细胞凋亡途径在新鲜和老化氧化锌纳米颗粒诱导的细胞毒性中的作用

介绍

随着纳米技术在过去几十年的飞速发展，纳米粒子 (NPs) 已应用于各个领域，包括工业、人类日常生活和纳米医学 [1, 2]。纳米技术消费品清单 (CPI) 显示，纳米产品的数量在 2005 年至 2015 年间增长了 30 倍，其中包括 762 种健康（健身）产品、72 种食品（饮料）和 23 种婴儿产品 [2]。纳米颗粒在消费品和各个领域的应用越来越多，增加了纳米颗粒进入环境的可能性，从而引发了对其潜在不利影响的安全担忧。氧化锌 (ZnO) NPs 是最常用的 NPs 之一，其全球年产量已达到近 3400 吨 [3, 4]。一些以前被认为具有生物惰性的物质在其纳米颗粒状态下可能会变得有毒。越来越多的研究表明，ZnO NPs 可能通过诱导显着毒性对哺乳动物细胞和动物构成显着风险 [5,6,7]。

包括涂层、表面功能化和氧化态修饰在内的各种策略已被用于通过改变纳米颗粒的物理和化学性质（如细胞膜的溶解、聚集和扰动）来减弱纳米颗粒的潜在毒性[8,9,10， 11]。尽管 NPs 的这些修饰在一定程度上削弱了它们的毒性作用，但 NPs 的使用并不总是安全的，尤其是在某些暴露条件和环境下 [12,13,14]。实际上，许多NPs在有意或无意释放到自然环境中后，并不稳定，容易发生“老化”或“环境转变”[14,15,16,17]。近年来，人们开展了大量工作来探索纳米颗粒的环境转化过程；然而，关于“转化（老化）”NPs毒性作用的研究还很有限，更不用说其毒性机制了。

作为非持久性NPs的典型代表，ZnO NPs具有非常高的反应活性，在释放到环境中或被动物摄入后，容易发生理化性质和发生状态的转变，从而显着影响其毒理作用[17]。 , 18]。例如，研究表明ZnO NPs的硫化过程改变了电荷、疏水性和聚集态，导致硫化物NPs在人的唾液、汗液和支气管肺泡灌洗液中被吸附。此外，ZnO NPs 吸附的蛋白质形成特殊的蛋白质冠，通常会影响其生物学效应[19]。生理溶液中的磷酸盐可以在大约 5-10 小时内将 ZnO NPs 转化为亚稳定的 ZnHPO4 和 Zn3(PO4)2 [20]。通过使用同步辐射 X- 研究了在体外暴露系统中 ZnO NPs（≤ 3 μg/mL）对人 T 淋巴细胞（37°C，含有 10% FBS 的细胞培养基 RPMI1640，培养 24 小时）的完全转化过程。射线吸收近边结构光谱 (XANES) [21]。上述研究表明，仅通过评估原始（新鲜）ZnO NPs 的生物学效应，低估了ZnO NPs 的环境和健康风险。针对这一问题，迫切需要全面了解NPs的老化和环境转化过程[22]。

我们之前的研究表明，在超纯水中老化 40-120 天的 ZnO NPs 会发生物理化学转化并转化为 Zn5(CO3)2(OH)6、Zn (OH)2 和 Zn ²⁺ [23]。有趣的是，老化的 ZnO NPs 表现出低于新鲜对应物的细胞毒性 [23]，但这种变异的毒性机制尚不清楚。在本研究中，我们着手探索新鲜和老化 ZnO NPs 之间不同细胞毒性的根本原因。系统地应用了具有两种不同粒径（20 纳米和 90-200 纳米）的 ZnO NP。细胞毒性试验表明，与新鲜的 ZnO 纳米颗粒相比，老化的 ZnO 纳米颗粒诱导的形态异常不太明显，细胞活力相对较高。 RNA 测序数据显示，凋亡基因在新鲜 ZnO NP 处理的细胞中富集，而这些基因受老化 ZnO NP 处理的影响要小得多。此外，暴露于老化 ZnO NPs 的细胞显示裂解的 Caspase-3 蛋白水平降低，进一步表明新鲜 ZnO NPs 在诱导培养细胞凋亡方面具有更高的效力。结合我们之前的研究结果，本研究表明老化的ZnO NPs的细胞毒性降低是由于其触发细胞凋亡的能力减弱。

