表面修饰固态纳米孔增强过氧化氢检测

摘要

分子检测技术多样，但基于溶液中固态纳米孔的检测是当前极具前景的高通量、低成本技术。本研究制备固态纳米孔平台检测过氧化氢（H₂O₂），该物质不仅是无标记产物还是氧化还原反应关键参与者。成功利用聚焦Ga离子束制备直径~50 nm氮化硅（Si₃N₄）纳米孔，通过碳二亚胺偶联化学将辣根过氧化物酶（HRP）固定化于纳米孔内表面。固定化HRP酶能在单纳米孔通道诱导氧化还原反应。实时监测并研究了单个聚集ABTS•⁺分子易位事件。设计的固态纳米孔生物传感器可逆，可多次检测H₂O₂。

研究背景

纳米孔检测技术源于库尔特计数器和细胞离子通道。纳米孔检测溶液中通过的带电分子，分子进入纳米孔改变孔导电度，产生电流信号变化，电流变化提供分子尺寸浓度信息，揭示易位动力学。可检测纳米颗粒、病毒、蛋白质、DNA序列等纳米物体。纳米孔分生物纳米孔和固态纳米孔。生物纳米孔信噪比低但分辨率高，可检测小分子未折叠蛋白。固态纳米孔尺寸可调、稳定性高。固态纳米孔通常钻刻在薄膜上，将流体池分为两部分。薄膜纳米孔两侧施加偏压产生离子电流。固态纳米孔可检测分析折叠/未折叠蛋白，也可检测蛋白相互作用、蛋白动力学。为突破检测范围限制，化学修饰固态纳米孔被广泛应用，用于检测单链DNA和蛋白质。H₂O₂定量检测方法多基于光谱法、化学发光、安培法、电化学法。常规光谱化学发光法耗时昂贵。固态纳米孔传感器耗材少、结构简单，可检测小分子。本文呈现HRP修饰固态纳米孔：HRP固定化于纳米孔内表面，在H₂O₂存在下单纳米孔通道内HRP保持氧化还原活性。氧化还原产生的ABTS•⁺聚集后通过纳米孔，易位事件可被检测。该HRP修饰固态纳米孔通过检测聚集ABTS•⁺间接实现H₂O₂传感，结构简单、试剂消耗低，对单分子检测和纳米孔内分子组装有指导意义。

研究方法

化学品与材料

辣根过氧化物酶（HRP，1 mg/mL，EC 1.11.1.7，44 kDa）购自西雅试剂（成都）。HRP溶于0.02 μm过滤0.1 M PBS，4°C保存，制备两天内用完。KCl、EDC、NHS、ABTS（98%）购自迪博化学（上海）。H₂O₂（30%）购自国药试剂。3-氨基丙基三乙氧基硅烷（3-APTES）购自Sigma-Aldrich。实验用Millipore Milli-Q超纯水（18.2 MΩ·cm，25°C），经0.02 μm过滤。仪器包括FEI Strata 201 FIB系统、Malvern Zetasizer Nano ZS、Axon Axopatch 700B。仪器图见补充材料（附件1：图S1）。

固态纳米孔制备与电学测量

先在300 μm厚Si衬底上沉积100 nm Si₃N₄薄膜。光刻开窗（500×500 μm²）。FEI Strata 201 FIB系统用30 kV加速电压、1 pA电流轰击Ga⁺离子钻孔，聚焦模式下1.5 s。得固态纳米孔芯片，80°C鲜配piranha溶液清洗30 min，超纯水冲洗。组装定制特氟龙池，两个Viton O型圈分隔芯片两侧形成双储液池，确保离子电流仅经纳米孔。Ag/AgCl电极连接流体池和斜板钳放大器（Axopatch 700B），100 kHz采样率恒压测离子电流，内置八极Bessel低通滤波器设10 kHz。整套仪器置于双法拉第笼。

结果与讨论

纳米孔HRP固定化

选取直径~50 nm纳米孔浸80°C piranha溶液30 min。处理后内表面获硅羟基。全膜经3-APTES活化生成氨基（-NH₂）。随后纳米孔芯片置入含EDC（10 mM）和NHS（20 mM）的0.1 M PBS溶液，再引入HRP（10 ng/ml）。据前期研究[3]，0.1-2 M KCl、pH 7.0下HRP不聚集。HRP等电点pI=4.3±0.2，证实0.1 M KCl pH 6.0和7.0下不聚集。EDC活化HRP羧基（-COOH）成高反应性O-酰异脲中间体，NHS存在下转化为更稳定琥珀酰亚胺胺反应性酯，与纳米孔内表面生成的-NH₂共价偶联形成稳定酰胺键（图1）。此过程实现HRP在单纳米孔内表面固定化。通过测量修饰前后单纳米孔I-V曲线确认功能化实现（图2）。

