辣根过氧化物酶封装空心二氧化硅纳米球用于细胞内 ROS 检测

摘要

活性氧（ROS）在细胞信号传导中至关重要，但过量产生会导致氧化损伤。因此，精确的活细胞 ROS 定量对基础生物学和临床诊断均必不可少。传统荧光探针结合辣根过氧化物酶（HRP）受限于 HRP 差的膜透性。本文提出一种微乳液模板溶胶-凝胶法制备的辣根过氧化物酶封装空心二氧化硅纳米球（HRP@HSNs）。这些纳米反应器保持强酶活性，易于跨越细胞膜，且生物相容性优异。将 HRP@HSNs 与二氢罗丹明 123（DHR123）探针耦合，实现了在活化的 RAW 264.7 巨噬细胞中对细胞内过氧化氢（H₂O₂）的定性与半定量检测。该平台易于通过靶向配体功能化，可实现细胞器或细胞型特异性的 ROS 成像。

背景

ROS——包括超氧阴离子、过氧化氢、羟基自由基、单线态氧和过氧亚硝酸盐——在有氧代谢中持续产生，主要源自线粒体电子传递链。抗氧化防御系统（酶促：超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶；非酶促：维生素 A、C、E、尿酸、胆红素）通常中和这些物质。失衡导致氧化应激，损伤 DNA、脂质、蛋白质，诱发糖尿病、癌症、心血管及神经退行性疾病（阿尔茨海默、帕金森）[1–5]。

荧光显微镜的进步实现了非侵入性的单细胞 ROS 成像，主要通过氧化非荧光前体变为荧光的比率型或强度型探针[6–8]。特异性至关重要；如硼酸酯探针通过生物正交氧化靶向 H₂O₂[9]。然而许多探针在体内不稳定、组织穿透差、肾清除快[12–14]。稳定连接基、基因编码传感器、生物发光报告剂、PET 示踪剂等策略已被探索[15–18]。纳米制剂通过提高特异性和灵敏度进一步增强 ROS 成像[19–22]。

高催化活性的酶是强大的生物传感器，但游离形式稳定性差且缺乏膜透性，限制了细胞内应用。电极型 HRP 传感器不适合活细胞成像。将 HRP 封装于纳米颗粒壳层中可保护酶并促进细胞内递送，空心二氧化硅纳米球（HSNs）已证实可行[25–27]。本研究评估 HRP@HSNs 用于细胞内 ROS 检测，考察载量、活性、细胞摄取、细胞毒性及巨噬细胞功能成像。

方法/实验

化学品与试剂

癸烷、正己醇（98%）、氨水（35% w/w）、TEOS（98%）、APTMS（95%）、FITC 等来自 ACROS 和 Sigma-Aldrich。HRP（type VI-A）、DHR123、PMA、H₂O₂（35%）购自 Cayman 和 SHOWA Chemical Industry。所有试剂即用。

空心二氧化硅纳米球（HSNs）合成

采用水包油微乳液选择性蚀刻法，参考早期工作[25,29]。简述：20 mL 癸烷、1.63 mL CA-520、550 µL 正己醇 650 rpm 搅拌，加 350 µL 水形成微乳液。加入 APTMS（25 µL，200 µL 于 1.4 mL 乙醇）和 TEOS（100 µL），随后 250 µL 35% 氨水，20 °C 反应 10 h。95% 乙醇破乳，11000 rpm 离心 20 min 收集固体二氧化硅纳米球（SSNs）。SSNs 在 40 °C 水中蚀刻 40 min 得空心壳，洗净后贮于 99.5% 乙醇。

辣根过氧化物酶封装空心二氧化硅纳米球（HRP@HSNs）合成

过程同 HSNs，将 350 µL 水替换为 350 µL 水相 HRP（10 mg mL⁻¹）。HRP@HSNs 于 4 °C 去离子水中保存。

FITC-HSNs 和 HRP@FITC-HSNs 合成

为引入绿色荧光，用 FITC-APTMS（10 mg FITC，200 µL APTMS 于 1.4 mL 乙醇，避光 18 h）替代乙醇 APTMS，得 FITC-HSNs 和 HRP@FITC-HSNs。

