用于氧化还原刺激触发释放的新型双线粒体和 CD44 受体靶向纳米颗粒

背景

近年来，为了实现对癌症的有效治疗，许多药物递送系统[1]被研究来制备具有结构修饰的多功能高分子聚合物药物载体，该载体具有通过降低药物降解率来提高药物生物利用度等诸多优点。 , 提高细胞摄取, 靶向和控制药物释放, 减少副作用[2, 3]。

姜黄素（Cur）是一种双酚类化合物，从中药Curcuma longa中分离得到 .与一般抗肿瘤药物相比，Cur对前列腺癌、乳腺癌、结肠癌等多种肿瘤具有广泛的抗肿瘤作用，且细胞毒性相对较低[4]。但其溶解度不足、不稳定性、生物利用度差等极大限制了其临床应用[5, 6]。为了提高疏水性药物的溶解度和生物利用度，通过掺入疏水性药物和亲水性材料寡聚透明质酸（oHA）制备了许多精心设计的纳米材料[7]。我们通过自组装将姜黄素负载到聚合物胶束中，设计了一种作为纳米载体的两亲性聚合物-药物偶联物，具有良好的稳定性，可以延长药物在血液循环中的半衰期。小粒径的胶束可以有效地通过肿瘤血管生成的EPR效应被动积累到实体瘤中，从而达到更好的治疗效果[8, 9]。

oHA 是一种由 HA 降解得到的小分子，具有独特的性质，如良好的亲水性、生物相容性、血浆稳定性和靶向细胞表面的 CD44 受体 [7, 10, 11]，而 CD44 受体则过表达在肺癌细胞和乳腺癌细胞中，与正常细胞中的表达相比较低[12]。与正常人类细胞相比，肿瘤细胞具有独特的细胞信号，包括谷胱甘肽（GSH，2-10 mM）、低 pH 值和一些酶 [13,14,15,16,17,18,19,20 ]，而二硫键具有还原敏感性，在细胞质中还原的GSH作用下可断裂[21, 22]。

线粒体是细胞存活的重要细胞器，在能量产生和凋亡途径中发挥重要作用 [23,24,25,26,27]。因此，在以往的报道中，线粒体一直被认为是应用于癌症治疗的亚细胞靶点[28]。由于细胞器中线粒体的膜电位较高，三苯基膦、三苯基甲基鏻和其他种类的亲脂性阳离子很容易通过其脂质双层亲水屏障富集在线粒体中[29, 30]。

在这项工作中，为了提高 Cur 的溶解度并增强对癌细胞的特异性，设计和合成了由 oHA、TPP、二硫键和 Cur 组成的聚合物-药物偶联物，专门针对 CD44 受体和线粒体.此外，它还具有还原敏感性，可用作荧光标记物。这种多功能新型纳米载体以（5-羧基戊基）三苯基溴化鏻、低聚透明质酸、二硫键和姜黄素（TPP-oHA-S-S-Cur）命名。 Cur 通过在水中的自组装被加载到 TPP-oHA-S-S-Cur 胶束中 [1, 31]。聚合的TPP-oHA-S-S-Cur胶束包裹Cur（以下简称Cur/TPP-oHA-S-S-Cur胶束）可以提高姜黄素的疗效和载药量，并减少副作用。靶向肿瘤组织后，Cur/TPP-oHA-SS-Cur 胶束通过 CD44 介导的内吞作用穿透细胞，然后靶向线粒体，二硫键响应高 GSH（2-10 mM）而断裂，导致药物的快速释放（图 1）。在这里，我们可以提出一个假设，即这种新型的线粒体和 CD44 受体双靶向氧化还原敏感多功能纳米粒子将成为肿瘤靶向给药系统的新平台。在制备胶束后，本研究对Cur/TPP-oHA-S-S-Cur胶束的特性进行了初步研究。

线粒体和CD44受体双靶向氧化还原敏感纳米颗粒示意图

方法

材料

姜黄素（Cur，上海展运化工有限公司）；寡聚透明质酸（oHA，Mn =10 kDa，山东福瑞达生物工程有限公司）； 3,3'-二硫代二丙酸由 Adamas Reagent Co. Ltd.（中国上海）提供。 (5-羧基戊基)三苯基溴化鏻 (TPP)、无水四氢呋喃 (THF)、二甲亚砜 (DMSO)、三乙胺 (TEA)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐 (EDC) 和 4-二甲氨基吡啶(DMAP)购自阿拉丁化学有限公司，其他试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司提供。

