使用活性氧种类敏感的纳米纤维垫抑制胆管癌细胞

背景

胆管癌 (CCA) 通常起源于胆管区域，被认为是最具侵袭性的癌症之一 [1,2,3]。尽管其发病率在世界范围内呈上升趋势，但其致癌和发病率增加的原因仍不清楚[1]。由于大多数CCA患者经常被诊断为晚期，因此很少有CCA患者适合手术切除[2]。已经尝试了各种治疗方案，例如放疗、化疗、金属支架移位和免疫辅助疗法来治疗 CCA 患者 [3,4,5,6,7,8,9]。由于胆管被肿瘤生长或炎症阻塞，因此经常采用支架移位来防止胆管闭塞并在上述治疗中延长患者的生存期 [10, 11]。然而，金属支架没有治愈作用，支架内的肿瘤过度生长通常会导致胆道梗阻。为了解决这些问题，许多科学家研究了药物洗脱支架 (DES) [12,13,14,15]。例如，Lee 小组在过去十年中研究了紫杉醇洗脱胃肠 (GI) 支架 [12,13,14,15]。尽管与覆膜金属支架相比，紫杉醇洗脱支架在支架通畅性和患者存活率方面几乎没有差异，但他们在猪的可行性和安全性研究中观察到紫杉醇洗脱支架的可接受性 [13,14,15]。金等人。使用酪氨酸蛋白激酶抑制剂索拉非尼 (sorafenib) 使用动物肿瘤异种移植模型研究了针对 HuCC-T1 CCA 细胞的 DES，并且索拉非尼洗脱支架在动物肿瘤异种移植模型中具有抑制肿瘤生长的作用 [16]。郭等人。据报道，组蛋白去乙酰化酶 (HDAC) 抑制剂 (vorinostat) 洗脱支架可有效抑制 HDAC 的表达，诱导乙酰化组蛋白 (Ac-histone)，进而抑制荷有 CCA 细胞的小鼠模型中的肿瘤生长 [17]。 DES 与新型抗癌剂或分子靶向剂仍然是延长患者生存期的有吸引力的选择。此外，还专门研究了刺激敏感的纳米纤维垫或纳米材料来提供抗癌剂 [18,19,20]。基于热敏聚合物的纳米纤维，如聚（二（乙二醇）甲基醚甲基丙烯酸酯）（PDEGMA）或聚（N -异丙基丙烯酰胺）聚（NIPAM）共聚物可用于局部疾病部位的温度敏感药物释放[18, 19]。贝拉特等人。据报道，自组装肽纳米纤维在减少 RES 捕获的情况下具有出色的肿瘤靶向性 [20]。

生物医学领域已广泛研究了疾病中 ROS 的产生与细胞抗氧化防御系统之间的失衡 [21,22,23,24]。特别是，癌症中的氧化应激也被广泛研究并应用于氧化还原敏感的药物递送系统 [23,24,25]。例如，当纳米粒子的聚合物骨架中的硫醚基团暴露于 ROS 时，它可以从疏水性变为亲水性，而 ROS 可切换的纳米粒子可适用于富含 ROS 环境的疾病 [25, 26]。余等人。据报道，通过 ROS 响应聚合物胶束可以实现特定的内体递送到癌细胞中，即共聚物可以在富含 ROS 的环境中从疏水性转变为亲水性，这种现象在更高的抗癌活性后诱导抗癌药物的快速释放 [27] .我们之前还报道过，与光敏剂本身相比，氧化还原响应性纳米光敏剂特异性释放具有谷胱甘肽 (GSH) 响应性的光敏剂，然后诱导更高的 ROS 生成 [28]。在最近的研究中，已知具有二硒键的聚合物胶束通过二硒键的崩解具有 ROS 触发的药物释放，并显示出 ROS 特异性抗癌活性 [29]。 ROS触发的纳米粒子被认为是一种很有前景的抗癌化疗平台。

