碳纳米点作为双模式纳米传感器用于选择性检测过氧化氢

背景

荧光碳纳米点（CDs）因其独特的物理化学性质，如良好的生物相容性、低毒性、可调光致发光（PL）和高量子产率而引起了广泛的研究关注。由于上述特点，CDs在包括但不限于生物成像、生物传感器和发光器件等多个领域都有潜在的应用[1,2,3,4,5,6,7,8,9]。此外，与有机染料或半导体量子点 (QD) 相比，由于其上转换和下转换能力、缺乏光学闪烁和高光稳定性，CD 更适合通过荧光增加或淬灭在荧光纳米传感器中的应用 [10 ,11,12,13,14,15,16,17,18,19]。

过氧化氢（H2O2）是一种常见的氧化剂，因其杀菌能力而一直被用作医用消毒剂。此外，H2O2 也是基于氧化酶的酶促反应的重要产物，例如葡萄糖/葡萄糖氧化酶 (GOD) 反应。因此，通过探测 H2O2 的传感策略可用作检测碳水化合物及其氧化酶的有前途的方法。因此，H2O2 的传感可用于监测有关碳水化合物代谢的疾病，例如糖尿病。目前，虽然已经通过使用多种分析方法开发了基于 H2O2 测定的各种葡萄糖传感器，但先前报道的传感器系统主要基于单一信号，例如电导、荧光或比色变化 [20,21,22] .最近，纳米技术的进步，尤其是荧光纳米粒子，如半导体量子点和新兴的碳基纳米粒子，带来了新型 H2O2 纳米传感器。卢等人。通过结合 CdTe QD 和罗丹明，开发了一种双发射微杂化物 (DEMBs)，通过监测 H2O2 的产生来对葡萄糖进行比例荧光传感 [20]。张等人。报道了一种荧光纳米传感器，它通过 CD 的荧光猝灭对 H2O2 显示出选择性和灵敏的响应 [21, 22]。然而，这些工作不可避免地带来了具有昂贵化学成分和重金属污染的半导体基量子点的固有缺陷。此外，基于单一信号读出的纳米传感器，无论是荧光猝灭还是颜色变化，由于环境因素的波动和实验操作错误，可能具有较差的测定稳定性。基于上述考虑，我们希望开发一类新的荧光 CD，其荧光和溶液颜色对 H2O2 浓度的变化非常敏感。因此，基于这些CDs的双模纳米传感器可以通过同时检测CD溶液的荧光和比色变化来实现对H2O2的独特而灵敏的感知，有利于实现H2O2的肉眼检测。

在这项研究中，我们开发了一种简单方便的方法来合成一种新型 CD，它在可见光下呈现深红色溶液颜色，在 365 nm 紫外灯下呈现双荧光发射（蓝色和绿色荧光发射）。 CDs是用柠檬酸、尿素和N通过溶剂热法合成的 ,N -二甲基甲酰胺（DMF）分别作为碳源、氮源和反应溶剂。荧光和溶液颜色对 H2O2 浓度的变化非常敏感。因此，基于这些CDs的双模纳米传感器可以通过同时检测CD溶液的荧光和比色变化来实现独特而灵敏地感知H2O2，有利于实现H2O2的肉眼检测。在不引入任何昂贵仪器的情况下，已经建立了基于这些 CD 的双模式纳米传感器。该传感系统可以有效避免潜在的操作错误，显着提高测量的可靠性。此外，基于CD的纳米传感器具有良好的生物相容性和高水溶性，在体内外血糖检测方面的应用前景广阔。

方法

CD合成

CDs采用溶剂热法制备，柠檬酸为碳源，尿素为氮源，DMF为共反应物。在典型的实验中，柠檬酸 (1 g) 和尿素 (2 g) 溶解在 10 mL DMF 中。然后将溶液转移到 25 毫升聚（四氟乙烯）衬里的高压釜中，并在 160°C 下加热 4 小时。反应结束后，将高压釜自然冷却至室温。得到暗红色溶液。通过将 5 mL 反应溶液加入 25 mL 丰富的乙醇中并以 7500 rpm 离心 30 分钟来沉淀 CD。然后，对沉淀进行透析以获得纯的 CD。收集制备的 CD 并在真空干燥箱中在 60°C 和 <1 Pa 下干燥 12 小时。然后，将 CD 重新溶解在去离子水中以形成 0.75 mg mL ^-1 用于进一步研究的 CD 解决方案。收集H2O2处理后的CDs并用同样的方法干燥以表征其表面形貌和结构特性。

