ROS响应胡椒长碱酯洗脱胃肠支架：抑制胆管癌的新型纳米纤维策略

摘要

背景

我们设计了一种药物洗脱胃肠(GI)支架，通过活性氧(ROS)敏感纳米纤维垫释放胡椒长碱酯(PL)。PL负载垫旨在利用ROS触发提供局部抗胆管癌(CCA)细胞效应。

方法

我们通过将硒代胱氨酸连接到甲氧基聚乙二醇(MePEG)再接聚乳酸(PLA)合成了二硒键连接的嵌段共聚物(LEse)。通过电纺丝不同比例的聚己内酯(PCL)和LEse混合物，制备含PL纳米纤维垫。这些垫涂覆在硅胶膜覆盖的胆道支架上。评估了体外药物释放、ROS响应性和抗癌活性，随后进行HuCC-T1异种移植瘤动物实验。

结果

高LEse含量纳米纤维表现出ROS触发的PL释放加速，而纯PCL垫响应性极低。垫释放的PL对多种CCA细胞系保持强细胞毒性，诱导ROS生成并促进凋亡。HuCC-T1瘤负荷小鼠中，PL洗脱支架显著抑制肿瘤生长并增加caspase-3/9表达，优于对照组。

结论

LEse敏感纳米纤维垫成功将常规GI支架转化为ROS响应、局部作用的抗癌平台。该策略为治疗不可切除胆管癌提供了有前景的靶向方法。

背景

胆管癌(CCA)源于胆管上皮，是最侵袭性恶性肿瘤之一，全球发病率上升。多数患者确诊时已属晚期，手术切除罕见，常规疗法——放疗、系统化疗、金属支架植入——获益有限。支架植入缓解胆道梗阻至关重要，但金属支架缺乏治愈性且易致肿瘤过度生长，推动药物洗脱支架(DES)研究。早期DES试验用紫杉醇、索拉非尼、伏立诺他显示支架通畅率和肿瘤抑制适度改善，但治愈效果仍难实现。

刺激响应纳米材料，特别是ROS敏感系统，已成为癌症治疗强大药物递送平台。聚合物中二硒键在氧化肿瘤微环境降解，触发快速药物释放。胡椒长碱酯(PL)源自长胡椒的天然生物碱，选择性升高癌细胞ROS，诱导DNA损伤和凋亡而不伤正常组织。但PL快速全身清除和肾毒性要求局部递送。

我们因此制备氧化还原响应、PL负载纳米纤维涂层用于GI支架，利用肿瘤ROS微环境实现按需药物释放和强效抗癌活性。

材料与方法

材料

PL(LKT Labs, MN, USA)、PLA(MW≈5 kDa, Wako)、MePEG-NHS(MW≈5 kDa, Sunbio)、硒代胱氨酸(Sigma-Aldrich)、PCL(MW≈80 kDa, Sigma-Aldrich)及其他试剂均为分析纯。硅胶膜覆盖胆道支架(1 cm×10 cm)购自M.I. Tech(平泽, 韩国)。

LEse嵌段共聚物合成

MePEG-NHS与过量硒代胱氨酸在DMSO中反应，经透析(MWCO 1 kDa)和冻干。所得MePEG-硒代胱氨酸再通过EDAC/NHS化学偶联PLA，得LEse嵌段共聚物(收率>94%)。¹H-NMR确认1.7 ppm和2.9 ppm(硒代胱氨酸)及3.5-3.7 ppm(MePEG)特征峰。GPC分析给出Mn≈8.2 kDa，Mw≈9.5 kDa。

PL负载纳米纤维垫及支架涂覆制备

PL溶于丙酮(10 mg mL⁻¹)。加入LEse(100-400 mg)和PCL(600-900 mg)，搅拌2 h，电纺丝涂覆支架上(15 kV, 100 µL min⁻¹, 500 rpm)。涂覆支架真空干燥24 h，4℃保存。

药物负载与释放研究

药物含量经溶解5 mg垫于DMSO后UV-Vis(325 nm)定量。释放在PBS(0.01 M, pH 7.4)37℃下有无10 mM H₂O₂条件监测。预定间隔取样UV-Vis分析。

细胞培养与抗癌实验

人CCA系(SNU-478, SNU-245, SNU-1196, HuCC-T1)用RPMI-1640含10% FBS培养。细胞用PL、释放PL(第5或15天)或载体处理48 h，MTT法测活力，计算IC₅₀。

ROS测定

DCFH-DA荧光(485 nm/535 nm)量化暴露于PL或释放PL 6-12 h后细胞内ROS。

Western Blot

处理24 h后裂解细胞，蛋白提取物(50 µg)经SDS-PAGE分离，转印PVDF膜，抗BAX、caspase-3/7/9和切割PARP探针检测。化学发光显像，ImageJ定量。

体内肿瘤异种移植模型

BALB/c裸鼠皮下接种HuCC-T1细胞(1×10⁶)。肿瘤达4-5 mm时，植入PL负载或空白纳米纤维片(10 mg PL kg⁻¹)于肿瘤下方。每5天测量肿瘤体积，V=(a×b²)/2计算。所有程序经PNUIACUC批准(批准号PNU-2017-1608)。

免疫组化

肿瘤切片按标准方案染色caspase-3和caspase-9。染色强度定性评分。

统计分析

Student's t检验分析数据；p<0.05视为显著。

结果

聚合物表征

¹H-NMR和GPC证实LEse嵌段共聚物合成成功。调整PCL与LEse比例优化纤维形貌和药物释放。

纳米纤维形貌与药物负载

FE-SEM显示纯PCL产生细长均匀纤维，LEse添加在高负载(≥50% LEse)诱导颗粒和不规则性。最佳垫(60% LEse)保持可接受纤维形貌，理论负载率~10%(w/w)掺入PL。

ROS响应药物释放

PL释放持续25天，前4天爆发释放。高LEse组分加速释放，尤其H₂O₂存在下，确认ROS敏感性。纯PCL垫响应性可忽略。

体外抗癌活性

第5天和第15天释放的PL对所有CCA系保持与新鲜溶解PL相当的细胞毒性，IC₅₀值仅略高。ROS实验显示PL和释放PL均显著诱导细胞内ROS。Western blot显示BAX、caspase-3/7/9和切割PARP上调，指示诱导凋亡。

体内疗效

HuCC-T1异种移植模型中，PL负载支架将肿瘤体积降至对照组三分之一，增强caspase-3/9表达，空白支架或载体无效果。

讨论

肿瘤微环境升高的ROS水平既触发PL诱导凋亡，又加速二硒键连接纳米纤维药物释放，产生协同局部治疗效应。这种双重作用减轻全身暴露，解决了缺乏肿瘤靶向释放的常规DES难题。

结论

我们证明了ROS响应PL负载纳米纤维涂层GI支架在体外和体内有效向胆管癌肿瘤递送抗癌疗法。该平台为不可切除CCA的局部可控治疗提供有前景策略。

缩略语

CCA:

胆管癌

DES:

药物洗脱支架

EDAC:

1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺

FE-SEM:

场发射扫描电子显微镜

GI:

胃肠

GPC:

凝胶渗透色谱

H₂O₂:

过氧化氢

MePEG:

甲氧基聚乙二醇

MTT:

3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐

NHS:

N-羟基琥珀酰亚胺

PCL:

聚己内酯

PLA:

聚乳酸

PL:

胡椒长碱酯

ROS:

活性氧