Thiacalix[4] 芳烃消除锌阳离子对肌球蛋白 ATP 酶活性的抑制作用

背景

重金属对环境的污染问题以及寻求减少其对生物体影响的方法具有相关性[1, 2]。

锌是大多数生物体必不可少的生物元素。 [3]。锌离子与多种具有重要代谢功能的蛋白质形成复合物。锌离子是至少 300 种金属酶的组成部分，可催化 50 多种不同的生化（生理）反应 [4, 5]。

然而，锌是一种重金属。它可以与两种有毒金属镉和汞一起出现在元素周期表的 IIb 族中。然而，锌被认为对人类相对无毒[6]。该元素仅在过量服用时才有毒[7]。

根据美国国家医学图书馆的 TOXNET 数据库，锌的口服 LD50 接近 3 g/kg 体重。它比镉高 10 倍以上，比汞高 50 倍 [6]。这种微量元素在人体中超过正常浓度的最常见原因是摄入了在其成分中含有多余锌的药物和生物活性添加剂。它被记录为因食用储存在镀锌或全锌容器中的食物而导致锌中毒的个别案例。氧化锌、氯化锌和硫酸锌广泛用于工业 用于生产玻璃；用于制造人造纤维、锌漆、陶瓷、火柴和牙科水泥；在纸浆和造纸工业中，用于保护木材，以及用于镀锡和焊接。

高浓度的锌摄入会改变免疫反应 [8]。一些流行病学研究表明，大脑中Zn、Al、Cu和Fe水平升高可能促进阿尔茨海默病的发生或进展[9, 10]。

重金属会影响女性在胎儿生命开始、早期发育和成熟等不同阶段的生殖。重金属阳离子还可能导致不育、不孕症、宫内发育迟缓、自然流产、畸形、出生缺陷、产后死亡、早衰以及学习和行为障碍[11, 12]。

子宫收缩功能与蛋白质复合物——肌动球蛋白的活性有关，肌球蛋白在其中表现出酶活性，即水解 ATP 的能力。肌球蛋白 ATP 酶位于亚片段 1（S1 或头部）的催化域中，将沉积在 ATP 宏观能键中的化学能转化为机械运动。结果，肌球蛋白沿着肌动蛋白丝移动，导致肌肉收缩。因此，肌球蛋白催化的ATP水解被认为是子宫肌层功能分子机制中必不可少的过程之一[13, 14]。

肌球蛋白亚片段-1 是肌球蛋白重链的 N 端部分，由两个域组成：N 端球状运动（催化）域，包含 ATP 酶位点和肌动蛋白结合位点，以及调节域，或杠杆臂负责肌球蛋白沿肌动蛋白丝的运动。肌球蛋白运动域的核心由中央的七链 β 折叠形成，该折叠被 α 螺旋包围。占中央 β-折叠 7 条链中的 6 条的大结构域通常称为上 50-kDa 域 (U50)。一个大裂缝将上部 50-kDa 域与由 465 到 590 的氨基酸残基形成的明确结构的下部 50-kDa 域 (L50) 分开。肌球蛋白的肌动蛋白结合区和核苷酸结合位点位于七链 β 折叠的相对两侧，核苷酸的磷酸部分位于核苷酸结合口袋的后部。 P 环、开关 1 和开关 2 位于靠近大裂隙顶点的上 50 kDa 域中。所有三个核苷酸结合基序都与核苷酸结合口袋后部核苷酸的磷酸基团接触并充当γ-磷酸传感器[15]。

我们之前的研究发现，重金属阳离子会抑制子宫平滑肌的肌球蛋白 ATPase 活性 [16, 17]，从而对子宫肌层的收缩特性产生负面影响。

重金属对子宫收缩力的不利影响需要开发能够消除这些有害影响的药理物质。

杯芳烃作为用于不同生化过程的预期人工效应物目前已引起研究人员的注意。这些化合物是具有杯形结构的合成大环酚低聚物。它们的上下边缘可以用各种化学取代基进行功能化。杯[4]芳烃由四个功能化的芳烃片段组成，具有相当灵活的大环构象。杯[4]芳烃显示出基质的低毒性和渗透到细胞中的能力。因此，这些化合物被认为是开发新的有效药物的有前途的药物[18, 19]。

一类有前景的此类物质是水溶性硫杂杯芳烃 [18]，其在大环分子平台上具有金属络合基团。杯芳烃由于能够与（生物）金属阳离子形成超分子配合物，也被用于生物医学研究中作为重金属提取剂[20,21,22]。

我们之前已经表明，四羟基-硫代杯[4]芳烃-四磺酸盐 (С-798) 消除了 Pb ²⁺ 的抑制作用 , Cd ²⁺ , 和 Ni ²⁺ 对猪子宫肌层肌球蛋白S1催化ATP水解的影响[23].