材料和方法

纳米粒子和试剂

市售的 ZnO 纳米粉末 (ZnO NP)，制造商报告的平均尺寸为 20 nm（纯度 99.5%，接近球形）和 90-200 nm（纯度 99.9%，不规则形态），购自 Nanostructured &Amorphous Materials（休斯顿，德克萨斯州） ）。除另有说明外，本研究中使用的所有试剂和化学品均购自Sigma-Aldrich（中国上海）。

纳米粒子分散、老化和表征

通过将干燥的纳米粉末悬浮在 Milli-Q 中制备 ZnO NPs 库存悬浮液 (1 mg/mL) H2O（Millipore，18 MΩ cm）并通过高压灭菌（120°C，30 分钟）灭菌，然后在 25°C 下储存 0 至 60 天的自然老化期。 0 天和 60 天自然转化的 ZnO NPs 分别被指定为新鲜和老化的 NPs。为确保适当的分散，在表征或与细胞孵育之前，将新鲜和老化的悬浮液在超声波浴中超声处理 (100 W) 30 分钟。使用透射电子显微镜（TEM，JEOL JEM-2010，Tokyo，Japan）表征新鲜和老化的 ZnO NPs 的形态、粒径和聚集。通过与真实标准进行比较，使用功率 X 射线衍射（XRD，PANalytical B.V.，Shanghai，China）确定新鲜和老化的 ZnO NPs 的晶体结构。 ZnO NPs 的自然老化过程和表征的细节已经在前面描述过[23]。

细胞培养和 ZnO 纳米颗粒处理

A L细胞系，一种由gly2A融合形成的人-仓鼠杂交细胞 本研究使用了中国仓鼠卵巢 (CHO) 和人成纤维细胞的突变体。这些杂交细胞包含一组标准的 CHO-K1 染色体和一个单拷贝的人 11 号染色体，并在补充有胎牛血清（8%，Hyclone，Grand Island，NY）的 Ham's F12 培养基（Hyclone，Grand Island，NY）中培养)、庆大霉素 (25 g/mL) 和甘氨酸 (2 × 10 ^–4 M) 在 37°C 下，在加湿的 5% CO2 培养箱中 [24]。新鲜和老化的 ZnO NP 的储备悬浮液通过 30 分钟的超声波处理 (100 W) 分散以防止团聚，随后用细胞培养基稀释到适当的浓度以暴露细胞。各实验均以无NPs的细胞培养基中培养的细胞为对照。

细胞毒性检测方法

A 处于对数生长期的 L 细胞在 35 毫米培养皿（6 × 10 ⁴ 细胞/培养皿）在刺激前 24 小时，然后用 2 毫升含有 1、5、10、12、15 和 20 微克/毫升新鲜或老化 ZnO 纳米颗粒的培养基处理 72 小时。处理时间结束后，使用 Leica DM4B 显微镜（Leica，德国）获取细胞形态图像。将ZnCl2作为锌离子参考，用于比较与ZnO NPs的细胞毒性。

细胞计数试剂盒（CCK-8）（APExBIO，上海，中国）用于检测细胞活力。详细来说，A L细胞接种于96孔板（4 × 10 ³ 细胞/孔）用细胞培养基培养 24 小时，并用含有不同浓度 ZnCl2、新鲜和老化的 ZnO NP 的培养基分别处理 24、48 和 72 小时。对于工作溶液，从原液悬浮液中添加的 NPs 的体积小于每孔培养基总体积的 5%。处理时间结束后，吸出培养基，按照制造商的说明，将细胞与 100 µL CCK-8 工作溶液在 37°C 下孵育 2 小时。然后，使用 Spectra Max M2 荧光读取器（Molecular Devices, Wokingham, Berks, UK）在 450 nm 处记录吸光度。细胞活力计算为孔中吸光度的百分比，每个浓度的 NPs 归一化为对照细胞的吸光度（100%）。

