凋亡途径驱动新鲜与老化氧化锌纳米颗粒细胞毒性差异

摘要

氧化锌纳米颗粒（ZnO NPs）广泛应用于工业、商业产品和医药领域。大量机制研究基于原始（新鲜）NPs进行，但老化（转化）ZnO NPs诱导的细胞毒性及其潜在机制尚不清晰。本研究观察ZnO NPs随时间发生的理化转化，评价新鲜和老化NPs细胞毒性。发现新鲜ZnO NPs诱导凋亡水平高于老化NPs。RNA测序显示老化ZnO NP处理人-仓鼠杂交（A_L）细胞中p53、PI3k-Akt、FoXO、谷胱甘肽、ErbB、HIF-1、催产素和Jak-STAT信号通路富集，但无凋亡通路。定量PCR显示新鲜NP处理组IL1B和CD69 mRNA水平显著高于老化ZnO NP和氯化锌处理组。结果表明老化ZnO NPs细胞毒性降低部分归因于其诱导凋亡能力减弱。老化NPs激活的多信号通路转录调控可能有助于建立细胞稳态。研究凸显老化（环境转化）过程对ZnO NPs毒性及生物后果的影响。

引言

纳米技术数十年快速发展使纳米颗粒（NPs）应用于工业、人类日常生活和纳米医学等各领域。纳米技术消费品清单（CPI）显示2005-2015年纳米产品数量增加30倍，包括762种健康（健身）产品、72种食品（饮料）和23种婴儿产品。NPs在消费品和各领域应用增加了NPs进入环境可能性，引发对其潜在不利影响的安全担忧。氧化锌（ZnO）NPs是最常用NPs之一，全球年产量近3400吨。先前被认为生物惰性的物质在纳米颗粒态可能变得有毒。越来越多研究阐明ZnO NPs可通过诱导显著毒性对哺乳动物细胞和动物构成重大风险。

包覆、表面官能化、氧化态修饰等策略通过改变NPs理化性质（溶解、团聚、细胞膜扰动等）减弱潜在毒性。虽这些修饰在一定程度上减弱毒性，但NPs使用并非总是安全，特别是特定暴露条件和环境下。实际上多种NPs不稳定，有意或无意释放到自然环境后倾向发生"老化"或"环境转化"。近年大量工作探索NPs环境转化过程，但"转化（老化）"NPs毒效应研究仍极有限，更遑论毒性机制。

作为非持久性NPs典型代表，ZnO NPs反应性极高，释放入环境或被动物摄入后理化性质和发生态易转化，显著影响毒理学效应。如研究显示ZnO NPs硫化过程改变电荷、疏水性和聚集状态，导致硫化态NPs在人唾液、汗液和支气管肺泡灌洗液中吸附。ZnO NPs吸附蛋白形成特殊蛋白冠通常影响生物效应。生理溶液中磷酸盐可在5-10小时内将ZnO NPs转化为亚稳态ZnHPO₄和Zn₃(PO₄)₂。体外暴露系统中人T淋巴细胞（37°C，含10% FBS的RPMI1640培养基，24小时）中ZnO NPs（≤3 μg/mL）完全转化过程经同步辐射X射线吸收近边结构谱（XANES）研究。上述研究提示仅评估原始（新鲜）ZnO NPs生物效应会低估其环境和健康风险。鉴于此，迫切需要全面理解NPs老化和环境转化过程。

前期研究显示ZnO NPs在超纯水中老化40-120天发生理化转化，转化为Zn₅(CO₃)₂(OH)₆、Zn(OH)₂和Zn²⁺。有趣的是老化ZnO NPs细胞毒性低于新鲜NPs，但毒性变异机制不清。本研究旨在探究新鲜与老化ZnO NPs细胞毒性差异的潜在原因。系统应用两种粒径（20 nm和90-200 nm）ZnO NPs。细胞毒性实验显示老化ZnO NPs诱导形态异常较轻、细胞活率相对较高。RNA测序显示新鲜ZnO NP处理细胞凋亡基因富集，老化ZnO NP处理则较少影响。此外老化ZnO NP暴露细胞裂解半胱天冬酶-3蛋白水平降低，进一步表明新鲜ZnO NPs诱导培养细胞凋亡能力更强。结合前期发现，本研究提示老化ZnO NPs细胞毒性降低归因于其触发细胞凋亡能力减弱。