测量

CD 的表面形态由高分辨率透射电子显微镜（HRTEM，JEOL JSM-IT100）表征。 CD 的结构特性由 X 射线衍射仪（XRD，PA National X’Pert Pro）和显微拉曼光谱仪（Renishaw RM 2000）测定。 CD 的吸收光谱在 Hitachi U-3900 UV-Vis-NIR 分光光度计上测量。 CD的荧光光谱由分光光度计（Hitachi F-7000）测量。 CD 的荧光量子产率是通过带有校准积分球的 Horiba FL-322 光谱仪获得的。 CD 的荧光衰减曲线也由 Horiba FL-322 使用 405 nm NanoLED 测量，分别监测 450 和 500 nm 的发射。 CD 的傅里叶变换红外光谱 (FTIR) 记录在 Bio-Rad Excalibur 光谱仪 (Bruker Vector 22) 上。 X射线光电子能谱（XPS）在ESCALAB MK II X射线光电子能谱仪上以Mg为激发源记录。

建立 CD 纳米传感器

为了检测 H2O2，在 PBS 缓冲液（pH =7.4，25°C）中检测了 H2O2 存在下 CD 的荧光和吸收光谱。在典型的实验中，首先将不同量的 H2O2 与蒸馏水混合，然后混合 20 μL 0.75 mg mL ^-1 将 CD 溶液注入不同浓度（0、0.05、0.1、0.15、0.25、0.5、1.0 和 2.0 M）的 4 mL H2O2 溶液中。然后，将CDs加入H2O2溶液后，拍摄照片、荧光和吸收光谱。

还评估了基于 CD 的纳米传感器的选择性。 CD 溶液（20 μL，3.75 μg mL ⁻¹ ) 与不同种类的阳离子和氧化剂（4 mL，0.1 M）混合，然后将溶液振荡 1 分钟。最后，在H2O2溶液中加入CDs后，记录了溶液的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱。

结果与讨论

CD 的特征

通过透射电子显微镜 (TEM) 测量制备的 CD 的形态。如图 1a 所示，CD 分散良好，尺寸范围为 2.5-6.5 nm，平均直径约为 5 nm（附加文件 1：图 S1b）。此外，HRTEM 图像（图 1a 的插图）显示了 0.21 nm 附近的衍射条纹，这与石墨的 (100) 一致。图 1b 中显示的 CD 的 XRD 图案在 23.4°附近显示出一个宽峰，这对应于具有类石墨碳结构的高度无序的碳原子。 CD 的拉曼光谱（图 1c）显示两个波段：D 波段（在 1347 cm ^-1 , 这是由于 sp ³ 的振动 -具有缺陷和无序的杂化碳）和 G 带（大约 1577 cm ⁻¹ , 这与 sp ² 的 E2g 振动模式有关 -二维六方晶体结构中的杂化碳）。 CD 的 FTIR 光谱（图 1d）在 3100-3600 cm ^-1 处呈现出 O-H/N-H 的宽振动吸收带 , C=O/C=C 在 1690–1610 cm ⁻¹ 附近的伸缩振动 以及 N–O 在 1350–1390 cm ^-1 附近的伸缩振动 .以上数据表明CDs表面可能存在一些官能团，这些官能团可能对CDs在水溶液中的高亲水性和稳定性起到重要作用。

一 CD 的 TEM 图像。 插入 显示 CD 的 HRTEM 图像。 b CD的XRD图谱。 c CD的拉曼光谱。 d CD的FTIR光谱。 e 添加 0.5 M H2O2 后 CD 的荧光变化。 插入 显示之前的 CD 照片（左 ) 和之后 (右 ) 在紫外光下加入 H2O2。 f 添加 0.5 M H2O2 后 CD 的比色变化。 插入 显示之前的 CD 照片（左 ) 和之后 (右 ) 在日光下加入 H2O2