本研究旨在研究高浓度锌阳离子的影响及其与四羟基-硫代杯[4]芳烃-四磺酸盐 (С-798) 和四羟基-硫代杯[4] 芳烃-四膦酸盐 (C-800) 对肌球蛋白的影响来自子宫的 S1 ATPase 活性。本研究需要测试这些硫杯芳烃消除高浓度锌对子宫肌球蛋白酶活性的不利影响的能力。

Thiacalix[4] 芳烃 C-798 和 C-800 由一个杯状结构组成，该杯状结构由四个酚类片段在上缘分别用四个阴离子磺酸盐和四个膦酸盐基团修饰而成。硫杯[4]芳烃的下缘均具有密集的羟基和二价硫原子，使它们能够螯合重金属并形成稳定的金属络合物[21]（图1）。

四羟基-硫杂杯[4]芳烃-四磺酸盐 (C-798) (a ), 四羟基-硫代杯[4]芳烃-四膦酸酯 (C-800) (b )，以及硫代杯芳烃与金属阳离子在下缘（倒置位置）的螯合方案（c )

这项工作是乌克兰 NAS 帕拉丁生物化学研究所和有机化学研究所联合项目的结果，重点是子宫肌球蛋白 ATP 酶与杯 [4] 芳烃的相互作用，杯[4] 芳烃是子宫肌球蛋白 ATP 酶的抑制剂或激活剂（效应器）。

结果

肌球蛋白 S1 ATPase 活性对 Zn 的依赖性 ²⁺ 浓度

发现对来自子宫的肌球蛋白 S1 ATPase 活性最显着的抑制作用是 5 mM (43 ± 8%, M ± SD) 的 Zn 阳离子。 Zn ²⁺ 的浓度范围 在培养介质中为 0.5-5 mM（含有 3 mM ATP、5 mM Mg ²⁺ , 和 0.01 mM Ca ²⁺ ）。 100% 是未添加 Zn 阳离子的 ATPase 活性值（对照）（图 2）。因此，使用 5 mM Zn ²⁺ 进一步研究了 Zn 阳离子对肌球蛋白 S1 ATP 水解的不利影响 .

在 0.5-5.0 mM Zn 阳离子 (M ± SD, n =6)。 100%为未添加锌离子时ATPase活性值

存在 5 mM Zn ²⁺ 时肌球蛋白 S1 ATPase 活性对 ATP 浓度的依赖性

Zn ²⁺ 研究了肌球蛋白 S1 ATPase 活性对其底物 (ATP) 亲和力的影响。在对照和 5 mM Zn ²⁺ 中，在固定的 MgCl2 浓度 (5 mM) 下，将培养介质中的 ATP 浓度从 0.5 mM 增加到 5 mM 产生了一个圆顶形图，在 3 mM ATP 时具有最大值的 ATPase 活性。在锌存在下，该峰的酶活性值比对照低 30%（图 3）。肌球蛋白 S1 ATPase 活性对对照中 ATP 浓度和 5 mM Zn ²⁺ 的依赖性图 根据 Lineweaver-Burk 方法 [27] 对上升部分进行线性化。动力学参数的计算，即米氏虚常数 (K m) 和肌球蛋白 S1 ATPase 对 ATP 的最大速率 (V max, ATP) 表明 V 最大，存在 5 mM Zn ²⁺ 时肌球蛋白酶活性的 ATP 降低了 1.6 倍（38 ± 7 和 22 ± 6 nmol Pi/min 每 1 mg 蛋白质在对照和 Zn ²⁺ 分别为 n =5)。 К的价值 肌球蛋白 S1 水解 ATP 的 m 没有统计学上的变化，尽管它趋于降低（对照中为 0.49 ± 0.15 mM，存在 Zn ²⁺ 时为 0.38 ± 0.12 mM; M ± SD； n =5).