材料与方法

纳米颗粒与试剂

商业化ZnO纳米粉末（ZnO NPs），制造商标称平均粒径20 nm（纯度99.5%，近球形）和90-200 nm（纯度99.9%，不规则形貌），购自Nanostructured & Amorphous Materials（美国休斯顿）。除特别注明，本研究所有试剂化学品购自Sigma-Aldrich（上海，中国）。

纳米颗粒分散、老化与表征

ZnO NPs储备悬液（1 mg/mL）以干燥纳米粉末悬于Milli-Q H₂O（Millipore, 18 MΩ·cm）制备，高压灭菌（120°C, 30 min）后25°C自然老化0-60天。0天和60天自然转化ZnO NPs分别指定为新鲜和老化NPs。表征或细胞孵育前，新鲜和老化悬液经超声（100 W）30分钟分散。透射电镜（TEM, JEOL JEM-2010, 日本东京）表征新鲜老化ZnO NPs形貌、粒径和聚集。X射线衍射（XRD, PANalytical B.V., 上海，中国）对比标准品确定晶体结构。自然老化过程及表征详见前文。

细胞培养与ZnO NPs处理

A_L细胞系为人-仓鼠杂交细胞，由中国仓鼠卵巢（CHO）gly2A突变株与人成纤维细胞融合而成。含标准CHO-K1染色体组和单拷贝人11号染色体，于含胎牛血清（8%）、庆大霉素（25 g/mL）、甘氨酸（2×10⁻⁴ M）的Ham's F12培养基（Hyclone, 美国）中培养（37°C, 5% CO₂，湿饱和）。新鲜老化ZnO NPs储备液超声30分钟分散防团聚，用培养基稀释至适当浓度处理细胞。仅培养基培养细胞作各实验对照。

细胞毒性检测

A_L细胞对数生长期接种于35 mm培养皿玻片上（6×10⁴ cells/皿）24小时，随后用含1、5、10、12、15、20 µg/mL新鲜或老化ZnO NPs的2 mL培养基处理72小时。处理结束后用Leica DM4B显微镜（Leica, 德国）获取细胞形态图像。ZnCl₂作为锌离子参考对比ZnO NPs细胞毒性。

细胞计数试剂盒（CCK-8）（APExBIO, 上海，中国）检测细胞活率。详述：A_L细胞接种96孔板（4×10³ cells/well）培养24小时，用含不同浓度ZnCl₂、新鲜老化ZnO NPs培养基处理24、48、72小时。工作液中每孔加入储备液体积<培养基总体积5%。处理结束吸去培养基，每孔加100 µL CCK-8工作液，按说明书37°C孵育2小时。Spectra Max M2荧光读数仪（Molecular Devices, 英国）450 nm记录吸光度。细胞活率=各浓度NPs孔吸光度/对照细胞吸光度（100%）×100%。

RNA提取、逆转录与定量PCR

A_L细胞对数期接种35 mm培养皿（6×10⁴ cells/皿）24小时。换含12 µg/mL ZnCl₂、新鲜老化ZnO NPs培养基2 mL处理72小时。吸去培养基，PBS洗涤3次。各皿加1 mL Trizol试剂（Invitrogen, 美国）按说明提取总RNA。Q5000UV-Vis分光光度计（Quawell, 美国）定量总RNA浓度纯度。TransGene RT-PCR试剂盒（TransGene Biotech, 北京，中国）按方案逆转录获cDNA。Q5000 UV-Vis分光光度计定量cDNA，SYBR-Green荧光染料（TransGene Biotech, 北京）于Roche RT-PCR系统（Applied Biosystems）分析。