HRP修饰固态纳米孔表征

单Si₃N₄纳米孔通道呈圆柱形。图2给出0.1 M KCl、pH 7.0 PBS缓冲下未修饰和修饰纳米孔典型I-V曲线。HRP酶修饰内表面后孔径变小。据Wanunu等公式（1）计算孔径：考虑几何效应，修饰后有效尺寸可计算。未修饰纳米孔电导G_unmodified~15 nS，0.1 M KCl（25°C）电导率σ~1.28 S/m，计算直径~51 nm，接近实测值。同法得修饰纳米孔电导G_modified~7.5 nS，直径~34 nm。直径减小因两方面：3-APTES处理使内表面获-NH₂；HRP酶流体动力学直径Dh~8 nm，固定化HRP减小孔径。此~34 nm HRP修饰纳米孔作为H₂O₂检测通道。

氧化还原反应原理

单修饰纳米孔内进行氧化还原反应，过程符合文献[58]机制。H₂O₂（0.5 mM）存在下，纳米孔内表面固定化HRP瞬间转化为化合物1。化合物1从还原底物ABTS（1.5 mM）接受一个电子生成化合物2。化合物2再从另一ABTS分子接受一个电子还原回静止酶。氧化还原产生的阳离子产物ABTS•⁺在单纳米孔内累积。累积分子易位改变导电度(G)，产生电流变化(ΔI_b)。反应方程式见文中。

易位事件检测

实验用HRP修饰纳米孔（修饰孔径~34 nm），0.1 M KCl、pH 7.0 PBS。ABTS（1.5 mM）和H₂O₂（0.5 mM）加入纳米孔trans侧。加试剂后施加-100至-800 mV偏压，100 kHz采样。-400 mV前无易位事件。图3展示-400至-800 mV不同电压下代表性离子电流易位轨迹。长时程不同电压易位事件数据见补充材料（附件1：图S3）。观察到毫秒级电流阻断事件。加H₂O₂和ABTS至trans室，HRP固定化于单纳米孔内表面，发生氧化还原反应。产生大量ABTS•⁺分子，单个较小ABTS•⁺可能因系统分辨率难检测，但这些分子生成后会聚集，故可检测聚集ABTS•⁺。施加负电压，聚集ABTS•⁺通过纳米孔。负电压下存在电泳和电渗流。HRP在0.1 M KCl、pH 7.0 PBS中带负电，形成双电层，电渗流向负电极方向。因此电泳和电渗流同向，聚集ABTS•⁺在单纳米孔通道内向负电极方向输运。