Piperlongumine (PL)，一种源自Piper longum的天然化学物质 , 具有良好的抗癌活性，对正常细胞的细胞毒性低 [30]。拉杰等人。据报道，PL 的癌细胞选择性毒性是由于 PL 相对于正常细胞在癌细胞中选择性地产生 ROS； PL 在癌细胞中诱导 DNA 损伤和线粒体形态/功能的改变 [30]。已经研究了 PL 对各种癌细胞的抗癌活性 [31,32,33,34,35]。熊等人。据报道，PL 显着增加 ROS，然后通过诱导凋亡蛋白有效抑制原发性髓系白血病细胞 [35]。尽管 PL 对正常细胞和器官的毒性较低，但它对肾脏有一些不利影响 [36, 37]。此外，PL在血流中的短半衰期也有待改善[38]。

在这项研究中，我们制造了一个氧化还原响应纳米纤维涂层支架，并将 PL 加载到纳米纤维垫中。对于氧化还原响应性，合成了具有二硒化物键的 LEse 嵌段共聚物并用于制造用于 DES 的纳米纤维垫。肿瘤区域ROS含量增加可能加快药物释放速率，促进ROS介导的癌细胞死亡。

材料和方法

材料

PL 购自 LKT 实验室。公司（美国明尼苏达州）。聚（L-丙交酯）（PLA，PLA-0005，M.W. =5000 g/mol，来自制造商的数据）购自 Wako Pure Chem。 Co. Ltd.（日本大阪）。甲氧基聚（乙烯利醇）-琥珀酰亚胺戊二酸酯（MePEG-NHS，M.W. =5000 g/mol）购自 Sunbio Co. Ltd.（韩国首尔）。胆道硅膜覆膜支架购自 M.I.技术。 （韩国平泽市）。聚（ε-己内酯）（PCL，数均 MW =80,000 g/mol），N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），N-（3-二甲氨基丙基）-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDAC），四氢呋喃（THF），氯仿、二甲基亚砜 (DMSO)、3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑 (MTT) 和硒代胱胺二盐酸盐购自 Sigma-Aldrich Chemical Co., (St. Louis, MO ， 美国）。透析膜或透析装置（截留分子量 (MWCO) 1000 g/mol 和 8000 g/mol）购自 Spectrum/Por Lab., Inc. (CA, USA)。所有有机溶剂和其他化学品均用作超纯级。细胞培养用品如 RPMI1640 培养基和胎牛血清 (FBS) 购自 Life Tech。 Inc.（美国纽约州格兰德岛）。所用试剂及有机溶剂均为HPLC级。

LEse 嵌段共聚物的合成

MePEG-硒代半胱胺结合物

将 MePEG-NHS (500 mg) 溶解在 20 mL DMSO 中。将超过 5 当量的硒代胱胺分别溶解在 15 mL 去离子水中并与 5 mL DMSO 混合。之后，将硒代胱胺溶液缓慢滴加到MePEG-NHS溶液中，然后磁力搅拌24 h。此后，将反应物引入透析管（MWCO 1000 g/mol），然后在大量水中透析 2 天。将透析溶液冻干 2 天。冻干固体用于合成嵌段共聚物。

嵌段共聚物合成

将 PLA（500 mg）溶解在 20 mL DMSO 中，并含有等量的 EDAC 和 NHS。将该溶液磁力搅拌12 小时。向该溶液中加入mPEG-硒代胱胺固体(530 mg)并进一步搅拌2 天。此后，将反应物引入透析管（MWCO：8000 g/mol），然后在大量水中透析 2 天。将透析溶液冻干 2 天。冻干产物在甲醇中沉淀以再次去除未反应的mPEG-硒代胱胺。最终收率高于94%。收率 =[（冻干固体的重量）/（PLA的重量 + mPEG-硒代胱胺的重量）] × 100。

聚合物的表征

监测聚合物合成， ¹ 使用 H-核磁共振 (NMR) 光谱。聚合物以 DMSO-d 形式溶解并用 ¹ 测量 H-NMR 光谱（500 MHz 超导 FT-NMR 光谱仪，UnityInova 500，Varian Inc. Agilent Tech., CA, USA）。

