双模式碳纳米点传感器实现快速选择性过氧化氢检测
摘要
过氧化氢（H2O2) 是氧化酶酶促反应重要产物，如葡萄糖/葡萄糖氧化酶（GOD）反应。因此，探测生成 H2O2 以实现各种碳水化合物及其氧化酶检测极具意义。本文报道一种双发射碳纳米点（CDs）可作为新型双模式纳米传感器，同时具备荧光和比色双重输出，用于 H2O2 选择性检测。双模式纳米传感器仅由未修饰双发射 CDs 建立，向 CD 溶液加入不同浓度 H2O2 观测到显著荧光和比色变化，有利于 H2O2 肉眼检测。纳米传感器机制归因于 H2O2 产生的羟基自由基等外部化学刺激引起 CDs 表面性质改变和聚集，主导 CDs 发射和吸收。构建的双模式纳米传感器表现出良好生物相容性和对 H2O2 高选择性，线性检测范围 0.05–0.5 M，检测限低至 14 mM。
背景
荧光碳纳米点（CDs）因良好生物相容性、低毒性、可调光致发光（PL）和高量子产率等独特理化性质引发广泛研究关注。基于上述特性，CDs 在生物成像、生物传感器、发光器件等领域找到潜在应用[1,2,3,4,5,6,7,8,9]。此外，因上转换和下转换能力、无光学闪烁、比有机染料或半导体量子点（QDs）更高光稳定性，CDs 更适合通过荧光增强或淬灭用于荧光纳米传感器[10,11,12,13,14,15,16,17,18,19]。
过氧化氢（H2O2) 是常见氧化剂，因灭菌能力常用作医用消毒剂。此外，H2O2 也是氧化酶酶促反应重要产物，如葡萄糖/葡萄糖氧化酶（GOD）反应。因此，通过探测 H2O2 传感策略可作为碳水化合物及其氧化酶检测有希望途径。因此，H2O2 传感可用于监测碳水化合物代谢疾病如糖尿病。目前，虽利用多种分析方法开发各种基于 H2O2 测定葡萄糖传感器，但前报道传感系统主要基于单一信号，如电导、荧光或比色变化[20,21,22]。近年，纳米技术进步，特别是荧光纳米颗粒如半导体 QDs 和新兴碳基纳米颗粒带来新型 H2O2 纳米传感器。Lu 等人[20] 结合 CdTe QDs 和罗丹明开发双发射微杂化体（DEMBs），通过监测 H2O2 生成实现葡萄糖比率荧光传感。Zhang 等人[21, 22] 报道通过 CDs 荧光淬灭对 H2O2 表现出选择性敏感响应荧光纳米传感器。然而这些工作不可避免带来半导体基 QDs 固有缺陷，如昂贵化学成分和重金属污染。此外，基于单一信号读出（荧光淬灭或变色）纳米传感器可能因环境因素波动和实验操作误差导致分析稳定性差。基于上述考虑，我们希望开发新型荧光 CDs，其荧光和溶液颜色对 H2O2 浓度变化极敏感。因此，基于此类 CDs 双模式纳米传感器可通过同时检测 CD 溶液荧光和比色变化实现独特灵敏 H2O2 传感，有利于 H2O2 肉眼检测实现。
本研究开发简便方法合成新型 CDs，可见光下呈暗红色溶液，365 nm UV 灯下显示双荧光发射（蓝光和绿光发射）。CDs 通过溶剂热法简单合成，以柠檬酸、尿素和 N,N-二甲基甲酰胺（DMF）分别为碳源、氮源和反应溶剂。荧光和溶液颜色对 H2O2 浓度变化极敏感。因此，基于此类 CDs 双模式纳米传感器可通过同时检测 CD 溶液荧光和比色变化实现独特灵敏 H2O2 传感，有利于 H2O2 肉眼检测实现。无需引入任何昂贵仪器，基于此类 CDs 双模式纳米传感器已建立。此传感系统可有效避免潜在操作误差，显著提高测量可靠性。此外，CD 基纳米传感器因良好生物相容性和高水溶性，在体内外血糖检测应用前景广阔。
方法
CDs 合成
CDs 采用溶剂热法制备，柠檬酸为碳源，尿素为氮源，DMF 为协同反应物。典型实验中，柠檬酸（1 g）和尿素（2 g）溶于 10 mL DMF。溶液转移至 25 mL 聚四氟乙烯衬里高压釜，160 °C 加热 4 h。反应后，高压釜自然冷却至室温。获得暗红色溶液。向 25 mL 无水乙醇加入 5 mL 反应溶液沉淀 CDs，7500 rpm 离心 30 min。然后透析沉淀获得纯 CDs。制备 CDs 收集并在 60 °C、<1 Pa 真空干燥箱干燥 12 h。然后用去离子水重新溶解 CDs 形成 0.75 mg mL−1 CD 溶液供进一步研究。后续 H2O2 处理 CDs 用相同方法收集干燥用于表面形貌和结构性质表征。