RNA 提取、逆转录和定量 PCR

A 将处于对数生长期的 L 细胞接种到直径 35 mm 的培养皿中（6 × 10 ⁴ 细胞/培养皿）与细胞培养基一起培养 24 小时。然后，将培养基更换为 2 mL 含有 12 µg/mL ZnCl2、新鲜和老化的 ZnO NPs 的培养基，持续 72 小时。处理时间结束后，吸出培养基，用PBS洗涤细胞3次。随后，根据制造商的说明，将 1 mL Trizol 试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）加入到每个培养皿中以提取总 RNA。使用 Q5000UV-Vis 分光光度计 (Quawell, USA) 对提取后获得的总 RNA 的浓度和纯度进行定量。定量后，使用 TransGene RT-PCR 试剂盒（TransGene Biotech，Beijing，China）进行逆转录，根据制造商的方案从 RNA 模板中获得 cDNA。所得的 cDNA 样品使用 Q5000 紫外-可见分光光度计进行定量，然后使用 SYBR-Green 作为荧光染料（TransGene Biotech，北京，中国）在 Roche RT-PCR 系统（Applied Biosystems）上进行分析 [25]。

编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Gapdh ) 用作评估Il-1α的内部对照 , Il-1β , 半胱天冬酶 3 , CD69 , 君 和 MT1 mRNA 表达。结果表示为目标基因与Gapdh的相对表达比 .本研究所用引物序列见表1。

RNA测序数据分析

A的总RNA样本 来自对照组、老化ZnO NP处理组和ZnCl2处理组的L细胞由邦飞生物科学（中国北京）测序。简而言之，A的总RNA 按照 TRIZOL 方案提取 L 细胞，直到异丙醇沉淀。然后，在测序前将 RNA 样品重新悬浮在提取缓冲液中。使用 R 包 Deseq2 [Eric1] 分析原始计数 RNA 测序数据。维恩图是由 R 包 VennDiagram [Eric1.2] 生成的。显着变化的基因用于进一步的通路富集分析。实验进行了三个独立的重复。 rRNA 基因、线粒体基因和检测到的小于 40 bp 的基因被排除在分析之外。

RNA 测序数据，参考系列 GSE97852、GSE60159 和 GSE39444，来自 Gene Expression Omnibus [Eric 2, 3, 4]。基因集富集分析图由 R（版本 3.6.2）使用 fgsea 包 [Eric 5] 生成。 1.5倍显着变化的凋亡基因 &p 值 <0.05 用于进一步分析。带有基因树的热图由 R 包“ComplexHeatmap” [Eric 6] 生成。聚类方法使用平均连锁，距离测量方法使用欧几里得。使用STRING2.0 [Eric 7]进行通路富集分析。

蛋白质印迹

A 将处于对数生长期的 L 细胞接种到直径为 60 mm 的培养皿中（1.5 × 10 ⁵ 细胞/培养皿）与细胞培养基一起培养 24 小时。然后，将培养基更换为 4 mL 含有 12 µg/mL 新鲜或老化 ZnO 纳米颗粒的培养基，持续 24 小时。在暴露期结束时，吸出培养基，然后用PBS洗涤细胞3次并用RIPA裂解缓冲液（Beyotime，China）在冰上裂解以收集细胞蛋白。在 12% SDS-PAGE 凝胶上分离等量的细胞蛋白，然后转移到聚偏二氟乙烯 (PVDF) 膜（Roche，Swiss）上。简而言之，在 25°C 下用 TBST 中的 5% 脱脂牛奶封闭 2 小时后，随后将膜与适当稀释度（根据制造商的方案）的一抗在 4°C 下孵育过夜，然后与 HRP 偶联的二抗孵育抗体（1:5000，Promega，Madison，USA）在 25°C 下孵育 2 小时。最后，使用增强型化学发光 (ECL)（BOSTER，中国）溶液检测免疫标记。 anti-pro/cleaved Caspase-3和anti-Actin的一抗分别购自Cell Signaling Technology和ImmunoWay。

统计数据

统计分析是根据从至少三个独立实验获得的结果的平均值编制的。所有数据均表示为平均值 ± 标准偏差 (SD)，并使用单向方差分析 (ANOVA) 进行统计比较。在所有地块 p 值 <0.05 表示为*，认为具有统计学意义。