内参基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Gapdh）评价Il-1α、Il-1β、Caspase 3、CD69、Jun、MT1 mRNA表达。结果以目标基因与Gapdh相对表达比表示。引物序列见表1。

RNA测序数据分析

对照组、老化ZnO NP处理组、ZnCl₂处理组A_L细胞总RNA经BangFei Bioscience（北京，中国）测序。简述：按TRIZOL方案提取总RNA至异丙醇沉淀，重悬于提取缓冲液测序。R包Deseq2分析原始计数RNA测序数据。R包VennDiagram生成Venn图。显著变化基因用于后续通路富集分析。实验三独立重复。排除rRNA基因、线粒体基因、检测长度<40 bp基因。

RNA测序数据、参考系列GSE97852、GSE60159、GSE39444源自Gene Expression Omnibus。基因集富集分析图由R（3.6.2版）fgsea包生成。1.5倍显著变化且p<0.05凋亡基因进一步分析。R包"ComplexHeatmap"生成基因树热图，平均链接聚类，欧氏距离度量。STRING2.0进行通路富集分析。

Western Blot分析

A_L细胞对数期接种60 mm培养皿（1.5×10⁵ cells/皿）24小时。换含12 µg/mL新鲜或老化ZnO NPs培养基4 mL处理24小时。暴露结束吸去培养基，PBS洗涤3次，冰上RIPA裂解液（Beyotime, 中国）裂解收集细胞蛋白。等量蛋白12% SDS-PAGE电泳分离，转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Roche, 瑞士）。5%脱脂奶粉TBST封闭2小时（25°C），按说明书稀释一抗4°C过夜孵育，HRP标记二抗（1:5000, Promega, 美国）25°C孵育2小时。增强化学发光（ECL）（BOSTER, 中国）检测免疫印迹。抗原/裂解半胱天冬酶-3和抗Actin一抗分别购自Cell Signaling Technology和ImmunoWay。

统计学分析

至少三独立实验结果均值编译统计。数据以均值±标准差（SD）表示，单因素方差分析（ANOVA）比较。所有图中p<0.05标*为统计学显著差异。

结果

ZnO NPs表征

为明确新鲜老化ZnO NPs理化特性差异，先用TEM观察NPs形貌（图1A）。结果显示20 nm新鲜ZnO NPs为近球形结晶，90-200 nm新鲜ZnO NPs为不规则棒状/立方结晶，单颗粒尺寸与制造商提供一致。两种尺寸ZnO NPs在超纯水中均倾向团聚。无论原始NPs形状尺寸，20 nm和90-200 nm ZnO NPs经60天老化后微观结构均从清晰晶体结构剧烈变为非晶或片状/针状。此外，Cu Kα辐射（λ=0.15418 nm）XRD（25°C）测定新鲜老化NPs晶体性质和相纯度（图1B）。新鲜ZnO NPs XRD图谱显示样品由晶体纤锌矿结构组成，无特征杂质峰，提示新鲜NPs高质量。老化NPs XRD图谱显示Zn₅(CO₃)₂(OH)₆（卡片号00-011-0287）和Zn(OH)₂（卡片号00-003-0888）新生固相，表明ZnO NPs（20和90-200 nm）老化过程中发生化学转化。

A_L细胞暴露新鲜老化ZnO NPs形态观察

NPs处理导致细胞形状或形态显著变化。A_L细胞暴露于10和15 µg/mL新鲜老化ZnO NPs 72小时后立体显微镜观察。图2显示对照组细胞形态正常，2小时内多贴壁，多为梭形或多边形，少数新分裂细胞胞质透明、分散较好。12 μg/mL新鲜ZnO NPs（20 nm & 90-200 nm）处理72小时显著改变细胞形态。虽多数3-5小时内贴壁但铺展不良，部分细胞变圆失去多边形。浓度增至15 μg/mL时细胞萎缩不贴壁，提示活率显著低于10 μg/mL。推测新鲜ZnO NPs 72小时处理LC₁₀₀可能<15 μg/mL。相反，20 nm和90-200 nm老化NP处理组（15 μg/mL）细胞形态无显著影响，大多存活细胞可贴壁铺展，死细胞<半数，揭示老化ZnO NPs细胞毒性远低于新鲜NPs。

