鼓膜注射脂质体纳米载体至大鼠内耳的安全性评估

摘要

脂质体纳米载体（LPNs）具有高药物负载量，经微创鼓室注射后能高效进入内耳，但其在这一敏感器官中的生物相容性尚未系统评估。本研究将含或不含钆-DOTA的LPNs经鼓膜注射至Sprague-Dawley大鼠。通过钆增强磁共振成像（Gd-MRI）追踪LPNs分布并评估屏障完整性，听性脑干反应（ABR）测听力功能，免疫组化定量糖胺聚糖、透明质酸、CD44、TLR2等炎症标志物及TUNEL检测细胞凋亡。结果显示：LPNs高效进入内耳且未破坏中/内耳屏障，无听力损失，炎症和凋亡指标无显著升高。因此，经鼓膜给药LPNs对大鼠耳蜗安全，有望用于感音神经性听力损失治疗。

研究背景

LPNs是临床应用最早的纳米治疗平台，广泛用于癌症、感染、炎症和疼痛治疗。其高载药量和内耳高摄取特性使其成为耳科给药的理想载体。鼓室注射是限制全身暴露的靶向给药途径，已用于梅尼埃病和突发性耳聋临床治疗。虽有研究证实肽修饰LPNs可到达耳蜗，但LPNs在内耳的安全性——特别是屏障功能、炎症反应和细胞活力方面——仍不清楚。本研究通过Gd-MRI、ABR和全面组织学分析，填补了LPNs内耳生物相容性评估的空白。

图示哺乳动物耳部结构（含人、大鼠）：外耳（耳廓、外耳道）、中耳（鼓膜、听骨链、咽鼓管、卵圆窗、圆窗膜）、内耳（耳蜗、前庭系统）。耳蜗包含外淋巴阶（鼓阶、前庭阶）和内淋巴阶（蜗阶），侧壁含血管纹和螺旋韧带。基底圈有皮质器（内/外毛细胞、盖膜、螺旋缘），螺旋神经节细胞传递听觉信号。前庭系统含三半规管、前庭囊。

透明质酸（HA）是细胞外基质主要成分，结合CD44和TLR2/4启动炎症通路。HA积累与多组织通透性增加和炎症相关，银纳米颗粒（AgNPs）曾诱导耳蜗HA堆积。因此本研究选HA、CD44、TLR2为关键炎症指标。

研究目的：确定经鼓膜LPNs是否损害内耳屏障完整性、诱发炎症或听力损失。Gd-MRI评估屏障功能，ABR测听阈，免疫组化定量HA、CD44、TLR2和凋亡DNA片段化。

结果

LPNs未引起大鼠耳蜗功能改变

Gd-MRI显示LPNs高效进入耳蜗，注射3小时内前庭阶和鼓阶信号强（图2c-f），6小时分布均匀达平衡（图2e-f）。血-外淋巴和血-内淋巴屏障完整，处理耳与对照耳信号强度相当（表1）。ABR阈值（点击声和2-32 kHz纯音）在注射后2、4、7天无显著漂移，听力功能保持完好（图3）。

LPNs未诱导大鼠耳蜗糖胺聚糖积累

PAS染色显示，LPNs或LPN-Gd处理组螺旋缘、骨壁、血管纹等结构糖胺聚糖无增加，定量分析无统计学差异（p>0.05，图5、6）。

LPNs对透明质酸分泌影响轻微

免疫荧光检测HA主要分布于螺旋神经节细胞、血管纹基底细胞、外沟细胞、毛细血管内皮细胞（图7）。LPNs或LPN-Gd给药后螺旋韧带成纤维细胞HA强度轻微下降，但未导致屏障通透性改变或听力损失（图8）。

LPNs暴露后CD44表达未变

CD44阳性细胞在血管纹基底层、螺旋韧带、Deiters细胞、毛细血管内皮大量存在，处理组与对照组染色强度和细胞计数无显著差异（图9、10）。

LPNs未影响TLR2表达

TLR2免疫反应性在血管纹基底细胞、螺旋韧带成纤维细胞、内皮高表达，但LPNs、LPN-Gd和水处理组无差异（图11、12）。

LPNs给药后耳蜗凋亡未增加

TUNEL染色显示所有组别耳蜗均有稀疏凋亡核，LPNs或LPN-Gd组未增加，镫骨底板和卵圆窗凹陷偶见凋亡属正常细胞更替（图13）。

讨论

数据表明：经鼓膜LPNs高效到达内耳，经卵圆窗和圆窗双路径，且不损伤血-外淋巴/血-内淋巴屏障。无听阈漂移、无炎症/凋亡标志物升高，证实LPNs在大鼠耳蜗耐受性良好。螺旋韧带成纤维细胞HA轻微减少可能反映向高分子量抗炎HA转变，未引起通透性改变，临床意义不大。结果支持95 nm LPNs内耳递送最高效，110-115 nm LPNs仍保持安全。

关键在于LPNs未激活TLR2/CD44炎症轴，该通路是活性氧和线粒体毒素致耳蜗损伤的关键机制。因此LPNs是内耳靶向给药的安全载体，支持其在感音神经性听力损失及其他耳科疾病临床应用潜力。