结果

氧化锌纳米颗粒的表征

为了确定新鲜和老化 ZnO NPs 之间详细物理化学特征的差异，我们首先使用 TEM 观察了 NPs 的形态（图 1A）。我们的结果表明，20 nm 的新鲜 ZnO NPs 是近乎球形的晶体，而 90-200 nm 的新鲜 ZnO NPs 是不规则的棒状/立方体晶体。单一粒径与厂家提供的粒径一致。显然，20 nm 和 90-200 nm ZnO NPs 都倾向于在超纯水中聚集。此外，无论原始 NPs 的形状和大小如何，20 nm 和 90-200 nm ZnO NPs 的微观结构在老化 60 天后都从清晰的晶体结构显着改变为无定形或片状/针状状态。此外，通过使用 X 射线衍射 (XRD) 和 Cu Kα 辐射 (λ =0.15418 nm) 在 25°C 接近，如图 1B 所示。新鲜 ZnO NPs 的 XRD 谱表明样品由结晶纤锌矿结构组成，未发现特征杂质峰，表明新鲜 NPs 的质量很高。对于老化的纳米颗粒，XRD 谱显示出 Zn5(CO3)2(OH)6（卡片编号 00-011-0287）和 Zn（OH）2（卡片编号 00-003-0888）固相的新形成，表明化学ZnO NPs（20和90-200 nm）在老化过程中的转变。

新鲜和老化 ZnO NPs 的理化特性。 A Milli-Q 中新鲜和老化 NP（100 μg/mL，20 和 90–200 nm）的代表性显微照片 使用低分辨率 TEM，B 干燥形式的新鲜纳米颗粒、老化纳米颗粒、ZnO、Zn (OH)2 和 Zn5(CO3)2(OH)6 参比物的 XRD 图

A 的形态观察 L 细胞暴露于新鲜和老化的 ZnO NPs

NPs 的处理导致体外细胞形状或形态的显着变化 [26]。因此，A 在立体显微镜下检查暴露于 10 和 15 µg/mL 的新鲜或老化 ZnO NP 72 小时的 L 细胞。如图 2 所示，对照组的细胞形态保持正常。细胞粘附良好，大多数在 2 小时内粘附。多数细胞呈纺锤形或多角形，少数新分裂的细胞在贴壁过程中胞浆更透明，分散性更好。用 12 μg/mL 新鲜 ZnO NP（20 nm 和 90-200 nm）处理 72 小时显着改变了细胞形态。虽然大多数细胞在 3-5 小时内粘附，但它们不能很好地扩散，一些细胞变圆并失去多边形形状。当 ZnO NPs 的浓度增加到 15 μg/mL 时，处理过的细胞萎缩且无法粘附，表明它们的细胞活力明显低于用 10 μg/mL 处理的细胞。这些结果表明，处理 72 小时后，新鲜 ZnO NP 的 LC100 可能低于 15 μg/mL。相比之下，20 nm 和 90-200 nm 老化 NP 处理组（15 μg/mL）的细胞形态没有受到显着影响，大多数存活细胞可以粘附和扩散，观察到不到一半的死细胞，揭示了老化的ZnO NPs的细胞毒性远低于新鲜的ZnO NPs。

A 的形态变化 在补充的 Ham's F12 培养基中暴露于新鲜或老化的 ZnO NPs 72 小时后的 L 细胞，未暴露的细胞用作对照组。 A 光学显微镜10 × 放大倍数观察L细胞形态

与新鲜 NPs 相比，老化的 ZnO NPs 诱导的细胞毒性更低

为了进一步研究新鲜和老化 ZnO NPs 之间细胞毒性的差异，我们使用 CCK-8 试剂盒检查了细胞活力。如图 3 所示，孵化 A 具有梯度剂量的新鲜和老化 ZnO NP（范围从 0 到 20 μg/mL、20 nm 和 90-200 nm）的 L 细胞在 24 小时、48 小时或 72 小时内显示出细胞活力的剂量依赖性降低。通过用 ZnO NPs ≤ 10 μg/mL 处理细胞，未观察到明显的细胞毒性。当新鲜和老化的 ZnO NPs 的用量分别增加到 12 和 15 μg/mL 时，细胞活力呈时间依赖性下降趋势。显然，老年NP处理组的细胞活力显着高于新鲜NP处理组。此外，ZnCl2 处理还以剂量和时间依赖性方式损害细胞活力，而 ZnCl2 的细胞毒性远低于新鲜和老化的 ZnO NPs。

A中新鲜和老化的ZnO NPs诱导的细胞活力 L细胞。 A L 细胞与不同浓度的新鲜和老化的 ZnO 纳米颗粒（20 和 90-200 nm）孵育 24 小时（A ), 48 小时 (B ) 和 72 小时 (C ）。 D A L 细胞暴露于不同浓度的 ZnCl2 中不同时间。数据基于 ≥ 3个独立实验，并表示为平均值 ± SD，*p <0.05