老化ZnO NPs诱导细胞毒性低于新鲜NPs

用CCK-8试剂盒进一步探究新鲜老化ZnO NPs细胞毒性差异。图3显示A_L细胞梯度剂量（0-20 μg/mL，20 nm和90-200 nm）新鲜老化ZnO NPs孵育24、48、72小时细胞活率呈剂量依赖性下降。≤10 μg/mL ZnO NPs处理无明显细胞毒性。剂量升至12、15 μg/mL时细胞活率呈时间依赖性下降。老化NP处理组细胞活率显著高于新鲜NP组。此外ZnCl₂处理同样剂量和时间依赖性降低细胞活率，但细胞毒性远低于新鲜老化ZnO NPs。

新鲜ZnO NPs处理激活凋亡通路并上调凋亡基因表达

为揭示老化NPs低细胞毒性机制，分析新鲜老化ZnO NPs RNA测序数据。图4A、B显示新鲜ZnO NPs处理后Jurkat细胞（p=0.017）和HMDM细胞（p=0.041）激活凋亡通路。新鲜ZnO NP处理Jurkat细胞凋亡基因ANXA1、CYLD、TNFSF10、IER3、CDKN1A、JUN、SAT1、PMAIP1、CD38、ISG20显著富集。新鲜ZnO NP处理HMDM细胞凋亡基因CD38、TNFRSF12A、CCNA1、BMP2、PPP2R5B、EREG、IFNGR1、CD44、CD14、GNA15、GCH1、TIMP1、BTG2、IL1B、IL1A、BTG3、BCL2L11、SC5D、SPTAN1显著富集（图4C、D）。因Jurkat细胞（外周血T淋巴细胞）和HMDM细胞（人单核细胞源巨噬细胞）细胞类型不同，触发凋亡方式可能不同。总之新鲜ZnO NPs暴露可激活多种细胞不同凋亡通路。

老化ZnO NPs未像新鲜NPs那样上调凋亡基因表达

老化ZnO NP处理A_L细胞RNA测序数据显示p53、PI3k-Akt、FoXO、谷胱甘肽、ErbB、HIF-1、催产素和Jak-STAT信号通路富集（图5A）。Jurkat和HMDM细胞富集凋亡基因在老化ZnO NP处理细胞中无显著影响（图5B）。为进一步确证，实时PCR检测相关基因表达。发现部分凋亡基因BMP2、PMAIP1、IL1α、CD69、CCNA1、CD38、IL1β老化ZnO NPs处理A_L细胞中不可检测（数据未示），可能因多在免疫细胞表达。新鲜ZnO NP处理组上调凋亡基因（IL1α、IL1β、CD59）经老化ZnO NPs处理表达水平无显著变化。而作为阳性对照的MT1表达显著增加，Caspase 3表达无显著变化（图5C）。数据提示老化ZnO NPs不像新鲜NPs那样在A_L细胞中激活凋亡通路基因。

新鲜而非老化ZnO NPs增加活化半胱天冬酶3蛋白表达水平

Caspase 3基因表达检测不能直接指示凋亡通路激活。为进一步分析ZnO NPs处理是否改变凋亡蛋白水平，Western blot检测裂解半胱天冬酶3蛋白（常用指示细胞凋亡激活生物标志物）表达。图6显示与对照组相比，新鲜ZnO NPs（20 nm）处理使细胞裂解半胱天冬酶3蛋白水平增加1.31±0.023倍，显著高于老化20 nm ZnO NPs组（1.12±0.039倍）。新鲜ZnO NPs粒径增至90-200 nm时诱导裂解半胱天冬酶3蛋白表达增加1.46±0.078倍，显著大于老化NPs（1.07±0.075倍）。数据进一步阐明新鲜ZnO NPs诱导细胞凋亡效力高于老化NPs。

