Fe(III)-血红素接枝SBA-15：染料降解、药物递送与H₂O₂检测的先进催化剂

摘要

卟啉铁分子(血红素)成功接枝在通道介孔二氧化硅SBA-15上(FeIX-SBA-15)，其中接枝血红素分子作为酶模拟催化氧化反应。在H₂O₂存在下，制备FeIX-SBA-15复合物有效降解工业染料橙II并催化四甲基联苯胺盐酸盐(TMB)在溶液和膜上，实现比色法H₂O₂检测。此外，血红素接枝复合物显示抗癌药物盐酸阿霉素(DOX)高负载量，展现持续释放行为，经实时细胞分析监测，与DOX/SBA-15相比改善癌细胞生长抑制效果。血红素修饰介孔二氧化硅纳米复合物提供具有前景生物医学应用的综合纳米平台。

引言

为克服天然酶易在恶劣环境条件变性等缺点，投入大量精力开发高稳定性酶模拟物，包括氧化石墨烯、血红素和金属纳米颗粒[1, 2]。在这些人工酶中，血红素作为血红蛋白家族活性中心，是著名天然金属卟啉[3]。作为催化剂，金属卟啉络合物能有效催化环境污染物如多环芳烃(PAHs)和偶氮染料氧化，将底物分子转化为含氧官能团有机化合物或降解为无害化合物[4,5,6]。然而，血红素催化活性可能受氧化自降解、分子聚集生成非活性二聚体和水性缓冲液低溶解度影响[7]。在高比表面积固体载体上固定化血红素提供经济高效策略，在实际使用中实现高催化性能同时最小化活性损失。

因对外表面和内表面结构适应性可行[8]，各类掺杂金属卟啉介孔硅纳米材料(MSNs)获广泛关注用于多样应用。例如，Huang等人报道血红素基介孔二氧化硅纳米反应器具有显著过氧化物酶样活性[9]。Barbosa等人开发固定化金属卟啉Fe₃O₄@SiO₂介孔亚微米球作为可重复使用生物模拟催化剂用于烃氧化[10]。近期，Sun等人报道基于双适配体生物识别和血红素包裹介孔二氧化硅新型化学发光传感器用于凝血酶检测[11]。各类MSNs中，SBA-15(圣芭芭拉非晶型-15)呈六方孔结构和可调3-10 nm孔径，适合化学接枝功能分子[8, 12]。作为硅材料，SBA-15生物毒性较低，表面大量不稳定Si-OH基团可用于接枝其他功能分子赋予SBA-15更多功能[13]。报道SBA-15可用作酶固定化、抗体负载和药物递送载体[14,15,16]。

DOX作为有效化疗抗生素是广谱癌症一线治疗，但临床副作用仍是严重问题[17]。为提高治疗疗效同时降低DOX全身毒性，在分子设计和各种药物递送系统制剂开发上投入大量精力。介孔MCM-41(移动物质组成No.41)1998年首次用作药物载体[18]后，包括SBA-15在内MSNs因固有孔结构利于药物负载和释放具优势特征[19, 20]。然而，MSNs复杂化学修饰可能限制实际应用。

本研究成功在SBA-15上接枝血红素构建复合材料(FeIX-SBA-15)(方案1)，不仅保留血红素酶样活性，还实现盐酸阿霉素(DOX)高效封装和持续释放，经实时细胞分析仪(RTCA)技术[21,22,23]反映癌细胞生长曲线。值得注意的是，DOX/FeIX-SBA-15获得相对较高DOX负载量，比我们早期工作使用茂基羧酸修饰SBA-15(FCA-SBA-15)[24]高，可能归因于接枝FeIX与DOX在载体中优化π-π堆积。此外，得益于固定商业滤膜上FeIX-SBA-15固体形式，开发流式催化格式实现有效染料降解和过氧化氢比色检测。

材料与方法

材料

所有试剂均为分析纯(AR)未经进一步纯化直接使用。三嵌段共聚物Pluronic P123(EO₂₀PO₂₀EO₂₀，MW=5800)从Sigma-Aldrich(德国)购买。3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)、正硅酸乙酯(TEOS)、酸性橙II和四甲基联苯胺盐酸盐从上海阿拉丁生物科技有限公司(中国)购买。血红素和盐酸阿霉素从上海麦克林生化科技有限公司(中国)购买。胰蛋白酶-EDTA溶液从贝叶生物科技有限公司(中国)购买。细胞培养基(RPMI-1640)从GE Healthcare生命科学有限公司(中国)购买。胎牛血清(FBS)从Gibco公司(美国)购买。青霉素和链霉素从赛默飞世尔科技有限公司购买。A549细胞系从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得。