新鲜氧化锌纳米颗粒的处理激活凋亡通路并上调凋亡基因的表达

为了揭示导致老化 NPs 降低细胞毒性的潜在机制，我们分析了来自新鲜和老化 ZnO NPs 的 RNA 测序数据。如图 4A、B 所示，用新鲜的 ZnO NPs 处理后，Jurkat 细胞中的凋亡通路被激活（p =0.017) 和 HMDM 细胞 (p =0.041)。凋亡基因：ANXA1 , CYLD , TNFSF10 , IER3 , CDKN1A , JUN , SAT1 , PMAIP1 , CD38 和 ISG20 在新鲜的 ZnO NP 处理的 Jurkat 细胞中显着富集。凋亡基因：CD38 , TNFRSF12A , CCNA1 , BMP2 , PPP2R5B , EREG , IFNGR1 , CD44 , CD14 , GNA15 , GCH1 , TIMP1 , BTG2 , IL1B , IL1A , BTG3 , BCL2L11 , SC5D 和 SPTAN1 在新鲜的 ZnO NP 处理的 HMDM 细胞中显着富集（图 4C、D）。由于 Jurket 细胞（外周血 T 淋巴细胞）和 HMDM 细胞（人单核细胞衍生的巨噬细胞）是不同种类的细胞，它们触发细胞凋亡的方式可能不同。总之，这些结果表明，新鲜ZnO NPs的暴露可以激活各种细胞的不同凋亡途径。

凋亡途径在新鲜 ZnO NP 处理的 Jurket 和 HMDM 细胞的 RNA-seq 数据中得到丰富。新鲜ZnO NP处理的Jurket细胞凋亡途径显着表达基因的富集评分（A ) 和 HMDM 细胞 (B ）。 ZnO NP处理的新鲜Jurket细胞凋亡基因表达热图（C ) 和 HMDM 细胞 (D ) 及其对照组

老化的 ZnO NPs 没有上调新鲜 ZnO NPs 时凋亡基因的表达

我们的 RNA 测序数据来自老化的 ZnO NP 处理的 A L 细胞显示 p53、PI3k-Akt、FoXO、谷胱甘肽、ErbB、HIF-1、催产素和 Jak-STAT 信号通路富集（图 5A）。 Jurket 和 HMDM 细胞中富集的凋亡基因在老化的 ZnO NP 处理细胞中没有受到显着影响（图 5B）。为了进一步证实这些发现，我们通过实时 PCR 测试了相关基因的表达。我们发现一些凋亡基因：BMP2 , PMAIP1 , IL1α , CD69 , CCNA1 , CD38 和 IL1β 在老化的 ZnO NPs 处理的 A 中检测不到 L 细胞（数据未显示），可能是因为这些基因中的大多数在免疫系统细胞中表达。其他上调凋亡基因（IL1α , IL1β 和 CD59 ) 在新鲜 ZnO NP 处理组中观察到的表达水平没有因老化的 ZnO NP 处理而显着改变。而 MT1 作为阳性对照的表达水平显着增加，Caspase 3的表达 没有显着变化（图 5C）。这些数据表明，老化的 ZnO NPs 与新鲜的 ZnO 纳米颗粒不同，在激活 A 中的细胞凋亡通路基因方面的效力较低 L细胞。

老化氧化锌纳米颗粒处理的 A 的 RNA-seq 数据中未富集细胞凋亡途径 L细胞。 (A ) ZnO NP 处理的老化A 富集通路的基因本体分析 L细胞。 (B ) ZnO NP 处理的老化A 细胞凋亡基因表达的热图 L细胞和对照组。 (C ) 选择的凋亡基因和控制基因 (MT1 ) 在新鲜和老化的 ZnO NP 处理的 A 中 L细胞