聚合物的分子量使用凝胶渗透色谱法（GPC，Waters GPC 系统，MA 01757，美国）测量：Waters 1515 HPLC 溶剂泵、Waters 2414 示差折光检测器和三个 Waters Styragel 高分辨率色谱柱（HR4、HR2、HR1 ）。将聚合物溶解在含有 0.1 N LiBr 作为洗脱液的超纯 THF 中（流速 1.0 mL/min）。使用聚苯乙烯制作校准曲线。

PL-Loaded Nanofiber Mats and Coated on the GI Stent

PL-loaded 纳米纤维垫

伏立诺他 (100 mg) 溶解在 10 mL 丙酮溶液中。然后向该溶液中加入 LEse (100~400 mg) 和 PCL (600~900 mg) 并磁力搅拌 2 h。该溶液用于制造纳米纤维垫，并使用静电纺丝机（EBS ES-Biocoater；Nano NC，Seoul，South Korea）涂覆在硅胶膜覆盖的支架上。静电纺丝机由高压电源、注射泵、X-Y机器人系统和滚筒辊收集器组成。将注射器（NanoNC，24G）中的聚合物/药物溶液喷到硅胶膜覆盖的金属支架上（直径1 cm，长度10 cm，滚动速度500 rpm，喷速100 μL/min，电压15 kV）放在滚动收集器上。负载 PL 的纳米纤维膜被涂覆在支架上。为了去除剩余的溶剂，将负载 PL 的纳米纤维涂层支架在真空干燥箱中干燥 24 小时。负载PL的纳米纤维涂层支架在4 °C下储存，直至进行后续研究。

负载 PL 的纳米纤维垫与支架小心分离，用于药物释放和动物研究。在没有PL的情况下用类似的程序制备空的纳米纤维膜。

如下测量药物含量：将 5 mg 掺入 PL 的纳米纤维垫溶解在 DMSO 中 2 小时。紫外分光光度计 (UV-1601, Shimadzu Co. Ltd. Osaka, Japan) 用于测量 325 nm 处的药物浓度。空的纳米纤维垫也溶解在DMSO中并用于空白试验。

在体外用磷酸盐缓冲盐水（PBS，0.01 M，pH 7.4）进行药物释放研究。将纳米纤维垫切成圆盘，将 10 mg 圆盘浸入 50 mL 锥形管中的 40 mL PBS（0.01 M，pH 7.4）中。将其置于 100 rpm (37 °C) 的振荡培养箱中。使用整个介质来测量特定时间间隔从纳米纤维垫中释放的 PL 的浓度。用紫外分光光度计 (325 nm) 测量培养基中的 PL 浓度。空的纳米纤维垫也被用作空白测试。释放研究中，在释放介质中加入过氧化氢，考察ROS对药物释放速率的影响。

形态学

用场发射扫描电子显微镜（S-4800；Hitachi，Tokyo，Japan）在25 kV下观察纳米纤维垫的形貌。

细胞培养

人 CCA 细胞系如 SNU478、SNU245 和 SNU 1196 CCA 细胞系获自韩国细胞系库（韩国首尔）。 HuCC-T1 人 CCA 细胞系获自 Health Science Research Resources Bank (Osaka, Japan)。所有细胞均在含有10%热灭活FBS和1%青霉素/链霉素的RPMI1640中于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