SBA-15化学接枝用于药物负载

SBA-15按前文[12]制备。随后，0.40 g SBA-15分散在140 mL甲基苯80°C中加入APTES(1.2 mL)。混合物搅拌8小时，5000 rpm离心5分钟分离。乙醇和水洗涤后，所得APTES-SBA-15在80°C干燥。血红素(0.15 g)先分散在30 mL DMSO中，随后加入APTES-SBA-15(0.60 g)，70°C搅拌7小时。所得产物离心、洗涤、干燥，即FeIX-SBA-15。

验证FeIX成功接枝SBA-15后，FeIX-SBA-15(0.50 g)悬浮于20 mL去离子水含DOX·HCl(2 mg/mL)中37°C搅拌24小时负载DOX。产物5000 rpm离心5分钟。洗涤、干燥、研磨后收集最终产物(DOX/FeIX-SBA-15)。

表征

样品形貌特征用扫描电子显微镜(SEM，日立SU-1510)配能谱X射线探测器(EDS)，15 kV加速电压操作研究。制备材料小角X射线衍射(SAXRD)图谱用Smartlab TM 9 KW X射线衍射仪Cu Kα辐射(λ=0.154 nm)在2θ 0.2°-8°范围收集。X射线荧光(XRF)分析在X射线荧光光谱仪(赛默飞，美国)测量。氮吸附等温线在容量吸附分析仪(BELSORP-MINI，日本)相对压强范围P/P₀ 0.01-0.99测量。比表面积和孔径分布分别用Brunauer-Emmett-Teller(BET)和Barrett-Joyner-Halenda(BJH)法计算。材料固体UV-vis光谱用固体UV-vis分光光度计(赛默飞，美国)记录。样品吸收光谱用紫外可见分光光度计(UV-vis 7300，中国)测量计算DOX药物负载量(DLC)按公式：DLC(wt.%) = (负载药物重量/介孔材料和负载药物总重量)×100%。DOX/FeIX-SBA-15铁含量用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP，PE Optima 2000DV，美国)测定。分析前，DOX/FeIX-SBA-15先完全溶于氢氟酸，再挥发氢氟酸并用浓硝酸重新溶解。

FeIX-SBA-15催化活性和降解行为

利用FeIX酶样活性，以TMB为模型反应[29]在H₂O₂存在下评价催化活性，研究酸性橙II降解行为。制备含20 mM NaOH和1.5 mM Triton X-100混合液，稀释4倍用PB溶液溶解FeIX-SBA-15。TMB催化反应中，500 μL FeIX-SBA-15(600 μg/mL)混合500 μL H₂O₂(2 mM)作为底物降解TMB(500 μL，3 mg/mL)。特定时间间隔进行光谱测量评估反应程度。为研究合成复合物降解行为，500 μL FeIX-SBA-15(600 μg/mL)溶液与500 μL 10 mM H₂O₂溶液混合作底物。随后加入500 μL橙II(0.25 mM)上述溶液。485 nm记录吸光度测量。

此外，复合物进一步固定商业滤膜上以流式催化方式降解酸性橙II。5 mL FeIX-SBA-15悬浮液(600 μg/mL)通过商业滤膜(0.22 μm，Millipore)使材料截留滤膜上并室温干燥。500 μL橙II(0.25 mM)溶液混合500 μL H₂O₂(10 mM)和500 μL水通过负载FeIX-SBA-15商业滤膜。混合物光谱测量记录。

H₂O₂比色检测

基于FeIX-SBA-15 TMB催化反应模型，建立溶液中H₂O₂比色测定策略，校准曲线见图2c。制备500 μL FeIX-SBA-15(600 μg/mL)和500 μL TMB(3 mg/mL)混合液。随后加入不同浓度(25-500 μM)H₂O₂ 500 μL上述溶液，30°C孵育10分钟。最后651 nm记录光谱测量。

同时，以流式催化方式在固定复合物商业滤膜上进行H₂O₂测定。改性膜制备如上述。然后不同浓度(0.293~8.8 mM)H₂O₂ 500 μL、500 μL TMB(2 mg/mL)和500 μL水分别通过改性商业滤膜，记录混合物651 nm光谱测量。