新鲜但未老化的 ZnO NPs 增加了活化的 Caspase 3 蛋白的表达水平

Caspase 3基因表达检测 单独不能直接表明细胞凋亡途径的激活。为了进一步分析 ZnO NPs 的处理是否可以改变凋亡蛋白的水平，通过蛋白质印迹分析检查了裂解的 Caspase 3 蛋白的表达，这是一种常用的指示细胞凋亡激活的生物标志物 [27]。如图 6 所示，与对照组相比，新鲜的 ZnO NPs（20 nm）处理使裂解的 Caspase 3 蛋白的细胞水平增加了 1.31 ± 0.023 倍，显着高于老化的 20 nm ZnO NPs-治疗组（1.12 ± 0.039倍）。当新鲜 ZnO NPs 的粒径增加到 90-200 nm 时，新鲜 NPs 诱导的裂解 Caspase 3 蛋白的表达增加了 1.46 ± 0.078 倍，显着高于老化 NPs（1.07 ± 0.075 倍） .这些数据进一步说明，与陈旧的纳米颗粒相比，新鲜的氧化锌纳米颗粒在诱导细胞凋亡方面具有更高的效力。

A 中的细胞凋亡水平 L 细胞与新鲜和老化的 ZnO NP（20 和 90-200 nm）一起孵育。蛋白质印迹分析 (A ) 和量化 (B ) 当细胞与 12 μg/mL 新鲜和老化的 ZnO NP（20 和 90-200 nm）一起孵育 72 小时时，裂解的 Caspase 3 蛋白水平。数据基于 ≥ 3个独立实验，并表示为平均值 ± SD，*p <0.05

讨论

据报道，随着 Zn ²⁺ 的释放，ZnO NPs 发生物理化学转化为 Zn5(CO3)2(OH)6 在自然老化过程中 [23, 28]。然而，由转化（老化）ZnO NPs 诱导的细胞毒性及其潜在机制仍不清楚。在这里，为了揭示新鲜和老化 ZnO NPs 之间不同细胞毒性的机制，进行了 RNA 测序分析和 RT-PCR 测试。并应用Western blotting检测细胞凋亡的关键执行者Caspase 3的蛋白水平。

我们的数据表明，在A中，老化的ZnO NPs比新鲜的ZnO NPs诱导的细胞毒性要小得多 L细胞。在我们目前的研究中，新鲜 ZnO NPs（90-200 nm 和 20 nm）的 LC100 均低于 15 μg/mL（图 3），这与之前的发现一致，即 19-36 nm ZnO NPs 的 LC100 NIH-3T3 或 MSTO 细胞的浓度约为 15 μg/mL [29]。我们证实，NPs 理化性质的环境变化可以显着改变它们的毒性。据报道，ZnO NPs的硫化过程改变了它们的电荷、疏水性和聚集态，导致硫化物NPs在人的唾液、汗液和支气管肺泡灌洗液中被吸附。而ZnO NPs吸附的蛋白质形成了特殊的蛋白质冠，影响了其生物学效应[19]。广泛存在于生理溶液（如唾液）中的磷酸盐可以在约 5-10 小时内将 ZnO NPs 转化为亚稳定的 ZnHPO4 和 Zn3(PO4)2，并对消化道上皮细胞显示出细胞毒性 [20]。伊瓦斯克等人。使用同步辐射 X 射线吸收证明了在体外暴露系统中 ZnO NPs（≤ 3 μg/mL）对人 T 淋巴细胞（37°C，含有 10% FBS 的细胞培养基 RPMI1640，培养 24 小时）发生了完全转化近边结构光谱（XANES）。转化产物的光谱和细胞毒性与 ZnSO4 的一致 [21]。我们的研究结果揭示了 ZnCl2 对 A 的剂量和时间依赖性毒性 L 细胞，其细胞毒性远低于新鲜和老化的 ZnO NP（图 3）。该观察进一步解释了新鲜ZnO NP的细胞毒性并不完全归因于其释放的Zn ²⁺ 的发现 [30].