抗癌活性研究

各种CCA细胞（1 × 10 ⁴ ) 接种在 96 孔板中，用于评估 PL 本身、掺入 PL 的纳米纤维垫或从纳米纤维垫释放的 PL 的抗癌活性。细胞在 37 °C 的 5% CO2 培养箱中保持过夜。对于 PL 处理，将溶解在 DMSO（10 mg PL/mL DMSO）中的 PL 用 RPMI1640 培养基稀释。 DMSO 的终浓度低于 0.5%。为了处理从纳米纤维垫释放的 PL，将掺入 PL 的纳米纤维垫浸入 50 mL 锥形管中的 40 mL PBS 中。在第 5 天和第 15 天，如上所述用紫外分光光度计测量 PL 浓度并用于处理细胞。空纳米纤维也适用于释放实验以进行比较。细胞暴露于 PL 本身或从纳米纤维垫释放的 PL 2 天。用MTT增殖试验评估CCA细胞的活力。向孔中加入30微升MTT溶液（5 mg/mL PBS，pH 7.4），然后将细胞在37 °C的5% CO2培养箱中孵育4 小时。弃去培养基并加入100 μl DMSO。用酶标仪在 570 nm（Infinite M200 Pro 酶标仪，Tecan，Mannedorf，Switzerland）分析细胞活力。细胞活力表示为八孔的平均值±标准偏差。

ROS 测量

通过DCFH-DA方法测定CCA细胞中ROS的产生。 CCA细胞（1 × 10 ⁴ 接种在 96 孔板中的细胞）用不同浓度的 PL 本身或从纳米纤维垫释放的 PL 在无酚红的 RPMI 培养基中处理，含有 DCFH-DA（最终浓度 20 μM）。 6 小时或 12 小时后，将细胞用 PBS 洗涤两次，并更换为 100 μL 新鲜的无酚红 RPMI 培养基。使用Infinite M200 pro酶标仪（激发波长485 nm，发射波长535 nm）通过荧光强度变化分析细胞内ROS含量。

蛋白质印迹

如前所述进行 CCA 细胞的蛋白质印迹 [31]。细胞暴露于 PL 本身或从纳米纤维垫释放的 PL 24 小时。之后，通过胰蛋白酶消化收获细胞，用冷PBS洗涤，并通过离心收集。沉淀在含有 50 mM Tris、150 mM NaCl、1% NP-40、0.5% 脱氧胆酸、0.1% 十二烷基硫酸钠 (SDS) 和苯甲基磺酰氟和蛋白酶抑制剂混合物（Roche Diagnostics，巴塞尔，瑞士）的裂解缓冲液中裂解）。将此溶液在 4 °C（14,000×g );然后使用 BCA 蛋白质检测试剂盒（Pierce，Rockford，IL，USA）将细胞裂解物（上清液）用于测量蛋白质浓度。将蛋白质（50 μg）加载到 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）上，转移到聚二氟乙烯（PVDF）膜上，用 5% 脱脂牛奶的 TBS-T 封闭，用适当的一抗探测，然后处理用 HRP 偶联的二抗反应 1 h。通过化学发光检测免疫印迹，然后使用ImageJ软件程序进行数字分析。

使用肿瘤异种移植模型的体内研究

使用携带 HuCC-T1 的小鼠（BALB/c 裸鼠，5 周龄，雄性，体重 18-23 g；Orient，Seongnam，韩国）来评估掺入 PL 的纳米纤维支架的体内抗肿瘤活性。 1 × 10 ⁶ 将 100 μL PBS 中的 HuCC-T1 细胞皮下 (s.c.) 施用于裸鼠背部。当实体瘤直径变为约 4~5 mm 时，将掺入 PL 的纳米纤维和空纳米纤维的圆盘植入实体瘤下方。 PL的剂量为10 mg PL/kg。为了进行比较，将 PL 溶解在 Cremophor EL®/乙醇混合溶液 (0.5% v /v Cremophor EL® 和 0.5% v /v PBS 中的乙醇（pH 7.4，0.01 M））。对照组在肿瘤组织旁皮下注射PBS。对于掺入 PL 的纳米纤维和空纳米纤维组，如下制备纳米纤维盘；将相同重量的纳米纤维晶片切成圆盘，然后小心地切除小鼠的背部皮肤（长度为 0.5 cm）。在此之后，纳米纤维晶片被小心地植入实体肿瘤组织下。为了达到相同的条件，对照治疗和 PL 注射的小鼠还切除了肿瘤旁边的皮肤（长度为 0.5 cm）。每组由五只小鼠组成。以5 天为间隔测量肿瘤体积，将纳米纤维植入的第一天设为第0天。肿瘤体积由下式计算：V =(a × [b ] ² )/2。 一 ：最大直径； b :最小直径。