在 5 mM Zn ²⁺ 存在下，0.5-5 mM ATP 对来自子宫的肌球蛋白 S1 ATPase 活性的影响 与对照相比 (M ± SD, n =5)

肌球蛋白 S1 ATPase 活性对镁的依赖性 ²⁺ 存在浓度 5 mM Zn ²⁺

5 mM Zn ²⁺ 的影响 在 Mg ²⁺ 研究了浓度对子宫肌球蛋白 ATPase 活性的依赖性。增加 Mg ²⁺ 在存在 5 mM Zn ²⁺ 的情况下，在固定 ATP 浓度 (3 mM) 下，孵育培养基中的浓度为 0.5 至 5 mM 不会导致肌球蛋白 S1 ATPase 活性的变化。同时，Mg ²⁺ 检测到对照（在标准条件下）中 ATP 酶活性的浓度依赖性。对照中肌球蛋白 ATP 水解的最高水平在 3 mM Mg ²⁺ （图 4）。因此，子宫肌球蛋白S1酶活性不依赖于Mg ²⁺ 的浓度 在高浓度 (5 mM) Zn 存在下。

肌球蛋白 S1 ATPase 活性依赖于 Mg ²⁺ 存在 5 mM Zn ²⁺ 时的浓度 与对照相比 (M ± SD, n =6)

肌球蛋白 S1 中的锌结合位点

计算机模拟显示锌阳离子在肌球蛋白头部有几个结合区。其中之一位于上下 50 kDa 亚域之间的裂隙下部，靠近核苷酸结合位点，直接靠近 P 环。锌 ²⁺ 与氧原子 Glu177（键长 0.23 和 0.39 nm）、Ser178 氧原子（键长 0.31 nm）和 Arg236（键长 0.32 nm）配位。

其他 Zn 结合区位于上部 50-kDa 亚域（Leu218-Asp463、Glu605-Phe621）的底部，靠近开关 1（Gly233-Phe246）和 P 环。锌 ²⁺ 可以与 Glu327 氧原子（键长 0.21 nm）、氧原子 Glu326（键长 0.34 nm）和氧原子 Asp323（键长 0.32 nm）配位。 Zn 阳离子还可以与接触开关 2 的区域中的肌球蛋白 S1 相互作用，与 Glu 465（0.24 nm）、Asp468（键长 0.31 nm）和 Leu653（键长 0.37 nm）相互作用。该结合区靠近肌动蛋白结合位点和上下 50 kDa 子域之间的裂缝。该裂缝的底部位于 ATP 结合口袋中。这些结合Zn ²⁺ 肌球蛋白 S1 结构域在 ATP 的结合和水解中起重要作用。这些区域在将能量从 ATP 水解位点转移到肌动蛋白结合表面的过程中经历了复杂的构象转变。

Thiacalix[4]arenes 消除 Zn ²⁺ 的抑制作用 对肌球蛋白 ATP 酶活性的影响

将 50 mM Tris-HCl 缓冲液 (pH 7.2) 中的 100 微摩尔 C-800 或 C-798 溶液添加到含有 5 mM Zn 阳离子的培养介质中，以消除 Zn ²⁺ 的负面影响 对子宫平滑肌肌球蛋白 S1 的 ATPase 活性的影响。作为对照，将其用作酶促活性而不将锌和/或硫代杯[4]芳烃添加到温育培养基中。结果表明（图 5）化合物 C-800 不影响子宫肌层肌球蛋白 S1 的 ATP 酶活性。虽然，化合物 C-798 对肌球蛋白 S1 ATPase 活性表现出很小的抑制作用，这很可能与提取一定量的 Mg ²⁺ 有关。 [21]，对于活性中心中的 ATP 结合及其水解至关重要，来自培养介质。尽管如此，100 μM C​​-798 以及 C-800 消除了 5 mM Zn ²⁺ 的抑制作用 肌球蛋白S1催化ATP水解过程的研究