TPP-oHA-S-S-Cur 的合成和表征

多功能纳米载体的合成分三步进行，如图2所示。

TPP-oHA、S-S-Cur、TPP-oHA-S-S-Cur的合成路线

第 1 步

使用先前报道的方法 [32]，TPP 通过酯键与 oHA 结合。首先，将 TPP、EDC 和 DMAP 溶解在 DMSO 中，在 60°C 下反应 1 小时。然后，oHA 溶解在 DMSO:H2O (v /v =1:1) 并将上述反应加入其中，室温反应 8 小时。将反应混合物用透析袋（MWCO 2000 Da）在去离子水中透析 48 小时以去除杂质并冻干以获得 TPP-oHA 聚合物。

第 2 步

简而言之，将 3,3'-二硫代二丙酸溶解在 THF 中并由草酰氯活化。然后，该混合物与由 TEA 催化的 Cur 反应。所得产物经硅胶柱层析分离得到纯品S-S-Cur。

第 3 步

将 S-S-Cur、EDC 和 DMAP 溶解在 DMSO 中并在 60°C 下活化 2 小时，然后在上述溶液中加入 TPP-oHA 并在室温下反应 24 小时。将混合物在蒸馏水中用透析管（MWCO 2000 Da）透析 48 小时，然后冻干得到最终产物 TPP-oHA-S-S-Cur。

TPP-oHA、S-S-Cur和TPP-oHA-S-S-Cur的结构用 ¹ 确认 HNMR（Advance Bruker 400M；瑞士布鲁克公司，麦迪逊，威斯康星州，美国）使用氘代 DMSO-d6、CD3Cl 和 DMSO-D6：D2O（DMSO-d6：D2O =1:1，v /v ) 分别作为溶剂。

胶束的制备和表征

TPP-oHA-S-S-Cur 胶束和 oHA-Cur 胶束均通过透析方法制备 [33]。首先，将 TPP-oHA-S-S-Cur（10 毫克）和姜黄素（1.5 毫克）溶解在甲酰胺（6 毫升）中。然后，将混合物在带有透析袋 (MWCO 2000 Da) 的去离子水中在黑暗中透析 24 小时以去除有机溶剂。之后，将透析溶液以 2500 rpm 离心 10 分钟以去除卸载的 Cur。最后，胶束悬浮液通过 0.45-μm 注射器过滤膜过滤。同法得到单功能oHA-Cur胶束。

通过 Delsa Nano C (Beckman Coulter Inc.) 观察负载 Cur 的胶束的粒径、zeta 电位和多分散指数 (P.I.)。通过透射电子显微镜（TEM，H-600；Hitachi，Tokyo，Japan）监测 Cur 负载胶束的形态。用Delsa Nano C在含20% FBS的PBS中进行Cur负载胶束的稳定性研究。

通过膜过滤法测量包封率（EE）和载药量（DL）。通过 0.45 μm 膜过滤后，通过高效液相色谱法（HPLC，Agilent Technologies）在 425 nm 处测量得到的溶液以获得 EE 和 DL。胶束的EE和DL计算公式如下：

GSH 存在下的体外药物释放

使用透析方法评估 Cur/TPP-oHA-S-S-Cur 胶束的细胞内 GSH 氧化还原反应性。将 4 毫升 Cur/TPP-oHA-SS-Cur 胶束悬浮液（50 μg 姜黄素/mL）置于透析袋（MWCO 7000 Da）中并用 45 mL PBS（pH 7.4，含有 45% 胎牛血清）透析和 0.5% 吐温 80）具有不同的 GSH 水平（0、10、2 和 10 mM）。离心管中的样品在 100 rpm 的摇床培养箱（BS-2F，常州，中国）中保持在 37°C。在预定的时间间隔（0.25、0.5、1、2、4、8、12、24、48、72、96 和 120 小时），从离心管中取出 2 mL 释放介质并补充等体积的通过 HPLC 分析相应的新鲜培养基和 Cur 的浓度。每个实验重复三次。

细胞培养

MDA-MB-231 人乳腺癌细胞在含有 10% 胎牛血清 (FBS) 的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM，Hyclone）中培养。 CD44受体在MDA-MB-231细胞中高表达，因此选择MDA-MB-231细胞系，在37℃加5%CO2气氛的加湿培养箱中培养。

体外细胞毒性测定

TPP-oHA-S-S-Cur 的体外细胞毒性试验通过 MTT 方法进行评估 [32]。 MDA-MB-231细胞（高表达CD44受体）以1 × 10 ⁴ 的密度培养 96 孔板中的细胞/孔。 100 微升游离 Cur、Cur/oHA-Cur 胶束和 Cur/TPP-oHA-SS-Cur 胶束，包括不同浓度的 Cur（0.5、1.25、2.5、5、10、20 和 40 μg/mL）添加到不同的孔中，同时添加 PBS 作为对照。孵育 24 小时后，将 100 μL MTT 溶液 (5 mg/mL) 添加到每个孔中，然后孵育 4 小时。然后，用 100 μL DMSO 代替 MTT 并将它们放入摇床培养箱中以溶解甲臜晶体。孵育 20 分钟后，使用酶标仪（Thermo Fisher Scientific Co., Waltham, MA）在 570 nm 处测量吸光度。