所有的动物研究都是在釜山国立大学机构动物护理和使用委员会 (PNUIACUC) 的指导下进行的。本研究中使用的动物实验方案已经过PNUIACUC对其伦理程序和科学护理的严格审查，并已获得批准（批准号：PNU-2017-1608）。

免疫组织化学

30 天后分离肿瘤组织。然后，将肿瘤组织固定在 4% 甲醛中，石蜡包埋，切片进行苏木精和伊红 (H&E) 染色。用细胞凋亡相关蛋白如 caspase-3 和 caspase-9 抗体进行免疫组织化学染色。使用稀释度为 1:100 或 1:200 的抗体，然后根据制造商的方案使用 Envision 试剂盒（Life Technologies，Carlsbad，CA，USA）进行染色。

统计分析

使用 Student's t 对处理和未处理细胞的数据进行统计分析 测试。一个 p 值 <0.05 被认为具有统计学意义。

结果

聚合物的表征

为了制造 PL 洗脱 GI 支架，如图 1 所示合成了 LEse 嵌段共聚物。MePEG-NHS 与硒代胱胺反应，然后末端胺基与 PLA 的羧基端基共轭。来自MePEG-硒代胱胺缀合物的未反应的硒代胱胺通过透析程序去除。此外，合成的嵌段共聚物中未反应的 MePEG-硒代胱胺缀合物也通过透析程序和甲醇沉淀去除。硒代胱胺的特定峰分别在 1.7 ppm 和 2.9 ppm 处得到确认，而 MePEG 的特定峰也在 3.5~3.7 ppm 处得到确认。当 PLA 共轭时，PLA 的甲基被确认为 1.4 ppm。 PCL 均聚物和 LEse 嵌段共聚物共混物被混合以制造纳米纤维垫。用 ¹ 测量LEse嵌段共聚物和PCL均聚物的M.W.和组成 H-NMR 光谱和 GPC。 M.W.估算结果如表1所示。如表1所示，LEse嵌段共聚物的M.W.基于PEG的M.W.使用 ¹ 估算 H-NMR光谱为9760 g/mol。 GPC测定表明，LEse嵌段共聚物的Mn分别为8210 g/mol，Mw为9530 g/mol，Mw为1.16。

LESe嵌段共聚物的合成方案

掺有胡椒碱的纳米纤维涂层胃肠支架的特性

如图 2 和表 2 所示，不同比例的 PCL 和 LEse 嵌段共聚物用于制造纳米纤维并涂覆到 GI 支架上。 PCL 均聚物导致细而薄的纳米纤维垫具有最小的聚集形式。当加入 LEse 嵌段共聚物时，观察到一些聚集形式，例如颗粒和颗粒，如图 2 所示。在较高的 LEse 比率（75/25 和 60/40）下，纳米纤维垫显示出更厚且不规则的纤维形式结构体。当其含量超过 50% 的 LEse 组成时，聚合物显着聚集并且垫子显示出严重的不规则性（数据未显示）。仅从 LEse 嵌段共聚物很难获得纳米纤维结构。因此，通过与PCL均聚物共混可以获得纳米纤维结构。制备的掺入PL的纳米纤维垫中的药物含量几乎与理论值相似，如表2所示。这些结果表明掺入PL的纳米纤维垫由PCL均聚物和LEse嵌段共聚物混合物成功制备，然后涂覆到GI支架上。 <图片>