我们之前的研究还表明，与新鲜的 ZnO NPs 相比，老化的 ZnO NPs 在引发 ROS（活性氧）方面表现出更高的效力，并且杀伤细胞的能力减弱 [23]。我们推断由老化的 ZnO NPs 诱导的较低细胞毒性在哺乳动物细胞中可能更容易耐受。目前对 RNA 测序数据的研究表明，凋亡基因在新鲜 ZnO NP 处理的细胞中上调，在老年 NP 处理组中它们受到的影响要小得多。 IL1α 和 IL1β 是白细胞介素 1 细胞因子家族的成员。 IL1α 和 IL1β 的释放激活 Caspase 8 部分依赖的细胞凋亡 [31]。 CD69 编码 II 型跨膜受体的钙依赖性凝集素超家族的成员。 CD69 表达的增加与细胞凋亡膜联蛋白 V 和 CD95 (Fas) 标志物的表达增加有关 [32]。 JUN 是 AP-1 转录因子亚基。增加的 JUN 活性蛋白水解地裂解 α-fodrin（白细胞介素 1β 转换酶 (ICE) 的底物）和 CED-3 半胱氨酸蛋白酶家族，这进一步导致程序性细胞死亡 [33]。这些凋亡基因表达的增加表明，新鲜的 NPs 以几种不同的方式触发细胞凋亡。在这些凋亡基因表达升高后，凋亡过程最终由凋亡蛋白执行（图 7）。 Caspase 3 是各种凋亡场景的核心蛋白酶；这种蛋白质的裂解对于激活外在和内在细胞凋亡途径是必要的 [34, 35]。 Therefore, detection of cleaved caspase 3 is a common method for identifying apoptosis induced by a wide variety of apoptotic signals [36]. Our Western blotting data revealed that, for both 20 nm and 90–200 nm ZnO NPs, sublethal exposure did not alter the level of Pro caspase 3 in all treatment groups. In contrast, cleaved Caspase 3 was significantly elevated by fresh NPs treatment, where aged NPs showed few (if any) effects on the level of cleaved caspase 3 (Fig. 6). Combined with RNA expression analysis, our results clearly elucidated the higher potency of fresh ZnO NPs in inducing cell apoptosis.

Model for Fresh ZnO NPs but not aged ZnO NPs induces Caspase 8- and Caspase 3-dependent apoptosis. The increased expression of apoptotic gene CD69 activates Fas and apoptosis annexin V expression in fresh ZnO NP-exposed mammalian cells. The increased expression of apoptotic gene IL1α and IL1β partially activates Caspase 8-dependent apoptosis. It further causes activation of Caspase 3 and induces apoptosis. All these changes in mRNA and protein level were not detectable in aged ZnO NPs-exposed mammalian cells

结论

In the present study, the natural physicochemical transformation of ZnO NPs in ultrapure water was confirmed, and variations in cytotoxicity induced by fresh &aged NPs were investigated. We focused on RNA sequencing data from our aged ZnO NP-treated A L cells and that of fresh NPs from database. We compared those signaling pathway specifically enriched in aged NP-treated group, which are different from that of fresh NP- or ZnCl2-treated groups. Our data indicated that the lower cytotoxicity of aged ZnO NPs is closely related to its attenuated ability in inducing apoptosis, while the transcriptional regulation of the multiple pathways activated by NPs promotes the establishment of cellular homeostasis in mammalian cells.

数据和材料的可用性

不适用。

缩写

NP：

Nanopowders

氧化锌：

氧化锌

Zn5(CO3)2(OH)6 :

Hydrozincite

Zn (OH)2 :

Zinc hydroxide

ZnCl2 :

Zinc chloride

ZnSO4 :

Zinc sulfide

ZnHPO4 :

Zinc hydrogen phosphate

Zn3(PO4)2 :

Zinc phosphate

A L cells:

Human–hamster hybrid cells

CHO cells:

Chinese hamster ovary cells

Jurket cells:

Peripheral blood T lymphocyte cells

HMDM cells:

Human monocyte-derived macrophages

NIH-3T3cells:

Mouse embryonic cells

MSTO cells:

Human lung cancer cells

RPMI1640:

Roswell Park Memorial Institute 1640

ICE:

Interleukin 1beta-converting enzyme

CED-3:

Caenorhabditis elegans death gene

IL1α:

Interleukin 1alpha

IL1β:

Interleukin 1beta

mRNA:

Messenger ribonucleic acid

cDNA:

Complementary deoxyribonucleic acid

FBS：

胎牛血清

TEM：

透射电子显微镜

XRD：

X射线衍射

RT-PCR:

Real-time polymerase chain reaction

CPI:

The Nanotechnology Consumer Product Inventory

XANES:

Synchrotron radiation X-ray absorption near-edge structure spectroscopy

RIPA:

Radio immunoprecipitation assay

SDS-PAGE:

Polyacrylamide gel electrophoresis

PVDF：

聚偏二氟乙烯

ECL:

Enhanced chemiluminescence

CCK-8:

Cell counting kit-8