在 5 mM Zn ²⁺ 存在下，100 μM C​​-798 和 C-800 对肌球蛋白 S1 ATPase 活性的影响 (M ± SD, n =5–6)。 100% 是不添加 Zn 阳离子的 ATPase 活性值。 “Zn”和“Zn + C-798”之间以及“Zn”和“Zn + C-800”值之间的差异具有统计学意义（p <0.05)，分别用*和**表示

C-798 和 C-800 在 Zn ^{2+ 存在下对肌球蛋白 S1 ATPase 活性的恢复作用的可能机制 2+}

C-798 和 C-800 恢复 Zn ²⁺ 中肌球蛋白 S1 ATPase 活性的最可能机制之一 硫杯 [4] 芳烃结合 Zn 阳离子并因此将这些阳离子从培养介质中排除的能力。有趣的是，这些硫杯[4]芳烃是否可以与已经与肌球蛋白结合的锌阳离子结合。

计算机模拟表明，在芳环之间具有桥接硫原子的硫代杯[4]芳烃C-798和C-800呈“锥”构象，由酚基之间的氢内键稳定。获得了这些杯[4]芳烃的能量最小化结构。最小化后 C-798 的总能量为 64.5 kcal/mol。杯[4]芳烃边缘（特别是下部）上电离基团的存在显着增加了静电相互作用对主客体相互作用总能量的贡献。我们还对 C-798-Zn ²⁺ 进行了“最小化” 复杂的;其总能量为 83 kcal/mole。

C-798 嵌入肌球蛋白 S1 的结构中，与之前与环 P 区域中的蛋白质结合的 Zn 阳离子协同作用。在这种情况下，Zn ²⁺ 与 C-798 的下缘氧原子和桥硫相互作用（O3，0.21 nm；S1，0.30 nm；O2，0.34 nm）。结果表明，Zn ²⁺ 在一定程度上偏离 P 环的氨基酸残基并削弱其与 Glu177 氧原子的相互作用（0.43 nm 键长）（图 6）。

Zn ²⁺ 相互作用的几何参数 与肌球蛋白 S1 的 P 环区域 (a ) 以及 C-798 对 Zn 阳离子与该区域协同作用的影响 (b )

C-798 在肌球蛋白 ATP 结合区域的“腔”中的固定发生在几个氨基酸残基的参与下。特别是硫杯芳烃的疏水篮被Phe467和Phe469的肌球蛋白芳香族氨基酸残基固定；硫杯芳烃带负电荷的氧原子与带正电荷的 Arg570、Asn572 和 His689 氨基酸残基相互作用。

C-798对Zn ²⁺ 变化影响的研究 在肌球蛋白 ATP 结合位点附近区域对接期间的位置表明 Zn ²⁺ 在硫代杯[4]芳烃存在下，与第三个磺酰基（O16–0.26 nm；O15–0.27 nm）的氧原子相互作用，几乎不与氧原子 Asp134 和 Glu326 相互作用，与 Glu327 的配位要弱得多（0.43 nm 耦合长度）（图 7）。在这种情况下，硫杯芳烃在几个氨基酸残基的参与下固定在蛋白质的“空腔”中。特别是，硫杂杯芳烃磺酰基的带负电荷的氧原子与 Lys188、Lys195 和 Gln221 的肌球蛋白带正电荷的氨基酸残基相互作用。

Zn ²⁺ 相互作用的几何参数 在靠近肌球蛋白开关 1 和肌球蛋白 S1 P 环的区域 (a )和C-798对Zn ²⁺ 协同作用的影响 与此区域 (b )

结果表明，由于C-798中氧原子和硫原子的存在，Zn阳离子的条件能量球与静电相互作用的传播表面接触甚至有些重叠。这表明正在研究的阳离子与上下 C-798 冠的带负电荷的原子有足够密切的相互作用。硫杂杯芳烃很可能在自身上产生 Zn ²⁺ ，从而减弱了阳离子与酶氨基酸残基的相互作用。

因此，C-798 在肌球蛋白 S1 区域对接的结果，其中包含 Zn ²⁺ 结合，表明 C-798 官能团与 Zn 阳离子相互作用的可能性。在这种情况下，与肌球蛋白 S1 氨基酸残基的 Zn 阳离子键显着减弱，它们之间的距离增加。从而消除了锌离子对肌球蛋白ATP酶活性的不利影响。