一 掺入 PL 的纳米纤维覆盖的 GI 支架。 b 掺PL纳米纤维的FE-SEM照片

图 3 显示了纳米纤维垫的药物释放动力学。如图 3a 所示，PL 在 25 天的时间内从纳米纤维垫中持续释放。观察到 PL 从纳米纤维垫中突然释放到 4 天，然后 PL 从纳米纤维垫中持续释放直到第 25 天。纳米纤维垫中 LEse 嵌段共聚物的含量越高，PL 从纳米纤维垫中的释放速度就越快。由于 LEse 嵌段共聚物的疏水性低于 PCL 均聚物，因此具有较高 LEse 嵌段共聚物含量的 PCL/LEse 纳米纤维垫必须比 PCL 均聚物溶胀得更多。然后，具有较高 LEse 嵌段共聚物含量的纳米纤维垫导致药物释放更快。此外，由于 LEse 嵌段共聚物中的二硒键可以被 ROS 如 H2O2 分解，因此在 ROS 存在下可以加快 PL 释放速率，然后这些因素会诱导纳米纤维垫的氧化还原响应分解（图 3c~e）。 PCL 均聚物的纳米纤维垫对 H2O2 的添加没有显着响应，即 PCL 不受 H2O2 添加的很大影响；另一方面，当加入 LEse 嵌段共聚物时，随着 H2O2 的加入，PL 从纳米纤维垫中的释放显着加速。特别是，如图 3c、d 和 e 所示，纳米纤维垫中较高的 LEse 嵌段共聚物比率诱导了更快的药物释放动力学。这些结果表明掺入 PL 的纳米纤维垫在生物环境中具有氧化还原响应的药物释放潜力。在体外细胞培养和体内动物研究之后，使用PCL/LEse嵌段共聚物（60/40）制备的掺入PL的纳米纤维垫。

一 从具有各种组成的纳米纤维中释放 PL。 PCL/Lese 重量比分别为 100/0、90/10、75/25 和 60/40。 b 过氧化氢对从纳米纤维垫释放 PL 的影响（PCL/Lese 重量比为 100/0）。 c 过氧化氢对从纳米纤维垫释放 PL 的影响（PCL/Lese 重量比为 90/10）。 d 过氧化氢对从纳米纤维垫释放 PL 的影响（PCL/Lese 重量比为 75/25）。 e 过氧化氢对纳米纤维垫PL释放的影响（PCL/Lese重量比为60/40）

体外抗癌活性

使用各种 CCA 细胞评估了掺入 PL 的纳米纤维垫涂层支架的抗癌特性。为了比较，在释放实验期间的第 5 天和第 15 天提取从纳米纤维垫释放的 PL，并将其与完整的 PL 进行比较。如图 4 所示，与 PL 本身相比，第 5 天和第 15 天释放的 PL 在所有 HuCC-T1 细胞（图 4a）、SNU1196 细胞（图 4b）、SNU478 细胞中的抗癌活性没有显着变化（图 4c）和 SNU245 细胞（图 4d）。尽管 PL 本身在高于 10 μg/mL 的浓度下具有更高的抗癌活性，但它们在细胞活力方面具有几乎相似的抑制潜力。表 3 显示了 PL 本身和从纳米纤维垫释放的 PL 的 IC50 值。与 PL 本身一样，从第 5 天和第 15 天释放的 PL 保持抗癌活性直到药物释放实验的第 15 天，并且在所有 CCA 细胞系中都显示出合理的 IC50 值，尽管与第 5 天和第 15 天相比，这些值在 PL 处逐渐增加PL本身。在 H2O2 存在下从第 4 天和第 15 天释放的 PL 也保持了抗癌活性以及 PL 本身。这些结果表明 PL 的抗癌活性在纳米纤维制造过程和生物环境中的药物释放期间保持不变。此外，从纳米纤维垫释放的 PL 产生 ROS 产生能力，直到药物释放期的 15 天，与 PL 本身类似（图 5）。如图 5a 和 b 所示，PL 本身以高于 5 μg/mL 的速率显着更多地产生 ROS。第 5 天和第 15 天释放的 PL 也产生了 ROS，尽管从第 15 天开始释放的 PL 会略微降低 ROS 的产生，这表明掺入 PL 的纳米纤维垫在药物释放期间保持了 PL 的内在抗癌特性。