讨论

报道ZnO NPs自然老化过程经理化转化生成Zn₅(CO₃)₂(OH)₆并释放Zn²⁺。但老化ZnO NPs诱导细胞毒性及机制仍不清。为揭示新鲜老化ZnO NPs细胞毒性差异机制，进行RNA测序分析和RT-PCR测试，Western blot检测细胞凋亡关键执行者Caspase 3蛋白水平。

数据显示老化ZnO NPs在A_L细胞中诱导细胞毒性远低于新鲜ZnO NPs。本研究新鲜ZnO NPs（90-200 nm和20 nm）LC₁₀₀<15 μg/mL（图3），与前文ZnO NPs（19-36 nm）对NIH-3T3或MSTO细胞LC₁₀₀约15 μg/mL一致。证实NPs理化性质环境转化可剧烈改变毒性。报道ZnO NPs硫化改变电荷、疏水性、聚集状态，导致硫化态NPs在人唾液、汗液、支气管肺泡灌洗液吸附；ZnO NPs吸附蛋白形成特殊蛋白冠影响生物效应。生理溶液（如唾液）磷酸盐约5-10小时将ZnO NPs转化为亚稳态ZnHPO₄和Zn₃(PO₄)₂并对消化道上皮细胞显示细胞毒性。Ivask等证实体外暴露系统人T淋巴细胞（37°C，含10% FBS RPMI1640，24小时）中ZnO NPs（≤3 μg/mL）完全转化，转化产物光谱和细胞毒性与ZnSO₄一致。本结果显示ZnCl₂对A_L细胞剂量和时间依赖性毒性，但细胞毒性远低于新鲜老化ZnO NPs（图3）。进一步解释新鲜ZnO NP细胞毒性不完全归因于释放Zn²⁺。

前期研究也显示老化ZnO NPs诱导ROS（活性氧）效力较高，但杀伤细胞能力减弱。推测老化ZnO NPs诱导较低细胞毒性更易被哺乳动物细胞耐受。本研究RNA测序数据阐明凋亡基因在新鲜ZnO NP处理细胞上调，老化NP处理组影响小得多。IL1α和IL1β为白细胞介素1细胞因子家族成员。IL1α和IL1β释放部分依赖性激活Caspase 8诱导凋亡。CD69编码钙依赖性凝集素超家族II型跨膜受体成员。CD69表达增加与凋亡标志物annexin V和CD95（Fas）表达增加相关。JUN为AP-1转录因子亚基。JUN活性增加蛋白水解切割α-血影蛋白（白细胞介素1β转化酶ICE底物）和CED-3家族半胱氨酸蛋白酶，进一步导致程序性细胞死亡。这些凋亡基因表达升高揭示新鲜NPs通过多种方式触发凋亡。凋亡基因表达升高后，凋亡过程最终由凋亡蛋白执行（图7）。Caspase 3为多种凋亡场景核心蛋白酶；其裂解激活外源和内源凋亡通路均必需。因此检测裂解caspase 3是识别多种凋亡信号诱导凋亡常用方法。Western blot数据显示，20 nm和90-200 nm ZnO NPs亚致死暴露均未改变所有处理组原半胱天冬酶3水平。相反新鲜NPs处理显著升高裂解半胱天冬酶3，老化NPs对裂解caspase 3水平鲜有（或无）影响（图6）。结合RNA表达分析，结果清晰阐明新鲜ZnO NPs诱导细胞凋亡效力更高。

结论

本研究证实ZnO NPs在超纯水中自然理化转化，探究新鲜老化NPs诱导细胞毒性差异。重点分析老化ZnO NP处理A_L细胞RNA测序数据及数据库新鲜NPs数据。比较老化NP处理组特异性富集信号通路（区别于新鲜NP或ZnCl₂处理组）。数据表明老化ZnO NPs低细胞毒性与其诱导凋亡能力减弱密切相关，而NPs激活多通路转录调控促进哺乳动物细胞建立细胞稳态。