体外细胞摄取和线粒体定位

使用荧光显微镜（Eclipse E400；Nikon Corporation，Tokyo，Japan）观察 Cur/TPP-oHA-S-S-Cur 胶束和 Cur/oHA-Cur 胶束的细胞摄取的定性分析。 MDA-MB-231 细胞以每孔 5000 个细胞的密度接种到 24 孔板中，并与含有 10% FBS 的 DMEM (1 mL) 一起孵育，然后在 37°C 和 5% CO2 中培养 24 小时。之后，将带有载药胶束（Cur/TPP-oHA-S-S-Cur 胶束和 Cur/oHA-Cur 胶束）的新鲜培养基 (1 mL) 添加到每个孔中。细胞培养，游离Cur作为对照； Cur 的最终浓度为 20 μg/mL。此外，细胞与药物孵育不同的时间间隔。然后用PBS洗涤细胞3次，用4%多聚甲醛固定15分钟。

此外，为了评估Cur/TPP-oHA-S-S-Cur胶束的CD44靶向能力，将HA（2 mg/mL）添加到培养基中作为对照组与CD44受体结合。

此外，为了标记细胞线粒体以在细胞内定位 Cur/TPP-oHA-S-S-Cur 胶束和 Cur/oHA-Cur 胶束，将细胞与线粒体跟踪器（Mito-tracker Red CMXROS）进一步孵育 15 分钟。最后洗涤细胞3次，荧光显微镜观察。

流式细胞术

使用流式细胞术测量定量分析。 MDA-MB-231细胞以10 ⁵ 的密度接种于六孔板中 细胞/孔在 2 mL 培养基中，含有 10% FBS，并按上述说明处理。在与 Cur/TPP-oHA-S-S-Cur 胶束和 Cur/oHA-Cur 胶束 (20 μg Cur/mL) 孵育不同的时间间隔后，将细胞用 PBS 洗涤 3 次并用 0.25% 胰蛋白酶消化。然后，将细胞以 1500 rpm 离心 5 分钟。在 PBS (0.5 mL) 中重悬后，通过流式细胞术 (EPICS XL, Beckman, USA) 分析细胞。

统计分析

数据表示为平均值 ± SD (n =3)。此外，使用SPSS软件（ver. 20，USA）；分析数据在概率水平上的显着差异 *p <0.05（显着），使用单向变异分析（ANOVA）。

结果与讨论

载体材料 TPP-oHA-S-S-Cur 的表征

TPP-oHA、S-S-Cur和TPP-oHA-S-S-Cur的合成路线见图2。

此外， ¹ oHA、TPP-oHA、S-S-Cur 和 TPP-oHA-S-S-Cur 的 HNMR 谱见图 3。TPP-oHA 由 TPP 和 oHA 合成。在 ¹ 中，TPP 中三个苯环的特征峰出现在 7.570–7.717 ppm TPP-oHA的HNMR谱，证实TPP-oHA合成成功。此外，S-S-Cur 由 3,3'-二硫代二丙酸和 Cur 合成。此外，TPP-oHA-S-S-Cur 由 TPP-oHA 和 S-S-Cur 合成。 TPP-oHA-S-S-Cur 中的 TPP 出现在 7.570 和 7.717 ppm 之间的区域。在 ¹ 中观察到Cur的特征峰 SS-Cur 和 TPP-oHA-SS-Cur 的 HNMR 谱在 6.795–7.467 ppm 处，根据 TPP- 在 2.502 ppm 处观察到 3,3-二硫代二丙酸的质子峰 (-CH2-SS-CH2-) oHA-SS-Cur。这些结果证实了TPP-oHA-S-S-Cur的成功合成。

¹ oHA、TPP-oHA、S-S-Cur和TPP-oHA-S-S-Cur的HNMR谱

TPP-oHA-S-S-Cur 胶束的制备和评价

载药胶束的粒径、多分散指数、zeta电位、DL和EE见表1。Cur/oHA-Cur胶束和Cur/TPP-oHA-SS-Cur胶束的平均粒径为145.5 ±分别为 2.1 和 122.4 ± 4.6 nm。这可能是因为 TPP 改变了 Cur/TPP-oHA-S-S-Cur 胶束表面的理化性质，导致了两种胶束的差异。并且Cur/TPP-oHA-S-S-Cur胶束的DL和EE高于TPP-oHA制备的普通胶束。此外，Cur/TPP-oHA-SS-Cur胶束比Cur/oHA-Cur胶束（- 19.17 ± 0.55 mV）具有更强的负zeta电位（- 21.56 ± 1.46 mV），这表明TPP-oHA的稳定性增强-SS-Cur 主要是由 TPP 的存在引起的胶束聚集所致。