HRP 封装效率与载量

HRP 标记 RITC 制得 RITC-HRP，封装得 RITC-HRP@HSNs。1 M NaOH 溶解后荧光测定（Hitachi F-4500，λ_ex=543 nm，λ_em=550–650 nm），对标准曲线计算。封装效率（%)=(纳米球中 RITC-HRP 质量/初始 RITC-HRP)×100；载量（µg HRP mg⁻¹ HSNs）同法计算。

HRP 活性测定

以显色底物 TMB 量化 HRP 活性。酶溶液（游离 HRP 和 HRP@HSN）与 20 µM TMB 和 20 µM H₂O₂ 在磷酸/柠檬酸缓冲液（pH 5.2）中混合，BioTek Synergy 读数仪记录 655 nm 吸光度，以游离 HRP 标准曲线计算活性。

多种 ROS 反应性测定

DHR123（20 µM）单独或配合 HRP@HSNs（50 µg mL⁻¹）与 100 µM ROS（H₂O₂、TBHP、超氧阴离子、·OH、·OtBu）在 DMEM（pH 7.4）中孵育。荧光（λ_ex=488 nm，λ_em=530 nm）每 5 min 记录一次，共 120 min。

细胞培养与活性测定

RAW264.7 巨噬细胞在 DMEM+10% FBS+抗生素，37 °C，5% CO₂ 培养。活性测定：2×10⁵ 细胞/孔种于 24 孔板，24 h 后暴露于 0–200 µg mL⁻¹ 纳米颗粒（无血清 DMEM）2 h。WST-1 试剂（Clontech）检测活性（450 nm，参考 650 nm），Bio-Rad 680 读数仪读数。

细胞摄取分析

1×10⁶ RAW264.7 细胞/孔与 0–200 µg mL⁻¹ FITC 标记纳米颗粒孵育 2 h。洗涤、胰蛋白酶消化后，流式细胞术定量摄取；台盼蓝淬灭细胞外荧光。

PMA 刺激巨噬细胞 ROS 产生的流式细胞术分析

纳米颗粒处理 2 h、DHR123 加载 30 min 后，1 µg mL⁻¹ PMA 刺激 1 h，FACS Canto II 分析。

定量分析

96 孔板种 3×10⁴ RAW264.7 细胞/孔。2 h 纳米颗粒处理，1 h PMA（梯度）+ DHR123（20 µM）孵育后，荧光（λ_ex=488 nm，λ_em=530 nm）测定。外部 H₂O₂ 标准曲线（HRP@HSN）将荧光转换为 H₂O₂ 浓度。

表征

TEM（JEOL JEM-1200 EX II，100 kV）确认 45 nm 空心核；醋酸铀染色验证内部 HRP。动态光散射（Malvern Zetasizer Nano ZS）测流体动力学尺寸和 ζ 电位；蔡司 Axio Observer Z1 成像细胞。

结果与讨论

HSNs 和 HRP@HSNs 的设计与合成

HRP@HSNs 通过氨催化溶胶-凝胶化学在 w/o 微乳液中制备（方案 1）。TEM（图 1）显示单分散 45 nm 球体；醋酸铀染色确认 HRP 封装于空心腔内。DLS 显示水中 HSNs 和 HRP@HSNs 流体动力学直径分别为 188±4 nm 和 184±6 nm，在无血清 DMEM 中因团聚增至 1.8–1.7 µm。牛血清白蛋白（BSA）可减少团聚，得稳定 195–197 nm 颗粒。