我们还对杯 [4] 芳烃 C-800 的影响进行了计算机模拟，停靠在靠近 S1 肌球蛋白 ATP 结合区域的区域，以改变阳离子 Zn 的几何形状。同时，Zn ²⁺ 与 Arg236（0.37 nm 键长）、Glu675（0.41 nm 键长）和上部官能杯 [4] 芳烃残基的原子（H26，2.36 nm；H30，2.96 nm；C30，0.31 nm；O5， 3.7 纳米；O16，0.4 纳米；O7，0.48 纳米；和 O11，0.51 纳米键长）。锌 ²⁺ 与杯[4]芳烃C-800相互作用，类似于C-798。阳离子也从该区域的先前结合位点退出，并与 Asp468（0.2 nm 键长）和下杯芳烃冠的原子（C4，1.96 nm；C14，2.07 nm；S3，2.16 nm；O2）接触, 2.26 nm; C3, 2.97 nm; C20, 3.10 nm; O4, 4.2 nm; C14, 3.0 nm; and O3, 4.1 nm).

与肌球蛋白亚片段 1 区域对接的 C-798 和 C-800 表明，这些硫杯 [4] 芳烃可以与结合 ATP 酶活性位点附近肌球蛋白氨基酸残基的锌阳离子相互作用。因此，它们的保护作用可能是这些阳离子与肌球蛋白S1相互作用减弱的结果。

讨论

许多女性生殖异常是由子宫平滑肌（子宫肌层）疾病引起的。重金属对子宫平滑肌的收缩性有不利影响。重金属锌是大多数生物体必不可少的生物源元素；高剂量的这种元素是有毒的 [5]。 Zn ²⁺ 毫摩尔浓度的若干研究 之前描述过对活体的研究 [32]。我们发现 5 mM Zn 对来自子宫的肌球蛋白 S1 ATPase 活性具有最显着的抑制作用。因此，在此浓度的 Zn ²⁺ 中进一步研究了 Zn 阳离子对肌球蛋白 S1 ATP 水解的不利影响。 .肌球蛋白S1 ATPase对ATP动力学参数的计算表明V 最大，存在 5 mM Zn ²⁺ 时肌球蛋白酶活性的 ATP 下降了 1.6 倍。 К的价值 ATP水解的m在统计上没有变化，尽管它趋于减少。

生理条件下的肌球蛋白是 Mg ²⁺ 依赖的 ATP 酶。镁阳离子参与肌球蛋白活性位点的 ATP 结合以及 ATP 水解。 Mg ²⁺ 在酶的活性位点与肌球蛋白氨基酸残基 Thr-186 和 Ser-237 的侧链以及 ATP 分子的 β- 和 γ-磷酸基团协调，形成 β- 和 γ-双齿复合物以及活性水分子，其中一个对 γ-磷酸 ATP 进行亲核攻击 [33, 34]。镁 ²⁺ 与 ATP 带负电荷的磷基团相互作用，使它们极化，从而促进对末端 γ-磷酸的亲核攻击 [14]。

发现肌球蛋白S1 ATPase活性对Mg ²⁺ 的存在不敏感 在 5 mM Zn ²⁺ 浓度下 与培养基中不含锌时的对照形成对比 [35, 36]。

肌球蛋白 ATP 酶活性取决于金属阳离子的性质并与其离子半径密切相关。离子半径 Mg ²⁺ 和 Zn ²⁺ 在解决方案中非常相似（分别为 0.070 和 0.076 nm）[37]。因此，Zn ²⁺ 的相互作用 与 Mg ²⁺ 的阳离子 肌球蛋白的结合位点是可能的。因此，Mg ²⁺ -结合位点可以被Zn ²⁺ 占据 高浓度的阳离子。在这种条件下肌球蛋白 S1 的 ATP 酶活性可能对镁阳离子不敏感。肌球蛋白包含两个对 Mg ²⁺ 的高亲和力位点 , 和 Mg ²⁺ 在这些位点结合在肌肉收缩期间的能量转导过程中具有重要的生理作用。还有几个Mg ²⁺ 除了肌球蛋白分子中的 ATPase 位点之外，还有 - 结合位点，镁离子的结合能及其亲和力不同 [35]。因此，可以假设 Zn ²⁺ 还可以与肌球蛋白S1的其他影响ATP结合和水解的重要功能位点结合。