在图 1e 所示的 CD 水溶液中测量了基于 CD 的纳米传感器对 H2O2 的荧光行为。在 365 nm 的单波长激发下，CD 解决方案说明了不对称发射光谱，这可以通过以 450 和 500 nm 为中心的双发射荧光带拟合，分别对应于蓝色和绿色荧光带。当 CD 溶液与 H2O2 混合时，蓝色带的强度比绿色带的强度降低更大。因此，根据添加 H2O2 后 CD 的激发-发射矩阵的结果，CD 的最强发射从 450 nm 移至 500 nm（附加文件 1：图 S2）。结果，CD 溶液的荧光颜色在 365 nm 紫外灯照射下从蓝色变为绿色（图 1e 的插图）。此外，在加入 H2O2 后，CD 溶液同时经历了从深红色到绿色的比色变化（图 1f 的插图）。这种颜色变化可归因于 CD 溶液中添加 H2O2 引起的 555 和 595 nm 附近吸收带的强度演变（图 1f）。总之，这些结果证实了CDs可以用作检测H2O2的双模式纳米传感器。

感知机制

为了研究传感机制，还表征了加入 H2O2 后 CD 的形态和荧光特性。如附加文件 1：图 S1a 和 S1c 中所示，将 H2O2 添加到 CD 溶液中会导致 CD 聚集，其尺寸范围为 30 到 60 纳米。在归一化吸收光谱中也显示了 H2O2 诱导的 CD 聚集（附加文件 1：图 S3）；即，CDs 的吸收带在可见光区从 555 nm 红移到 595 nm [15]。相应地，CD溶液的颜色由深红色变为绿色，同时CD的分散状态转变为聚集状态。添加H2O2前后CDs的XRD谱（图1b和附加文件1：图S4）变化很小，表明CDs的晶体结构没有变化。

通过荧光光谱研究了加入 H2O2 后制备的 CDs 的荧光演变。激发-发射矩阵表明，加入 H2O2 使 CD 的发射中心从 450 纳米变为 500 纳米（附加文件 1：图 S2）。对于在 450 和 500 nm 处发射的 CD，图 2a 中所示的荧光衰减曲线可以很好地拟合平均寿命分别为 7.96 和 7.12 ns（在 365 nm 激发下）的单指数衰减函数。相比之下，H2O2 处理后 CD 的荧光衰减寿命变为 4.53 和 4.83 ns（图 2b 和表 1）。同时，PL量子产率（η 当在 CD 溶液中加入 H2O2 时，CDs 的 int) 从 5.5% 变为 4.6%。考虑荧光寿命和PL量子产率的变化，可以得出结论，CDs和H2O2之间可能发生电荷转移（CT），这可能是导致CDs PL光谱变化的触发因素。

一 , b 之前 CD 的荧光衰减 (a ) 和之后 (b ) 添加 0.5 M H2O2。 c , d 之前的 CD 的 XPS (N1s) (c ) 和之后 (d ) 添加 0.5 M H2O2

测量了 CD 的 FTIR 和 XPS 光谱，以深入了解 H2O2 引起的化学成分和环境变化。附加文件 1 中显示的添加 H2O2 前后 CD 的 FTIR 光谱：图 S7 说明 N–O 在 1350–1390 cm ^-1 附近的伸缩振动 随 H2O2 的加入而增加，XPS 光谱的结果也证实了这一点。从完整的调查 XPS 光谱（附加文件 1：图 S8）观察到，H2O2 处理前后 CD 的 O 与 N 比分别为 1.57 和 3.85。 O/N 的增加表明 CD 中 N 的键合状态可能会随着 H2O2 的加入而改变，这与图 2c、d 所示的高分辨率 N1s XPS 光谱一致。从 N1s XPS 光谱的结果来看，CDs 中石墨 N 的含量随着 H2O2 的加入而增加。此外，在加入 H2O2 后，N1s 光谱中在 407.3 eV 处有一个额外的 N-O 态峰，这显然表明 H2O2 的输入导致 CD 表面态的变化。所有的调查都表明表面 N 框架可以通过添加 H2O2 来改变。