易位事件统计分析

偏压在聚集ABTS•⁺易位中起关键作用，讨论HRP修饰纳米孔聚集ABTS•⁺电流阻断随施加电压影响。易位事件发生频率随电压增加显著提高（图3f）。电压增加电流振幅增大。但偏压低于-300 mV时易位事件逐渐消失，表明聚集ABTS•⁺通过HRP修饰纳米孔需-300 mV阈值电压。图4显示不同电压下聚集ABTS•⁺平均电流振幅直方图。拟合曲线给出峰值电流阻断(ΔI_b)：-400、-500、-600、-700、-800 mV分别为308.4±27.795、419.1±20.354、478.8±32.857、528.1±36.98、606.9±40.916 pA。电流振幅值一阶多项式拟合得斜率-0.706、截距49.262。驻留时间值：-400至-800 mV分别为54.5±21.374、42.8±20.181、10.3±3.05、6.0±1.744、4.0±1.441 ms。图3h用指数衰减函数(t_d~e^(-v/v0))拟合驻留时间随电压依赖。驻留时间直方图见补充材料（附件1：图S4）。电流阻断与事件驻留时间二维散点图（图5）显示-400至-800 mV聚集ABTS•⁺呈事件簇，主簇源于聚集ABTS•⁺通过HRP修饰固态纳米孔。单次易位事件分析显示每电压下电流阻断由同尺寸同电荷物质诱导，判定每事件由单个聚集ABTS•⁺引起。分析聚集ABTS•⁺易位时间：电流阻断持续时间t_d视为单个聚集ABTS•⁺从生成位置至纳米孔出口驻留时间。考虑可能有HRP固定化于纳米孔入口催化氧化还原，额外实验验证反应发生于单纳米孔内表面而非入口。用未HRP修饰但3-APTES活化的纳米孔，同浓度HRP、ABTS、H₂O₂加入trans室，施加负偏压，电泳力使HRP无法通过纳米孔。虽氧化还原产生聚集ABTS•⁺，但未发现易位事件。推测聚集ABTS•⁺与HRP静电效应阻止其通过。图6给出不同电压下聚集ABTS•⁺导电度变化(ΔG)与事件驻留时间二维散点图。ΔG主要集中~0.8 nS，易位事件形状近似相同。ΔG均值~0.8 nS。推测每个聚集ABTS•⁺体积排除效应近似相同。聚集ABTS•⁺静电和空间位阻效应可能改变离子电流。观察到两种典型正电荷聚集ABTS•⁺易位电流轨迹形状（图7）。以-700 mV为代表分析两类事件百分比：第一类事件百分比随电压升高增加，第二类减少。认为高电压使易位更快。电流阻断信号揭示聚集ABTS•⁺通过单纳米孔通道的尺寸、构象和相互作用。对电流形状变化过程推测：事件1电流信号有典型波动部分，强度深、驻留时间短，可能聚集ABTS•⁺从生成处通过纳米孔，通过后离子电流恢复基线(I₀)；事件2有深强度波动后呈水平平台，归因于聚集ABTS•⁺与纳米孔出口HRP静电相互作用，电流缓慢恢复基线。为理解电流变化，从开孔导电度变化(G_pore)在0.1 M KCl下着手。前期研究给出低盐浓度下带负电圆柱纳米孔开孔导电度方程(2)。本实验纳米孔化学修饰、直径改变，表面电荷密度σ_p难精确获取，故按公式(1)计算G_pore~7.5 nS。导电度变化推测源于两原因[15]：一、纳米孔离子体积排除被聚集ABTS•⁺占据，导电度降低(ΔG⁻)；二、聚集ABTS•⁺带入离子增加导电度。本实验ABTS•⁺在纳米孔内产生，无离子带入，故ΔG仅由体积排除诱导，ΔG=ΔG⁻。体积排除导电度降低按公式(4)计算，γ为颗粒形状因子，本工作将聚集ABTS•⁺简化为球状对象，γ=1，Λ为体积排除。体溶液电导率σ=1.28 S/m。体积排除Λ可从其他分子易位事件推导。应用欧姆定律关联固态纳米孔电解质溶液体积变化与导电度变化[59]。圆柱纳米孔分子易位时电流瞬时下降。若纳米孔电阻为全电路电阻，导电度变化ΔG(t)按公式(5)描述。简化聚集ABTS•⁺为球状对象，修正因子=1。公式简化为ΔG/G_pore≈Λ/V_p（公式6）。从公式(5)分析不同电压(-400至-800 mV)易位事件平均Λ值。纳米孔体积V_p~90746 nm³。按公式(4)计算ΔG⁻~0.6 nS。实验不同电压导电度变化均值~0.784 nS。计算值接近实验值。前人工作中，Tan等[3]区分HRP穿过纳米孔时不同事件信号（KCl溶液含ABTS和H₂O₂），将HRP易位不同类型信号视为ABTS•⁺通过纳米孔，分析酶催化底物产物易位六种典型事件并推测过程，但缺乏充分证据。Mubarak Ali等在单圆锥纳米通道检测氧化还原产物[58]，发现阳离子自由基ABTS•⁺在HRP-纳米通道中以电压依赖方式降低离子电流，符合圆锥纳米通道电压依赖离子浓度，电流阻断幅度与溶液H₂O₂浓度相关。

结论

成功利用FIB制备Si₃N₄纳米孔，构建共价连接HRP酶的单纳米孔系统。通过研究H₂O₂和ABTS底物存在下氧化还原产物(ABTS•⁺)证实固定化HRP在单固态纳米孔中作为H₂O₂传感器的效应。纳米孔内产生的聚集阳离子自由基ABTS•⁺降低HRP修饰固态纳米孔离子电流，符合电压依赖性。电流阻断趋势随偏压呈线性依赖。驻留时间与偏压关系为指数衰减(t_d~e^(-v/v0))。聚集ABTS•⁺通过HRP修饰纳米孔需-300 mV阈值电压。导电度变化(ΔG)经解析计算与实测值对比。易位事件由确定尺寸聚集阳离子自由基ABTS•⁺产生。期待固态纳米孔降低检测限、提高系统灵敏度。本固态纳米孔系统结构简单、不易污染、可多次使用。

缩略语

3-APTES:

(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷

ABTS:

3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸

EDC:

N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺

FIB:

聚焦离子束

HRP:

辣根过氧化物酶

KCl:

氯化钾

NHS:

N-羟基琥珀酰亚胺

SEM:

扫描电镜

SNR:

信噪比