（Tianjin Sungene Biotech Co, Ltd.，天津，中国）中离心 10 分钟。细胞调整为10 ⁵ /毫升。离心细胞悬液并用PBS洗涤3次。将样品 (100 μl) 加入含有 5 μl Annexin V-APC (Tianjin Sungene Biotech Co., Ltd.) 和 7-AAD (Tianjin Sungene Biotech Co., Ltd.) 的 Eppendorf 管中并混合。用 PBS 将体积补至 500 μl，并将试管在室温下避光孵育 15 分钟。通过流式细胞术（BD FACSCanto II，BD Becton Dickinson，San Jose，CA，USA）量化细胞凋亡。细胞凋亡率计算公式为：凋亡细胞数/细胞总数×100%。

CT 成像

CT 成像是使用通用电气公司 (GE) 生产的 128 排 64 层螺旋 CT 获得的。成像参数如下：切片厚度为0.625；培养基为裸鼠；管能量 kvp 为 120 μA 和 100 mA； CTDIVOL 为 6.53 mGy；半径为 4.8 厘米。在从低胸到骨盆的头尾方向扫描所有动物。对CT数据进行图像和后处理分析。

组织学分析

将器官取出并固定在 4% 多聚甲醛中，然后每 2 天用 30% 多聚甲醛蔗糖溶液固定，切片，并用苏木精和伊红 (H&E) 染色以使用标准技术进行组织学检查。在倒置相差显微镜下检查切片。

肾功能评估

生化分析仪（锦州医科大学）测定血中BUN、Crea、β2-MG、CO2。大鼠注射AuNS@PEG纳米粒前后血清BUN、Crea、β2-MG、CO2含量变化评价肾脏功能。

统计分析

数据表示为平均值 ± SD，并使用 GraphPad Prism 5.0 软件（GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA）和 SPSS 进行分析。使用单向方差分析和最小显着性差异检验对组进行比较。 P <0.05 被认为具有统计学意义。

结果与讨论

AuNS@PEG 纳米粒子的合成和表征

纳米材料进入人体，起到检测的作用。在进入循环系统之前首先考虑纳米粒子的物理和化学性质 [24, 25]。众所周知，开发用于体内 CT 成像和肾脏清除特性的高性能纳米探针有两个关键因素。一是进一步的表面功能化；另一个是尺寸控制。

大尺度透射电子显微镜 (TEM) 图像（图 1a）用于确认 AuNS@PEG 纳米粒子的结构，表明明显制备了星形结构的 AuNS@PEG 纳米粒子，并且这些纳米粒子具有理想的尺寸50 nm 具有高均匀性。然后，在 AuNS@PEG 纳米粒子的能量色散 X 射线（EDX）光谱中发现的 Au 元素也证明了 Au 纳米星的制备（图 1c）。此外，AuNS@PEG 纳米粒子表面的组成进一步通过 XPS 光谱表征，来自 Au 纳米星和 PEG 的 Au4f、C1s 和 O1s 清楚地显示在图 1b 中，这也证实了 AuNS 的形成@PEG纳米粒子。

AuNS@PEG 纳米粒子的透射电子显微照片 (a ), XPS (b ) 和 EDX (c ) AuNS@PEG纳米颗粒

上述特性证明了AuNS@PEG纳米粒子的成功合成。

CT AuNS@PEG纳米颗粒的价值

金纳米粒子因其比传统的碘基小分子 CT 造影剂更好的 X 射线衰减特性而被广泛用作 CT 造影剂。碘 (Z =53)在历史上一直是CT成像领域的首选原子。为了评估 AuNS@PEG 纳米粒子用于 X 射线计算机断层扫描成像的可行性，我们测量了 CT 值（Hounsfield 单位，HU）。图 2a 显示，与相同浓度的碘和去离子水相比，AuNS@PEG 纳米粒子具有更高的 CT 值。当 AuNS@PEG 纳米颗粒浓度增加时，CT 图像强度也不断增加，图像更亮。通过绘制 AuNS@PEG 的 CT 值（以 HU 为单位）作为浓度的函数（图 2b），我们可以看到 AuNS@PEG 纳米粒子在不同浓度下的 CT 值线性衰减。这些结果表明，AuNS@PEG 纳米粒子是一种理想的 CT 成像纳米探针。

AuNS@PEG 纳米粒子的 X 射线衰减强度与 Au 浓度的函数关系 (a ) 和不同浓度下 AuNS@PEG 纳米粒子的 CT 图像（碘醇，分别为 1000、500、250、125、62.5、31.75、15.625 和 7.8125 ppm）（b )

细胞毒性分析

在将 AuNS@PEG 纳米颗粒用作体内 CT 成像造影剂之前，在体外研究 AuNS@PEG 纳米颗粒的生物相容性至关重要。进行MTT测定以评估它们对神经胶质细胞的细胞毒性。与不同浓度（分别为 25、50、100、200、500 和 1000 ppm）的 AuNS@PEG 纳米粒子孵育 24 小时后，进行神经胶质细胞的 MTT 活力测定。可以看出，在研究浓度范围内用 AuNS@PEG 纳米粒子处理后的细胞活力与对照非常相似，这清楚地表明形成的 AuNS@PEG 纳米粒子在高达 200 ppm 的浓度下具有良好的细胞相容性.即使在相对较高剂量的纳米颗粒（1000 ppm）下，细胞活力仍保持在 90% 以上（图 3a）。