先前的报告表明，CD 的发射带与表面状态有关，例如 N 掺杂的自由基和脲基团 [5, 9, 12, 23,24,25]。同时，这些表面状态对外部物理或化学刺激敏感。在光物理和表面环境分析的基础上，我们提出了引入 H2O2 后荧光演化的机制（图 3）。所制备的 CD 的边缘状态由共轭吡咯 N 基团组成。这种类型的 N 态可能主要位于高能级。因此，被激发的电子可以非辐射弛豫到高能级表面 N 态，然后辐射转移到基态，并伴随着 450 nm 左右的荧光发射带。相比之下，由于 H2O2 和 CDs 之间的动态猝灭，CD 溶液的荧光强度略有降低，其中 CT 出现在 CDs 和 H2O2 之间，类似于之前的报道 [26,27,28,29]。否则，可以推断出高能荧光自由基（相关的 N 态）由于来自 H2O2 的羟基自由基的影响而转化为较低能的 N-O 态。因此，被激发的电子可能会随着从低能 N-O 态到基态的辐射跃迁而弛豫，在 500 nm 处具有绿色发射带，这也会导致 450 nm 荧光的静态猝灭。因此，CDs的主要发射带可以呈现从蓝色发射到绿色发射的变化。

之前（左 ) 和之后 (右 ) 加入 H2O2

CD 纳米传感器的评估

基于上述 CDs 的荧光和比色行为，我们开发了一种纳米传感器来检测 CDs 的 H2O2。所提出的传感系统由水溶液中适当浓度的 CD 组成（3.75 μg mL ^-1 , 附加文件 1:图 S9)，其中 CD 在该系统中充当比色和荧光报告者的双重功能。

提出的基于 CD 解决方案的纳米传感系统如图 4 所示。由 H2O2 引起的荧光和色度变化可以通过肉眼清晰地观察到（图 4c、f），其中一系列明显的颜色变化从蓝色到在紫外光和日光照射下可以观察到绿色和从暗红色到绿色。此外，CD 溶液中 H2O2 的加入也可以用荧光和吸收光谱定量表示（图 4a、d）。如图 4a 所示，随着 H2O2 浓度从 0 增加到 2 M，以 450 和 500 nm 为中心的荧光带逐渐减小。但是，H2O2 浓度的增加导致 450 nm 处荧光强度的不同降低(我 450) 和 500 纳米 (I 500），这与 CD 溶液中的荧光颜色变化非常吻合（图 4c）。因此，选择 500 nm 与 450 nm 的荧光强度比来监测 H2O2 浓度（图 4a、b）。较低的比率与蓝色发射有关，而在较高的I比率下肉眼可以观察到绿色荧光 500 到 I 450. 通过这些手段的线性检测范围从 0.05 到 0.5 M，具有线性相关性 R ² =0.987。类似地，由于吸收带在 555 和 595 nm 处的不均匀减小，CD 溶液中会发生比色变化。如图 4d 所示，可见光区域的吸收强度降低，但 H2O2 浓度的增加导致 595 nm 附近的吸收比 555 nm 附近的吸收降低得更慢。因此，在 595 nm (A 595) 到 555 nm (A 555) 也可用于测量 H2O2 浓度。 A的比例 595 到 A 555 从 0.05 以指数方式增加到 2 M，呈指数相关 R ² =0.999，并且比色变化与 0.05 至 0.25 M 的 H2O2 浓度范围密切相关，线性检测限 (LOD) 为 14 mM（附加文件 1：图 S11 和表 S1）。由于血浆中通过 GOD 反应产生的 H2O2 浓度约为毫摩尔 (~10 mM)，因此双模式纳米传感器具有该方法的适当灵敏度，可满足临床和医学要求 [20]。此外，双模纳米传感器具有内在的内置校准参考，因此可以消除强度波动等外部因素，有助于提高测试精度。

一 CDs 在不同 H2O2 浓度下的荧光光谱。 b I的校准曲线 500/我 450 个 CD 与 H2O2 浓度。 插入 显示I的线性检测范围 500/我 450 个 CD 与 H2O2 浓度。 c 不同浓度 H2O2 下荧光 CD 溶液的照片。 d CDs 在不同 H2O2 浓度下的 UV-Vis 光谱。 e A的校准曲线 595/A 555 个 CD 与 H2O2 浓度。 f 不同浓度H2O2下CD溶液的照片