测量
CDs 表面形貌用高分辨透射电镜（HRTEM, JEOL JSM-IT100）表征。CDs 结构性质用 X 射线衍射仪（XRD, PA National X'Pert Pro）和微拉曼光谱仪（Renishaw RM 2000）测定。CDs 吸收光谱用日立 U-3900 UV-Vis-NIR 分光光度计测量。CDs 荧光光谱用分光光度计（Hitachi F-7000）测量。CDs 荧光量子产率用配备校准积分球 Horiba FL-322 光谱仪获得。CDs 荧光衰减曲线用 Horiba FL-322 测量，405 nm NanoLED 监测 450 和 500 nm 发射。CDs 傅里叶变换红外光谱（FTIR）用 Bio-Rad Excalibur 光谱仪（Bruker Vector 22）记录。X 射线光电子能谱（XPS）用 Mg 激发源在 ESCALAB MK II X 射线光电子能谱仪记录。
CD 纳米传感器建立
为检测 H2O2，在 PBS 缓冲液（pH = 7.4，25 °C）中考察 H2O2 存在下 CDs 荧光和吸收光谱。典型实验中，不同量 H2O2 先与蒸馏水混合，然后将 20 μL 0.75 mg mL−1 CD 溶液注入 4 mL 不同浓度 H2O2 溶液（0, 0.05, 0.1, 0.15, 0.25, 0.5, 1.0, 2.0 M）。加入 CDs 后拍照、测量荧光和吸收光谱。
也评估 CD 基纳米传感器选择性。CD 溶液（20 μL, 3.75 μg mL−1）与不同阳离子和氧化剂（4 mL, 0.1 M）混合，振荡 1 min。最后加入 CDs 后记录溶液 UV-Vis 吸收和荧光光谱。
结果与讨论
CDs 表征
制备 CDs 形貌用透射电镜（TEM）测量。图 1a 显示 CDs 分散良好，尺寸均匀范围 2.5–6.5 nm，平均直径约 5 nm（附件 1: Figure S1b）。此外，HRTEM 图像（图 1a 插图）显示 0.21 nm 衍射条纹，与石墨 (100) 晶面吻合。CDs XRD 图谱（图 1b）显示约 23.4° 宽峰，对应高度无序碳原子、石墨类碳结构。CDs 拉曼光谱（图 1c）显示两带：D 带（~1347 cm−1，源于 sp3 杂化碳缺陷无序振动）和 G 带（~1577 cm−1，关联二维六方晶体结构中 sp2 杂化碳 E2g 振动模式）。CDs FTIR 光谱（图 1d）呈现 3100–3600 cm−1 O–H/N–H 宽振动吸收带、~1690–1610 cm−1 C=O/C=C 伸缩振动和 ~1350–1390 cm−1 N–O 伸缩振动。上述数据表明 CDs 表面可能存在官能团，这些官能团可能在 CDs 水溶液高亲水性和稳定性中起重要作用。
基于 H2O2 CD 纳米传感器荧光行为在 CD 水溶液中测量，见图 1e。单波长 365 nm 激发下，CD 溶液呈现不对称发射光谱，可用双发射荧光带拟合，中心分别位于 450 和 500 nm，对应蓝光和绿光荧光带。CD 溶液混合 H2O2 后，蓝带强度下降大于绿带。因此，加入 H2O2 后 CDs 激发-发射矩阵结果显示 CDs 最强发射从 450 nm 转移至 500 nm（附件 1: Figure S2）。结果，UV 灯照射下 CD 溶液荧光颜色从蓝变绿（图 1e 插图）。此外，加入 H2O2 后 CD 溶液同时经历比色变化，从暗红变绿（图 1f 插图）。此颜色变化归因于 H2O2 加入 CD 溶液导致 ~555 和 595 nm 吸收带强度演变（图 1f）。综上，结果证实 CDs 可用作 H2O2 检测双模式纳米传感器。
传感机制