用不同浓度的 AuNS@PEG 纳米粒子孵育 24 小时后神经胶质细胞的细胞活力 (a ); AuNS@PEG纳米颗粒诱导的细胞凋亡通过流式细胞术显示：对照（bi ), 25 ppm (ii ), 50 ppm (iii ), 100 ppm (iv ), 200 ppm (v ), 500 ppm (vi ) 和 1000 ppm (vii )

AuNS@PEG 纳米颗粒的细胞相容性通过对用不同浓度的 AuNS@PEG 纳米颗粒处理 2 小时的细胞进行流式细胞术分析得到进一步证实。在流式细胞术分析中，细胞在用 PBS 和 AuNS@PEG 纳米粒子处理后用膜联蛋白 V-APC 和 7-AAD 染色。用未经染色的 PBS 处理的神经胶质细胞用作对照（图 3bi）。可以看出，细胞分别用浓度为 25、50、100、200、500 和 1000 ppm 的 AuNS@PEG 纳米粒子处理（图 3bi-vii）。结合MTT实验结果表明，AuNS@PEG纳米粒子具有良好的细胞相容性，经AuNS@PEG纳米粒子处理后细胞形态无明显变化，与MTT数据一致。

体内 CT 成像和生物分布

受到体外实验中高 CT 对比度性能的鼓舞，我们进一步证实了 AuNS@PEG 纳米粒子作为体内 CT 造影剂的可行性。将 AuNS@PEG 纳米颗粒（200 ppm）静脉注射到大鼠的尾静脉中。之所以选择这样剂量的 AuNS@PEG 纳米粒子，是因为 MTT 和流式细胞术的毒性和凋亡百分比低，CT 的灵敏度高。在尾静脉注射前和尾静脉注射后不同时间点记录重要器官区域的 CT 成像（图 4）。我们的研究旨在测试 CT 成像和肾脏清除的能力。所以我们强调在CT成像中肾脏和膀胱器官的变化。图 4a 是注射前大鼠肾脏的 CT 图像。与注射前相比，肾脏成像从 0.5 小时到 2 小时大大增强（图 4b-d）。 AuNS@PEG纳米颗粒在大鼠体内的时间依赖性分布也通过静脉注射后的CT信号值进行追踪。肾脏和膀胱显像在0.5～2 h显着增强，HU值从95上升到464，从105上升到664。注射6 h后，大鼠肾脏CT对比强度随时间明显下降（图 4e)。注射后 24 小时后，膀胱器官的 CT 成像完全清晰，显示 AuNS@PEG 纳米颗粒具有出色的肾脏清除特性（图 4f）。由于它们的最佳粒径和表面功能化，在循环过程中从血液中消除 AuNS@PEG 纳米粒子可能非常缓慢。因此，这些结果表明，所制备的 AuNS@PEG 纳米粒子可能是一种独特且有前途的纳米探针，可提供体内实时 CT 成像。这对于未来的临床应用是有益的，因为造影剂可以在医院中对患者进行给药。

注射前大鼠 CT 图像 (a ) 和不同时间点（0.5、1、2、6 和 24 小时）（b –f ) 静脉注射 AuNS@PEG 纳米粒子 (200 ppm) 后

H&E 染色

注射AuNS@PEG纳米粒子后24小时进行小鼠器官的组织学变化，结果如图5所示，我们可以看到主要器官的组织学没有明显变化，最重要的是，这些器官中没有残留的 AuNS@PEG 纳米颗粒。基于上述结果，AuNS@PEG纳米粒子表现出良好的生物相容性，无明显的体内毒性，有望成为一种新型的生物医学CT成像造影剂。

H&E 染色的组织切片：a 心，b 肝脏，c 脾脏，d 肺，e 肾脏和f 肠。比例尺代表 100 毫米

AuNS@PEG 纳米颗粒的肾功能研究

为了进一步评估 AuNS@PEG 纳米粒子的体内毒性，测量了 BUN、Crea、β2-MG 和 CO2 的参数以研究肾功能；我们分析了血清。这些数值可以评估大鼠肾功能的好坏。 BUN的值可以评估大鼠的排尿功能。 Crea 的变化值代表了大鼠体内的各​​种疾病。 β2-MG 浓度主要与肾小管功能有关。并且CO2的值可以评价肾小管的酸化功能。给予大鼠浓度为 200 ppm 的 AuNS@PEG 纳米颗粒。注射后24小时检查这些结果的水平，大鼠注射AuNS@PEG纳米颗粒前后无差异（表1）。

结论

总之，我们开发了简便的 AuNS@PEG 纳米粒子，用于 CT 成像。形成的AuNS@PEG纳米粒子在给定浓度范围内具有超小尺寸、低毒性、良好的水分散性、血液相容性和细胞相容性。 CT 值表明 AuNS@PEG 纳米粒子具有良好的明亮成像。体外成像结果表明，AuNS@PEG 纳米粒子作为 CT 成像应用的新造影剂具有很强的 X 射线衰减特性，这也通过 体内 大鼠肾脏的 CT 成像得到了证明。此外，生物学研究的分布和体内毒性的探索表明，AuNS@PEG纳米粒子可以代谢并具有较高的生物相容性。因此，AuNS@PEG纳米粒子有望成为医学应用的候选者。