磁性石墨烯场效应晶体管生物传感器实现超灵敏单链DNA检测

摘要

本工作展示了一种磁性石墨烯场效应晶体管（MGFET）生物传感器，通过将化学气相沉积（CVD）石墨烯薄膜转移至玻璃基底形成导电通道和传感层。石墨烯表面用1-芘丁酸琥珀酰亚胺酯（PBASE）功能化，作为分子锚固定探针适配体。磁标记互补单链DNA（cDNA）通过与适配体杂交捕获，相互作用转化为可测量的阻抗变化。在周期性调制磁场下，MGFET阻抗呈现振荡，其振幅与cDNA浓度成正比。利用此原理，传感器以1 pM检测限检测单链DNA。观测行为可用模型解释：磁力弯曲DNA-磁珠复合物，从而调制石墨烯通道双电层电容。施加周期性磁场可重复采样阻抗，通过多周期积分增强信噪比（SNR）。研究展示了高灵敏DNA生物传感器，并提示其在其他生物分子和细胞检测中的潜在应用。

引言

DNA检测对分子生物学研究和遗传疾病诊断至关重要[1-3]。过去十年，基于荧光[4,5]、电化学[6-9]和场效应晶体管（FET）[10-13]的生物传感器已开发，FET型传感器因其固有灵敏度和特异性受特别关注。Kaisti等引入肽核酸功能化FET检测未标记单链DNA[12]，Kim等制备互补金属氧化物半导体（CMOS）基DNA电荷传感器[13]。石墨烯凭借卓越表面积、电导率和载流子迁移率，成为构建FET生物传感器的理想平台[14-16]。Cai等报道石墨烯FET（GFET）通过肽核酸杂交实现超灵敏DNA检测[15]，我们组先前演示多通道GFET研究DNA结合动力学和碱基错配[16]。常规GFET中外部栅极电极产生电场在石墨烯-电解质界面建立双电层[17-19]，调制器件电导。近期研究用GFET达飞摩尔级检测限[20,21]；但此类高灵敏度依赖昂贵半导体分析仪和Ag/AgCl参比电极，限制实际部署。为克服这些挑战，我们设计磁性石墨烯FET（MGFET），用磁场而非电栅极调制石墨烯通道。MGFET包含转移至玻璃基底的CVD石墨烯薄膜，两侧夹氧化铟锡（ITO）电极。石墨烯经PBASE功能化，实现探针适配体共价连接捕获磁标记cDNA。周期性磁场下，MGFET阻抗以与cDNA浓度相关方式振荡。这种磁法消除直接电极接触，简化集成并拓宽适用性。以下章节详述该新型MGFET生物传感器的制备、检测系统和检测机制。

方法

材料与仪器

带ITO电极玻璃基底来自华南祥程有限公司（中国）。探针适配体、cDNA和错配DNA从桑根生物（上海）购买。适配体序列（5'-NH₂-TGG ACC CCC TCA TAA CGC CTC CTT TTC-FAM-3'）；互补DNA（cDNA）序列（5'-NH₂-GAA AAG GAG GCG TTA TGA GGG GGT CCA-3'）；完全错配DNA（5'-NH₂-TCC CCT TCT TAT GGC CTG TTT TTC AAC-3'）；单碱基错配DNA（5'-NH₂-GAA AAG GAG TCG TTA TGA GGG GGT CCA-3'）。PBASE和二甲基亚砜（DMSO）从Sigma-Aldrich（上海）获取。羧基功能化磁性纳米珠（MBs，10 mg/mL）从西安峰纳米材料科技（南京）购买。1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、十二烷基苯磺酸钠（SDS）和磷酸缓冲盐水（PBS，pH 7.4）从Sigma-Aldrich（上海）购买。

拉曼光谱仪（SPEX-1403，SPEX）表征石墨烯质量并确认PBASE功能化。荧光光度计（LS55，PerkinElmer）量化磁性纳米粒子与cDNA偶联效率。自制数据采集系统记录实时MGFET阻抗。

cDNA与MBs偶联

超声20 min后，20 μL 4 mg/mL MB悬浮液与200 μL 2 mg/mL EDC和200 μL 2 mg/mL NHS混合孵育15 min活化MBs[22,23]。随后加入20 μL cDNA，室温轻微振荡孵育2 h。磁场富集MB/cDNA偶联物，PBS洗涤三次后重悬备用。