计算机模拟表明，Zn 阳离子在肌球蛋白头部有几个结合区域，靠近 ATP 结合位点，即 P-loop 和上下 50-kDa 亚域开关 2。这些结合 Zn ²⁺ 肌球蛋白 S1 结构域在 ATP 的结合和水解中起重要作用。这些区域在将能量从ATP水解位点转移到肌动蛋白结合表面的过程中经历了复杂的构象转变。

Zn ²⁺ 得到的分析结果 与肌球蛋白S1的对接表明该阳离子与肌球蛋白分子结合的关键作用是与酶氨基酸残基的带负电荷基团，特别是Glu和Asp相互作用。

Zn ²⁺ 有毒浓度的有害影响 肌球蛋白 S1 ATPase 活性的阳离子需要寻找可以消除这种金属作用的药理学化合物。我们研究的对象是四羟基硫杂杯[4]芳烃-四磺酸盐（C-798）和四羟基硫杂杯[4]芳烃-四膦酸盐（C-800），它们能够螯合过渡金属和重金属，形成稳定的金属络合物（图1）。 1）。 C-798 和 C-800 的上部大环冠分别含有四个阴离子磺酸盐基团或四个膦酸盐，由于与氨基酸片段的带正电荷的氮原子静电接触，它们提供了良好的硫杂杯芳烃水溶性和对蛋白质分子的粘附[21] ].

与肌球蛋白 S1 区域对接的 C-798 和 C-800 表明，这些硫杯[4] 芳烃可以与结合 ATP 酶活性位点附近肌球蛋白氨基酸残基的 Zn 阳离子相互作用。因此，它们的保护作用可能是这些阳离子与肌球蛋白 S1 之间相互作用减弱的结果。推测所得结果可用于进一步研究，以期将该硫杯[4]芳烃作为高浓度锌中毒的药理化合物。

结论

高浓度 (5 mM) 的 Zn 阳离子抑制来自子宫的肌球蛋白 S1 ATPase 活性。 Zn 的抑制作用与在 5 mM Zn ²⁺ 存在下肌球蛋白 S1 催化的水解 ATP 的最大速度降低有关 . К的价值 ATP 的 m 在统计上没有变化，尽管它趋于减少。

在 5 mM Zn ²⁺ 存在的情况下，四羟基硫杂杯 [4] 芳烃四磺酸盐 (C-798) 和四羟基硫杂杯 [4] 芳烃四膦酸盐 (C-800) 将肌球蛋白 S1 ATPase 活性恢复到对照水平 .

锌离子在靠近 ATP 酶活性位点的肌球蛋白 S1 中有几个结合区。 C-798 和 C-800 与含有 Zn ²⁺ 的肌球蛋白 S1 区域对接 结合，表明这些硫杂杯[4]芳烃官能团与结合的锌阳离子相互作用的可能性。与肌球蛋白 S1 氨基酸残基的 Zn 阳离子键显着减弱，它们之间的距离增加。从而消除了锌离子对肌球蛋白ATP酶活性的不利影响。

推测所得结果可用于进一步研究，目的是将这种硫杯[4]芳烃作为高浓度锌中毒的药理化合物。

方法

试剂

使用以下试剂：血清白蛋白，EGTA，EDTA，ATP，抗坏血酸，Tris，tricine，二硫苏糖醇，丙烯酰胺，（Sigma，美国），甘氨酸（默克，德国），N，N'-亚甲基双丙烯酰胺（Acros Organics，比利时） ) N,N,N',N'-四亚甲基二胺（匈牙利雷纳尔）及国产试剂（R级）。在 Crystal Bio 系统 (Adrona, Latvia) 上纯化的水中制备溶液。水电导小于 0.1 μS。溶液中二价金属阳离子的浓度采用莫尔法测定。

肌动球蛋白和肌球蛋白 Subfragment-1 分离

如 [17] 中所述，通过改良的 Barany 方法从猪子宫平滑肌中分离肌动球蛋白。肌球蛋白 S1 是通过改良的 Suzuki 方法从猪肌动球蛋白中获得的 [24]。样品纯度由PAAG-SDS电泳控制[25]。