为了评估纳米传感器对 H2O2 的选择性，在相同条件下使用一些常见的阳离子（如 Na ⁺ ）进行干扰测定 , K ⁺ , NH ⁴⁺ , Ca ²⁺ , Zn ²⁺ , 和 Fe ²⁺ .如图 5a、b 所示，已在不同阳离子存在下调查了 CD 的荧光和比色变化。在 Na ⁺ 存在下 , K ⁺ , NH4 ⁺ , Ca ²⁺ , Zn ²⁺ , 和 Fe ²⁺ ，I的荧光比 500 到 I 450和A的吸收比 595 到 A 555 与空白样品相比仅出现轻微的变化，这意味着这些阳离子对 H2O2 的检测几乎没有干扰。此外，我们还比较了其他氧化剂对 CDs 的影响，例如 HNO3、KClO3、FeCl3、NaClO、K2Cr2O7 和 KMnO4（图 5c、d 和附加文件 1：图 S12 和 S13），我们发现除了 K2Cr2O7 和 KMnO4 外，荧光颜色随着这些氧化剂的加入而从蓝色变为绿色。因此，我们可以通过荧光变化排除 K2Cr2O7 和 KMnO4 的干扰。此外，我们可以很容易地从A的吸收率结果中排除其他氧化剂如HNO3、KClO3、FeCl3和NaClO的影响 595 到 A 555. 因此，由于两种独立检测方法的协同效应，本文中展示的双模式纳米传感器在测定的高选择性方面可能非常有前途 [30,31,32,33]。此外，我们测量了加入 H2O2 后荧光变化的响应时间，发现注入 H2O2 后荧光降低，并保持稳定在 3.3 秒左右（附加文件 1：图 S14）。

一 , c 荧光比I 500/我 450 含有 CDs 和各种干扰阳离子 (a ) 和氧化剂 (c ）。 b , d 吸收率A 595/A 555 含有 CDs 和各种干扰阳离子的溶液 (b ) 和氧化剂 (d )

使用标准 CCK-8 测定法检查 A549 细胞的活力，以评估 CD 的细胞毒性。如图 6 所示，我们发现，即使在 500 μg mL ^-1 等高浓度 CD 下，将 A549 细胞与 CD 孵育 48 小时也可以获得近 80% 的存活率 .经计算，CDs的50%抑制浓度（IC50）约为1106 μg mL ^-1 由 GraphPad Prism 5.0 推断出 CD 具有良好的生物相容性和在高浓度下非常低的细胞毒性。此外，我们比较了先前报告的纳米传感器在附加文件 1：表 S2 中显示的 H2O2 测定的分析性能。检测的生物相容性、简单性和可视化与大多数这些报道的 H2O2 检测相当甚至更好。考虑到基于 CD 的双模式纳米传感器对 H2O2 检测具有良好的选择性，适当的检测限（LOD =14 mM）与血糖处于同一数量级，并且在高浓度 CDs 时细胞毒性非常低，因此纳米传感器是有望用于血糖检测等临床需求。

不同浓度CDs培养48h后A549细胞的细胞活力

结论

总之，我们提出了一种基于 CD 的双模式纳米传感器，具有比色和荧光输出，用于基于引入 H2O2 后 CD 溶液的荧光和比色变化定量检测 H2O2。纳米传感器简单易行，可实现 H2O2 的肉眼检测。纳米传感器的机理可归因于外部化学刺激如来自 H2O2 的羟基自由基导致表面性质的变化和 CDs 的聚集，这主导了 CDs 的发射和吸收。所提出的纳米传感器表现出良好的生物相容性，对 H2O2 的高选择性，线性检测范围为 0.05 至 0.5 M，检测限约为 14 mM，与 GOD 反应产生的 H2O2 水平相当。相信本文报道的策略可能为开发新型血糖传感器提供一种有前景的方法，该传感器在疾病诊断和环境测试中具有重要价值。