HRP 封装效率与载量

RITC-HRP 封装效率约 6%（11–33 nmol 负载范围）；33.3 nmol 投料时最高载量达 12.5±1.2 µg HRP mg⁻¹ HSN。效率虽不高，但证明 HRP 可保留于纳米腔内，且载量可通过酶浓度调控。

细胞毒性与细胞摄取

WST-1 测试显示，2 h 或 26 h 暴露于高达 200 µg mL⁻¹ HSNs 或 HRP@HSNs 后，RAW264.7 增殖无显著抑制，表明低细胞毒性。FITC 标记颗粒在 >50 µg mL⁻¹ 下 2 h 标记效率 >80%，证实高效细胞内递送且不损害活力。

HRP@HSNs 对多种 ROS 的反应性

HRP 活性测定显示封装后保留约 40% 原生活性，可能因二氧化硅壳扩散限制。无细胞实验中，DHR123 单独对 H₂O₂ 或超氧阴离子无响应，但对 ·OH 和 ·OtBu 强烈反应。HRP 或 HRP@HSNs 显著放大所有测试 ROS 的荧光，游离 HRP 信号更高，与其活性更强相关。60 min 相对荧光比率显示，两种 HRP 均增强 H₂O₂ 和超氧阴离子检测，确认纳米腔保留催化功能并允许底物扩散。

HRP@HSNs 细胞内 ROS 检测

RAW264.7 经 HRP@HSNs 预处理 2 h、DHR123 加载 30 min 后，PMA 刺激显示荧光显著升高。流式细胞术显示刺激细胞 R123 荧光 >2 倍增强；HRP@HSNs 提供额外催化活性，而纯 HSNs 仅引起适度荧光上升，可能反映细胞应激反应。荧光强度随 PMA（0.1–2 µg mL⁻¹）和 HRP@HSNs（50–200 µg mL⁻¹）剂量依赖性增加。共聚焦图像确认细胞内 ROS 成像增强（图 3d）。

HRP@HSNs 用于定量 H₂O₂ 分析

利用外部 H₂O₂ 标准曲线（0.625–15 µM），量化 PMA 刺激 RAW264.7 产生的细胞内 H₂O₂。100 µg mL⁻¹ HRP@HSNs + 20 µM DHR123 处理细胞，暴露于 0.1–2 µg mL⁻¹ PMA，内源 H₂O₂ 浓度在 ≥0.25 µg mL⁻¹ PMA 时达 ~10 µM。此半定量测量展示了平台评估活细胞氧化应激的实用性。

结论

我们构建了封装活性 HRP 的空心二氧化硅纳米球，创建了稳健的细胞内 ROS 传感器。多孔二氧化硅壳允许小分子底物到达内部酶，同时保护 HRP 免受蛋白酶降解。结合 DHR123，HRP@HSNs 实现了氧化应激巨噬细胞中内源性 H₂O₂ 的增强半定量检测。抗体或肽类表面功能化可实现细胞器或肿瘤细胞特异性靶向，替代载荷（纳米催化剂、硼酸酯探针）可拓展检测范围。这些纳米反应器为生物医学研究和临床诊断中的同步 ROS 成像、定量及靶向治疗递送提供了通用平台。

缩写

APTMS

3-氨基丙基三甲氧基硅烷

BSA

牛血清白蛋白

DHR123

二氢罗丹明 123

DLS

动态光散射

FITC

异硫氰酸荧光素

HRP

辣根过氧化物酶

HSNs

空心二氧化硅纳米球

Igepal CA-520

聚氧乙烯（5）异辛基苯基醚

mETC

线粒体电子传递链

PET

正电子发射断层扫描

PMA

12-十四烷酸-13-乙酸酯鞣花素

R123

罗丹明 123

RITC

异硫氰酸罗丹明 B

ROS

活性氧

SSN

固体二氧化硅纳米球

TBHP

叔丁基过氧化氢

TEM

透射电子显微镜

TEOS

正硅酸乙酯

TMB

3,3′,5,5′-四甲基联苯胺