ATPase 活性测定

ATPase activity of myosin S1 was determined in a 96-well plate at 37 °C in an incubation medium (total volume 0.1 ml) of the following composition (mM):Tris-HCl buffer (pH 7.2), 20; KCl, 100; CaCl2, 0.01; MgCl2, 5; and ATP, 3 (standard conditions). Protein (myosin S1) concentration was 20 μg/ml. Incubation time was 5 min. Samples containing all components of the incubation medium without myosin S1 were taken as control of non-enzyme hydrolysis of ATP. The amount of inorganic phosphate released during ATP hydrolysis reaction was determined by the Chen method [26] by the measurement of optical absorbance of the solution at 820 nm using a microplate reader μQuwant (Biotek ^@ Instruments, Inc., USA) and specified as Pi nmol/min per 1 mg of protein.

The Zn ²⁺ and thiacalix[4]arene effects on the ATPase activity of myosin S1 were studied using standard incubation medium with solutions of ZnCl2 and thiacalix[4]arenes at the corresponding concentrations. The value of ATPase activity in the absence of ZnCl2 and/or calix[4]arenes in the incubation medium was taken as 100% (control).

Kinetic and Statistical Analysis

The values of the imaginary constant of Michaelis (K m) and maximal rate of myosin S1 ATPase for ATP (V max, ATP) were calculated using the graph of the dependence of ATPase activity on the ATP concentration according to Lineweaver–Burk method [27]. Statistical processing of the obtained data was performed using standard methods of variation statistics. Experimental data were analyzed by using the standard software “MS Office” and “Statistica 4.5.” The statistical comparisons were performed using two-way analysis of variances (ANOVA).

Thiacalix[4]Arene Synthesis and Characterization

Tetrahydroxy-thiacalix[4]arene-tetrasulphonate and tetrahydroxy-thiacalix[4]arene-tetraphosphonate were synthesized and characterized using NMR techniques and IR spectroscopy in the Phosphoranes Chemistry Department of the Institute of Organic Chemistry, NAS of Ukraine. Infrared and NMR spectroscopy confirmed the structure of these synthesized thiacalix[4]arenes. This thiacalix[4]arenes were dissolved in water.

Computer Modeling

Computer modeling of the interaction between ligands (thiacalix[4]arenes, Zn ²⁺ , model bindings) and receptor (myosin S1) was performed using AutoDock software, version 4.2 [28]. We used the three-dimensional enzyme structure with the 1b7t identifier in RSCB PDB in our research [29]. Computer modeling of the thiacalix[4]arene structural peculiarities was carried out using HyperChem 7.01. Molecular dynamics calculations were performed by the MM2 method with the semi-empirical methods (CNDO).

Program AutoDockTools was used for preliminary “processing” of interacting molecules. One hundred runs of Lamarkian genetic algorithms (population size, 100; the maximal number of energy evaluations, 10 ⁶ ) were conducted. To analyze and visualize the docking results, we used the programs Chimera [30] and Yassara [31]. Calculation of the minimal total binding energy was implemented considering Van der Waals forces, electrostatic and hydrophobic interactions, and hydrogen bonds. The optimal ligand positions in the complex “receptor-ligand” were determined according to the energy values obtained by docking software calculator for binding energy in complex “receptor-ligand.” Thus, we selected a series of complexes with the lowest total energy and then calculated the optimal geometry of the complexes and determined the most energetically preferred arrangement of the ligands in the space of myosin subfragment-1 binding domain.

缩写

C-798:

Tetrahydroxythiacalix[4]arene-tetrasulfosphonate

C-800:

Tetrahydroxythiacalix[4]arene-tetraphosphonate

CNDO:

Complete Neglect of Differential Overlap (methods)

K m :

Michaelis constant, the substrate concentration at which the reaction rate of the enzyme is half of the maximal velocity

L50:

Lower 50-kDa domain of myosin

LD50 :

Lethal dose is the amount of an ingested substance that kills 50% of a test sample

MM2:

A class of force fields

Myosin S1:

Myosin subfragment-1

NASU:

National Academy of Science of Ukraine

PDB:

Protein Data Bank

P-loop:

Phosphate-binding loop of myosin

RCSB:

Research Collaboratory for Structural Bioinformatics

U50:

The upper 50-kDa domain of myosin

V max :

Maximal velocity of the enzyme

V max, ATP :

V max for ATP