吸光度对H₂O₂浓度作图，用公式评价方法检测限(LOD)：LOD = 3RSD/斜率。(RSD：相对标准偏差)。

细胞培养与RTCA检测

人非小细胞肺癌细胞A549用RPMI-1640培养基含10% FBS、1%青霉素-链霉素溶液，5% CO₂、37°C培养箱培养(赛默飞)。实时细胞分析仪(RTCA)技术(xCELLigence系统，ACEA Biosciences Inc.)和细胞计数试剂盒-8(CCK-8，DOJINDO实验室)法用于材料细胞毒性评价。RTCA检测中，每孔播种5000-8000细胞于E-板。分析仪实时监测细胞孵育增殖，信号变化以细胞指数(CI)任意单位表示。细胞暴露于FeIX-SBA-15和DOX/FeIX-SBA-15浓度12.6 µg/mL。DOX浓度0.50 µg/mL。此外，为获得DOX/FeIX-SBA-15 IC₅₀，检测不同剂量DOX/FeIX-SBA-15(1.6-50.4 µg/mL)处理细胞。另外，CCK-8试剂盒终点法检测材料细胞毒性。CCK-8试剂与细胞孵育2小时，酶标仪450 nm波长测量吸光度。

结果与讨论

材料表征

DOX/FeIX-SBA-15复合物按方案1合成。首先通过氨基化反应[13]制备APTES-SBA-15。然后FeIX分子通过酰胺反应和介孔中羧基与氨基间静电相互作用接枝在APTES-SBA-15表面。最后抗癌药物DOX负载进FeIX-SBA-15复合物，涉及FeIX共轭平面大环分子[25]与DOX蒽环色原[24]间强分子相互作用π-π堆积。

复合物表面微观结构用扫描电镜(SEM)评价。图1a显示，SBA-15形成0.4-1 μm一定均匀性管状结构，接枝FeIX和DOX分子未引起明显形貌变化。DOX/FeIX-SBA-15与SBA-15对比透射电镜(TEM)图像(图S1)验证化学修饰后保留介孔结构。DOX/FeIX-SBA-15化学组成进一步用X射线荧光光谱估算。表S1显示DOX/FeIX-SBA-15含Si、O、C、Fe及微量其他吸附元素。与FeIX-SBA-15相比，DOX/FeIX-SBA-15中Si(~24.3%)和Fe(~2.5%)计算原子百分比略低，但C含量(11.3%)相对较高提示DOX成功封装。为进一步评价表面组分，记录复合物固体UV-vis光谱。图S2显示，类似FeIX分子，FeIX-SBA-15显示250-350 nm、450-550 nm和600-700 nm吸收带，而SBA-15几乎无可观察带[26]。对比下，DOX/FeIX-SBA-15展现源于DOX宽吸收带450-550 nm。

复合物小角X射线衍射分析也进行。图1b显示，SBA-15 SAXRD图谱主衍射峰0.94°，两可观察峰1.6°和1.8°分别反映(100)、(110)和(200)晶面，指向明确介孔结构[27]。与SBA-15相比，DOX/SBA-15 SAXRD图谱峰强度降低，表明负载DOX未破坏孔结构。然而，SBA-15接枝FeIX导致(110)和(200)晶面峰向大角度可观察偏移且峰强度降低，提示材料介孔结构规则性部分丧失[28]。值得注意的是，FeIX-SBA-15进一步负载DOX导致(110)和(200)晶面消失。

为获得样品介孔结构参数，记录氮吸附等温线。图1C显示，所有样品展现典型IV型等温线，高相对压力急剧毛细管凝聚阶梯，表明化学修饰后保留介孔结构[24]。图1D和表S2显示，与SBA-15~6 nm相比，FeIX/DOX接枝后孔径减小，佐证SAXRD结果。DOX/SBA-15和DOX/FeIX-SBA-15中DOX负载量分别计算为1.14%和4.27%。结果表明FeIX接枝SBA-15增强介孔中DOX负载能力，为DOX/SBA-15~3.7倍，为早期工作DOX/FCA-SBA-15[24]~1.6倍。这种药物分子负载能力提升可归因于FeIX与DOX间优化分子相互作用。

接枝血红素在介孔上催化活性和降解行为

FeIX-SBA-15催化活性用TMB在H₂O₂存在下作为模型反应[29]评价。图2a显示，测定溶液(TMB+H₂O₂+FeIX-SBA-15)吸光度强度随催化反应时间增加。相应溶液变蓝并随时间变深(图2b)。然而，溶液缺H₂O₂或FeIX-SBA-15时反应不发生，表明FeIX-SBA-15过氧化物酶活性。同时，图S3A显示，FeIX-SBA-15在H₂O₂存在下能降解橙II，3小时反应时间内用UV-vis吸光度监测。