为研究传感机制，表征加入 H2O2 后 CDs 形貌和荧光性质。如附件 1: Figures S1a 和 S1c 所示，向 CD 溶液加入 H2O2 导致 CDs 聚集，尺寸 30–60 nm。H2O2 诱导 CDs 聚集也在归一化吸收光谱显现（附件 1: Figure S3）；即 CDs 可见光区吸收带从 555 nm 红移至 595 nm[15]。相应地，CD 溶液颜色随 CDs 分散态转变为聚集态从暗红变绿。CDs 加入 H2O2 前后 XRD 光谱（图 1b 和附件 1: Figure S4）变化很小，表明 CDs 晶体结构无变化。
加入 H2O2 后制备 CDs 荧光演变用荧光光谱研究。激发-发射矩阵显示 H2O2 使 CDs 发射中心从 450 nm 变为 500 nm（附件 1: Figure S2）。图 2a 显示发射 450 和 500 nm 处 CDs 荧光衰减曲线可用单指数衰减函数良好拟合，平均寿命分别 7.96 和 7.12 ns（365 nm 激发）。相反，H2O2 处理后 CDs 荧光衰减寿命变为 4.53 和 4.83 ns（图 2b 和表 1）。同时，加入 H2O2 后 CDs PL 量子产率（ηint) 从 5.5% 变为 4.6%。考虑荧光寿命和 PL 量子产率变化，可得出 CDs 与 H2O2 间可能发生电荷转移（CT），可作为触发改变 CDs PL 光谱因素。
测量 CDs FTIR 和 XPS 光谱以深入了解 H2O2 引起化学组成和环境变化。加入 H2O2 前后 CDs FTIR 光谱（附件 1: Figure S7）显示 ~1350–1390 cm−1 N–O 伸缩振动随 H2O2 加入增强，全谱 XPS 光谱结果（附件 1: Figure S8）也确认此点。观测到 CDs H2O2 处理前后 O/N 比分别为 1.57 和 3.85。O/N 比增加揭示 CDs 中 N 键合态随 H2O2 加入可能改变，与高分辨 N1s XPS 光谱一致（图 2c, d）。N1s XPS 光谱结果显示 CDs 中石墨 N 含量随 H2O2 加入增加。此外，加入 H2O2 后 N1s 谱出现 407.3 eV 附加 N–O 态峰，明显证明 H2O2 引入导致 CDs 表面态变化。所有调查表明 CDs 表面 N 骨架可被 H2O2 加入改变。
先前报道表明 CDs 发射带与表面态相关，如 N 掺杂自由基和脲基团[5, 9, 12, 23,24,25]。同时这些表面态对外部物理化学刺激敏感。基于光物理和表面环境分析，我们提出 H2O2 引入荧光演变机制（图 3）。制备 CDs 边缘态由共轭吡咯 N 基团组成。此类 N 态可能多定域于高能级。因此激发电子可非辐射弛豫至高能级表面 N 态，再辐射跃迁至基态伴随 ~450 nm 荧光发射带。相反，CD 溶液荧光强度因 H2O2 与 CDs 动态淬灭轻微下降，CT 在 CDs 和 H2O2 间产生，类似前人报道[26,27,28,29]。否则可推断高能荧光自由基（相关 N 态）在 H2O2 羟基自由基作用下转化为低能 N–O 态。因此激发电子多从低能 N–O 态辐射跃迁至基态伴随 500 nm 绿光发射带，也导致 450 nm 荧光静态淬灭。因此 CDs 主发射带可呈现从蓝光发射向绿光发射变化。
CDs 纳米传感器评估
基于上述 CDs 荧光和比色行为，我们开发纳米传感器利用 CDs 检测 H2O2。提议传感系统由适当浓度水溶液中 CDs 组成（3.75 μg mL−1，附件 1: Figure S9），CDs 在此系统中双重功能作为比色和荧光报告分子。