PL 和从纳米纤维垫释放的 PL 对各种 CCA 细胞活力的影响。 一 HuCC-T1，b SNU1196，c SNU478 和 d SNU245 胆管癌细胞。 2 × 10 ⁴ 96 孔板中的细胞暴露于 PL 或从纳米纤维中释放 PL 2 天。为了处理释放的 PL，将掺入 PL 的纳米纤维盘浸入 PBS 中，然后在有或没有 10 mM H2O2 的情况下进行 5 和 15 天的释放实验。与药物释放研究类似，更换培养基直至3 天。之后，在释放实验的 5 到 15 天之间收获培养基。该溶液用于考察PL本身与释放PL的抗癌活性的比较

PL 和从纳米纤维垫释放的 PL 对 HuCC-T1 细胞 ROS 生成的影响 (a ) 和 SNU245 细胞 (b ）。 PL 本身和释放的 PL 按图 3 所述进行处理

图 6 显示了 HuCC-T1 CCA 细胞中凋亡蛋白的表达。与PL本身相比，释放的PL（5 天）在诱导HuCC-T1细胞凋亡方面具有相似的活性，即BAX、caspase-3、7和9的表达以及裂解的PARP裂解通过处理逐渐增加发布 PL（5 天）以及 PL 本身。这些结果还表明，释放的PL对CCA细胞以及PL本身具有合理的抗癌活性。

HuCC-T1 细胞凋亡的蛋白质印迹分析。细胞用PL本身或从纳米纤维中释放PL 1 天，然后进行蛋白质印迹分析

针对 HuCC-T1 肿瘤异种移植模型的体内抗癌活性

准备荷有 HuCC-T1 的裸鼠以评估掺入 PL 的纳米纤维涂层支架的体内抗癌活性，如图 2 和图 5 所示。 7和8。如图7所示，HuCC-T1肿瘤的体积在1 个月内逐渐增加。空纳米纤维处理中肿瘤体积的增长与对照处理几乎相似。与对照治疗或空纳米纤维治疗相比，PL 注射适当地抑制了肿瘤生长。 Especially, tumor growth was significantly inhibited by the treatment of PL-incorporated nanofiber, i.e., tumor mass in the treatment of PL-incorporated nanofiber was one third of control treatment. These results indicate that PL-incorporated nanofiber mats have superior potential in inhibition of tumor growth of CCA cells. Furthermore, the expression of caspase-3 and 9 was also increased in tumor tissues as shown in Fig. 8, indicating that released PL from nanofiber mats properly inhibited the growth of the tumor and induced apoptosis of tumor cells. Also, PL-incorporated nanofiber-coated stent has potential to inhibit CCA cells in vitro and in vivo.

The effect of PL solution, empty nanofiber mats or PL-incorporated nanofiber mats on the growth of HuCC-T1 tumor (a ) and the body weight changes (b ）。 HuCC-T1 (1 × 10 ⁶ cells) cells were implanted to the back of mice. PL dose was adjusted to 10 mg/kg. One hundred microliters of PBS or PL solution was s.c. injected beside the tumor tissue for control treatment and PL solution treatment, respectively. For empty nanofiber and vorinostat nanofiber implantation, wafers of the same weight were cut and then implanted under the tumor tissue. *p <0.001； **p  < 0.01

Immunohistochemical staining (× 400) of HuCC-T1 tumor tissues. Each tumor tissues were stained with BAX, caspase-3, 7, and 9, and PARP-1