MGFET制备

MGFET三步制备：(1) CVD石墨烯薄膜转移至玻璃板作为两ITO电极间导电通道（图1a）。(2) 10 mM DMSO中PBASE溶液在石墨烯上孵育12 h室温，通过π-π堆积与石墨烯晶格结合（图1b）。用DMSO和PBS冲洗去除多余PBASE。(3) 引入2 μM探针适配体溶液孵育4 h室温，通过PBASE琥珀酰亚胺酯共价偶联（图1c）。最后用0.2% SDS洗涤三次去除未结合适配体。

结果与讨论

MGFET表征

CVD石墨烯薄膜成功转移至玻璃基底，拉曼光谱确认（图2）。G、D、2D峰存在表明高质量石墨烯；I₂D/I_G比值确认多层薄膜，低I_D/I_G比值证实缺陷极少[24-26]。

直接将适配体连接纯石墨烯因缺乏官能团而困难；故PBASE作为π-π锚定连接子。PBASE琥珀酰亚胺基通过NHS化学与适配体5'-NH₂反应（图1c）。适配体固定成功经3'-FAM荧光强度确认（图3）。荧光随适配体浓度增加至~2 μM饱和，指示表面饱和。后续实验采用2 μM适配体浓度。

MB/cDNA表征

透射电镜显示MBs直径~7 nm（图4a,b）。为最大化捕获效率，用4 mg/mL MB浓度活化。偶联效率通过监测上清液FAM荧光下降确认（图4d）。10 nM cDNA完全富集，上清液荧光水平回到PBS水平为证。

磁场强度分析

MB/cDNA与MGFET孵育10 min后，PBS洗涤去除未结合MBs，仅留MB/cDNA于传感器（图1d）。永磁体安装旋转电机施加周期性磁场（图1e）。自制检测装置记录MGFET阻抗。

研究磁场强度与MGFET阻抗关系以确定最佳场参数（图5）。MGFET中磁力弯曲MB/cDNA复合物，改变复合物与石墨烯表面距离，进而调制双电层电容。观察三区域：(1) <100 mT，磁力不足弯曲DNA，阻抗变化可忽略；(2) 100-200 mT，快速弯曲产生显著阻抗响应；(3) >220 mT，DNA杆达弯曲极限，阻抗稳定（图5b）。该弹性杆模型与DNA力学前人报道吻合[29,30]。

cDNA检测

固定240 mT磁场，记录不同MB/cDNA浓度下阻抗变化（图6a）。周期性磁场诱导清晰阻抗振荡。为抑制噪声，采用样本积分算法（SIA）：(1) 非磁周期（T₀）采集数据点归一化为零；(2) 各磁周期（T_M）采样点平均；四周期后提取周期性阻抗变化（图6b）。该方法利用重复采样有效增强SNR。

阻抗变化与cDNA浓度呈线性关系（图7）。高灵敏度源于：(1) MB/cDNA复合物机械弯曲放大石墨烯双电层调制；(2) 周期性磁场允许基于SIA的噪声抑制。增加磁周期数可进一步提升系统SNR。

MGFET选择性

用完全错配DNA和单碱基错配DNA（均偶联MBs）评估选择性。经10 min孵育MGFET和PBS洗涤后，完全错配MB/DNA复合物大多去除，阻抗变化可忽略（图8a），确认高选择性。单碱基错配DNA产生阻抗变化略低于全互补链但高于非互补对照，证明传感器能区分单碱基错配（图8b）。选择性主要由适配体内在特异性决定，MGFET架构贡献整体灵敏度。

结论

我们开发了一种磁性石墨烯FET生物传感器，利用磁标记DNA和周期性磁场将结合事件转化为阻抗振荡。磁力机械弯曲MB/cDNA复合物，调制石墨烯双电层，实现单链DNA 1 pM检测限。周期性磁场基于信号积分实现噪声抑制，进一步增强灵敏度。除DNA检测外，该平台为测量核酸力学性质和检测其他生物分子或细胞提供通用框架。

数据与材料可用性

本研究生成或分析的所有数据均包含在文章中。

缩略语

cDNA：

磁标记互补单链DNA

CVD：

化学气相沉积

DMSO：

二甲基亚砜

FET：

场效应晶体管

GFET：

石墨烯场效应晶体管

MBs：

磁性纳米珠

MGFET：

磁性石墨烯场效应晶体管

NHS：

N-羟基琥珀酰亚胺

PBASE：

1-芘丁酸琥珀酰亚胺酯

PBS：

十二烷基硫酸钠磷酸缓冲盐水

SDS：

十二烷基苯磺酸钠

SIA：

样本积分算法

TEM：

透射电镜

ITO：

氧化铟锡