图 4 展示基于 CD 溶液提议纳米传感系统。H2O2 引起荧光和比色变化可清晰肉眼观测（图 4c, f），UV 光和日光照射下观测到从蓝变绿、暗红变绿一系列明显颜色变化。此外，向 CD 溶液加入 H2O2 也可用荧光和吸收光谱定量表达（图 4a, d）。图 4a 显示 H2O2 浓度 0 至 2 M 增加时，中心 450 和 500 nm 荧光带逐渐下降。然而，H2O2 浓度增加导致 450 nm（I450）和 500 nm（I500）荧光强度下降程度不同，与 CD 溶液荧光颜色变化吻合（图 4c）。因此选择 500 nm 与 450 nm 荧光强度比监测 H2O2 浓度（图 4a, b）。低比值关联蓝光发射，高 I500/I450 比值肉眼观测到绿光荧光。线性检测范围 0.05–0.5 M，线性相关 R2 = 0.987。类似地，CD 溶液因 555 和 595 nm 吸收带非均匀下降发生比色变化。图 4d 显示可见光区吸收强度下降，但 H2O2 浓度增加导致 595 nm 吸收下降慢于 555 nm。因此 595 nm 吸收（A595）与 555 nm 吸收（A555）比也可测量 H2O2 浓度。A595/A555 比 0.05–2 M 指数增长，指数相关 R2 = 0.999，比色变化与 0.05–0.25 M H2O2 浓度范围线性相关，线性检测限（LOD）14 mM（附件 1: Figure S11 和 Table S1）。双模式纳米传感器此方法适当灵敏度满足临床药用要求，因 GOD 反应产生 H2O2 浓度在血浆中约毫摩尔级（~10 mM）[20]。此外，双模式纳米传感器具内置校准基准，可消除强度波动等外部因素，提升测试准确性。
为评估纳米传感器对 H2O2 选择性，同等条件下用常见阳离子如 Na+、K+、NH4+、Ca2+、Zn2+、Fe2+ 进行干扰实验。图 5a, b 显示 CDs 荧光和比色变化在不同阳离子存在下调查。Na+、K+、NH4+、Ca2+、Zn2+、Fe2+ 存在下，CDs 荧光比 I500/I450 和吸收比 A595/A555 与空白样品相比仅轻微变化，意味着这些阳离子对 H2O2 检测干扰极小。此外，我们用其他氧化剂如 HNO3、KClO3、FeCl3、NaClO、K2Cr2O7、KMnO4 对比对 CDs 影响（图 5c, d 和附件 1: Figures S12, S13），发现除 K2Cr2O7 和 KMnO4 外加入这些氧化剂荧光颜色均从蓝变绿。因此可通过荧光变化排除 K2Cr2O7 和 KMnO4 干扰。另外，可从 A595/A555 吸收比结果轻松排除 HNO3、KClO3、FeCl3、NaClO 等其他氧化剂影响。因此本文演示双模式纳米传感器因两独立检测方法协同效应在高选择性测定上极具前景[30,31,32,33]。此外，测量加入 H2O2 后荧光响应时间，发现荧光注入 H2O2 后下降约 3.3 s 稳定（附件 1: Figure S14）。
用标准 CCK-8 分析 A549 细胞活性评估 CDs 细胞毒性。图 6 显示即使高浓度 CDs 如 500 μg mL−1，孵育 A549 细胞 48 h 仍获近 80% 活性。用 GraphPad Prism 5.0 计算 CDs 50% 抑制浓度（IC50）约 1106 μg mL−1，推断 CDs 高浓度下具良好生物相容性极低细胞毒性。此外，对比前报道 H2O2 测定纳米传感器分析性能（附件 1: Table S2）。生物相容性、简便性和可视化检测与大多数报道 H2O2 分析相当甚至更好。考虑 CD 基双模式纳米传感器对 H2O2 检测良好选择性、与血糖同量级适当检测限（LOD = 14 mM）及高浓度 CDs 极低细胞毒性，纳米传感器有望用于血糖及其他临床需求检测。
结论
总之，我们提出基于 CDs 双模式纳米传感器，具备比色和荧光双重输出，基于 H2O2 引入导致 CD 溶液荧光和比色变化实现 H2O2 定量检测。纳米传感器简便易行实现 H2O2 肉眼检测。纳米传感器机制归因于 H2O2 羟基自由基等外部化学刺激引起 CDs 表面性质改变和聚集，主导 CDs 发射和吸收。提议纳米传感器表现出良好生物相容性、对 H2O2 高选择性，线性检测范围 0.05–0.5 M，检测限约 14 mM，与 GOD 反应产生 H2O2 水平相当。相信本文报道策略可为开发血糖新型传感器提供有希望途径，在疾病诊断和环境检测中具价值。
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