利用血红素接枝介孔复合物固体形式，基于FeIX-SBA-15固定商业滤膜流式催化格式测试有机转化[30, 31]。图S3B显示，H₂O₂和橙II混合液通过改性膜时，与仅含SBA-15对照膜(图S3C)相比，溶液吸光度强度随之降低，表明固定FeIX-SBA-15膜复用后具极大催化活性，可用于废水染料降解[32, 33]。

此外，与辣根过氧化物酶相比，含血红素复合物在宽pH范围表现出显著催化活性，归因于血红素相对苛刻条件(包括酸性溶液)下充分稳定性[29, 34]，这具有实际重要性。

H₂O₂比色检测

基于FeIX-SBA-15 TMB催化反应模型，建立溶液中H₂O₂比色测定策略，校准曲线见图2c。H₂O₂浓度范围25-500 μM，检测限(LOD)2.1 μM。

随后，通过直接过滤不同浓度H₂O₂经FeIX-SBA-15改性商业膜开发简单比色检测H₂O₂。图2d显示，线性检测范围估计0.293-8.80 mM，检测限0.067 mM。与早期报道分析参数对比列于表1，指示与催化剂浓度、pH和分析温度等反应条件相关检测性能[35]。虽然提议方法未超越早期报道，但其宽校准浓度范围分析性能与比色法可比。

细胞毒性实验与DOX负载复合物对细胞动态监测效果

图3显示，样品对A549细胞生长抑制效应首经CCK-8试剂盒评价，测得24小时半抑制浓度(IC₅₀)汇总表S3。150 μg/mL SBA-15处理细胞仍保持>80%细胞活力反映材料低细胞毒性。DOX/FeIX-SBA-15 IC₅₀(12.6 μg/mL)比DOX/SBA-15(58.8 μg/mL)低~四倍，比FeIX-SBA-15(35.4 μg/mL)低~三倍，提示SBA-15接枝FeIX高效负载DOX改善细胞毒效应。

不同复合物处理A549细胞生长状态显示图4a、b经RTCA监测持续药物释放，基于无标记阻抗检测原理反映细胞生理状态[41]。图4a显示，测试剂量下DOX处理细胞指数值先增加后迅速下降，归一化细胞指数(NCI)值急剧下降涉及DNA损伤过程[42]。FeIX-SBA-15(12.6 μg/mL)和DOX/FeIX-SBA-15(12.6 μg/mL)NCI值均低于对照，但随孵育时间增加观察到NCI值上升。与FeIX-SBA-15相比，DOX/FeIX-SBA-15处理细胞NCI值前几小时治疗中增加。然而，因药物递送持续释放行为和DOX/FeIX-SBA-15介孔释放DOX有效浓度累积不足杀死大部分细胞，DOX/FeIX-SBA-15处理A549细胞生长表现相对稳定抑制状态，而FeIX-SBA-15处理细胞指数值后续过程显著增加。在CCK-8测得IC₅₀浓度12.6 μg/mL下，DOX/FeIX-SBA-15 NCI值24小时高于对照组50%。因此记录DOX/FeIX-SBA-15多剂量效应(图4B)，用RTCA软件从记录NCI计算剂量-反应曲线(图4c、d)。DOX/FeIX-SBA-15处理细胞IC₅₀值确定为15.0(24 h)，与CCK-8测试一致。48小时孵育后计算IC₅₀为6.7(48 h) µg/mL。

结论

本研究成功在SBA-15接枝血红素分子实现多用途。构建FeIX-SBA-15利于负载抗癌药物，在H₂O₂存在下有效催化TMB和降解酸性橙II在溶液和膜上。基于TMB催化模型反应，建立H₂O₂定量分析比色策略。此外，FeIX接枝SBA-15有利于较高DOX负载量并改善癌细胞生长抑制效果优于DOX/SBA-15。同时，DOX/FeIX-SBA-15对A549细胞毒性经RTCA动态监测，明显提示药物分子DOX从介孔持续释放行为。基于此，该药物递送系统降低DOX细胞毒性但仍有效抑制肿瘤细胞生长。综上，我们制备血红素接枝介孔二氧化硅纳米复合物作为固体催化剂和药物递送系统，可提供具有巨大生物医学潜力多功能纳米平台。

缩略语

SBA-15:

圣芭芭拉非晶型-15

FeIX:

三价铁血红素

DOX:

盐酸阿霉素

TMB:

四甲基联苯胺盐酸盐

APTES:

3-氨基丙基三乙氧基硅烷

TEOS:

正硅酸乙酯

RTCA:

实时细胞分析仪

ICP:

电感耦合等离子体

BET:

布鲁纳-埃梅特-特勒尔

BJH:

巴雷特-乔纳-哈伦达

FWHM:

半高全宽