Discussion

Abnormal accumulation of ROS in tumor epithelial cells induces carcinogenesis and affects surrounding cells or tissues which constitute tumor microenvironment [39]. Then, abnormal tumor microenvironment is the key player in proliferation, migration, angiogenesis, and metastasis of cancer cells [39,40,41]. An elevated level of ROS in tumor microenvironment induces oxidative stress and causes DNA damage [39]. Also, ROS is also correlated with cholangiocellular proliferation and oncogenic transformation [42]. Paradoxically, increased accumulation of intracellular ROS over toxic level induces apoptosis of cancer cells and tumor suppression [39,40,41,42]. For example, Thanee et al. reported that sulfasalazine as a cystine-glutamate transporter-target drug increased intracellular ROS level and then induced cell death [43]. They also argued that therapeutic efficacy of anticancer drug can be improved by blocking the mechanism of the cell’s ROS defensive system. Also, many research groups investigated ROS-producing small molecules such as melatonin, luteolin, chloroqine, and PL to suppress CCA growth rate by increasing intracellular ROS [44,45,46,47]. Thongsom et al. reported that PL stimulates ROS accumulation in CCA cells and induces cell death by activation of caspase-3 and PARP [47]. We also observed that PL increases the accumulation of intracellular ROS in various CCA cells as shown in Fig. 5. Increased ROS level induced apoptosis signals such as BAX, caspase-3, 7, and 9, and PARP (Fig. 6). The ROS-producing capability of piperlongumine was slightly decreased on day 5 and 15 as shown in Fig. 5. These results might be due to that piperlongumine is unstable in physiological solution, and then ROS-producing capability might have been slightly decreased. Additionally, physicochemical properties of piperlongumine may be affected during the fabrication process of the nanofiber. However, our results showed that ROS-producing capacity of piperlongumine was still maintained during the 15 days of drug release experiment.

Local treatment can be applied for patients with an advanced stage or unresectable stage of CCA [48]. Among various treatment options, DES is a promising candidate for unresectable CCA patients. However, conventional DES for GI tract has no tumor-targetable drug release function, and cytotoxic agent can be eluted in all areas of polymer membrane on the stent. Chemical, physical, or biological stimuli have been applied to induce altered drug delivery in the local region [49,50,51,52]. For example, Wang et al. used a magnitude of applied tensile strain to control drug release rate on the esophageal stent, i.e., increased drug release in a specific region was observed by propagating patterned crack of multilayered coating on the stent [49]. Thin film or nanoporous devices having stimuli-responsiveness such as pH and ionic strength were also investigated for application in DES [50, 51]. Chen and Huang reported that chitosan/poly(vinyl alcohol) hybrid nanofiber membrane was crosslinked with ally disulfide to endow reductant-responsiveness, and then hybrid nanofiber membrane showed favorable biological/material features [52]. We synthesized LEse deblock copolymer and fabricate redox-responsive nanofiber mats for local application in CCA tumors. PCL/LEse-blended nanofiber mats showed increased drug release behavior with responsiveness against H2O2, indicating that drug release kinetics can be controlled by ROS level in cancer cells or tumor tissues. Furthermore, ROS-dependent drug release from nanofiber mats can be accelerated in tumor since PL is a ROS-producing agent. PL in the tumor may synergistically increase ROS level and then accelerate drug release from nanofiber mats. After all, ROS-dependent release of PL from nanofiber-coated stent synergistically inhibits CCA cells in vitro and in vivo.

Conclusion

We fabricated ROS-sensitive nanofiber mats-coated GI stent using PCL/LEse block copolymer blend. PL was incorporated in nanofiber mats by electrospinning technique. PL release from nanofiber mats was accelerated by addition of H2O2, indicating that PL-incorporated nanofiber membranes have ROS-responsiveness. PL released from nanofiber mats at 5 days and 15 days showed appropriate anticancer activity even though its anticancer activity was slightly decreased compared to PL itself. As well as PL itself, PL released from nanofiber mats induced ROS generation and apoptosis of CCA cells. Furthermore, PL-incorporated nanofiber mats properly inhibited the growth of HuCC-T1 tumor in mice. We suggest PL-incorporated nanofiber mats prepared by PCL/LEse block copolymer blend as a promising candidate for local treatment of CCA cells.