此外，TPP-oHA-SS-Cur 胶束的外观、粒径分布、zeta 电位和 TEM 图像表征如图 4 所示。结果显示 Cur/TPP-oHA-SS-Cur 胶束近似球形（图 4d)，均匀分布（图 4b），平均直径约为 122.4 ± 4.6 nm。此外，Cur/TPP-oHA-S-S-Cur胶束的多分散指数为0.132，小于0.2，表明胶束尺寸均匀，与TEM一致（图4c）。

外观 (a ), 粒度分布 (b ), zeta 电位 (c ) 和 TEM 图像 (d ) TPP-oHA-S-S-Cur胶束的表征

如表 1 所示，Cur/TPP-oHA-S-S-Cur 胶束在 PBS 中的粒径小于含有 FBS 的 PBS。从 2 小时到 24 小时，在含有 FBS 的 PBS 中，大小从 133.45 ± 6.8 变为 160.27 ± 7.1 nm。这一现象表明Cur/TPP-oHA-S-S-Cur胶束在体内能保持较好的稳定性。

体外胶束药物释放研究

通过不同 GSH 浓度的胶束研究了 TPP-oHA-S-S-Cur 的氧化还原敏感性。在存在或不存在 GSH 的情况下，从 Cur/TPP-oHA-S-S-Cur 胶束中释放 Cur 以模拟肿瘤环境。如图 5 所示，在不含 GSH 的培养基中，TPP-oHA-SS-Cur 在 120 小时内仅释放 32.5% Cur，而在培养基中添加 10 μM GSH 仅导致略微增加（37%） .相比之下，2 mM GSH 和 10 mM GSH 组的药物释放分别为 57.5% 和 75.3%。这证实了药物释放随着 GSH 浓度的增加而增加。该结果归因于TPP-oHA-S-S-Cur的二硫键断裂，表明Cur/TPP-oHA-S-S-Cur胶束具有还原敏感性。

在不同 GSH 浓度 (n =3)

细胞毒性研究

通过 MTT 测定研究了不同姜黄素制剂在 MDA-MB-231 细胞中的细胞毒性。如图 6 所示，不同浓度的姜黄素制剂在 24 小时时具有不同的细胞活力。负载Cur的胶束比游离Cur的毒性小，这可以解释为聚合物材料大大降低了细胞的细胞毒性。同时，图 6b 显示了浓度依赖的细胞活力曲线，而 Cur/TPP-oHA-SS-Cur 胶束的细胞活力低于 Cur/oHA-Cur 胶束和其他配方，这可以解释为 Cur/TPP- oHA-SS-Cur胶束在GSH作用下很容易进入细胞并释放药物。 MDA-MB-231细胞中游离Cur、Cur/oHA-Cur胶束和Cur-TPP-oHA-SS-Cur胶束的IC50值分别为6.534、5.092和3.871 μg/mL，表现出更好的细胞毒性Cur-TPP-oHA-SS-Cur胶束在MDA-MB-231细胞中的表达。

一 孵育 24 小时后姜黄素制剂的细胞毒性。数据代表平均值 ± SD (n =6)。 *p <0.05，与游离Cur相比。 b 具有不同浓度 Cur（0.5、1.25、2.5、5、10、20 和 40 μg/mL）的 Cur 负载胶束的细胞毒性。游离Cur、Cur/oHA-Cur胶束和Cur-TPP-oHA-SS-Cur胶束的IC50值分别为6.534、5.092和3.871 μg/mL

此外，空白胶束具有一定的毒性（图 6），因为 Cur 通过化学方法与聚合物相连。这将增加胶束的载药量，进而增强抗肿瘤作用。

细胞摄取的荧光显微镜图像

通过荧光显微镜研究了游离 Cur、Cur/oHA-Cur 胶束和 Cur/TPP-oHA-S-S-Cur 胶束的细胞摄取。在这项工作中，Cur 本身不仅是一种抗癌药物，而且还是一种绿色荧光探针。如图 7 所示，Cur/oHA-Cur 胶束和 Cur/TPP-oHA-SS-Cur 胶束在细胞系中均表现出良好的细胞摄取，荧光强度与时间成正比，而荧光强度在4 小时。同时，在同一时间点，Cur/oHA-Cur胶束处理组的荧光强度强于游离Cur组。这可能是因为具有靶向 CD44 受体能力的 oHA-Cur 促进了药物进入细胞。此外，可能由于 Cur/TPP-oHA-S-S-Cur 胶束的氧化还原敏感能力，其荧光信号明显高于 Cur/oHA-Cur 胶束。通过增强Cur的积累，它会被癌细胞的细胞毒性和凋亡诱导，这与细胞毒性研究的结果一致。

细胞摄取游离 Cur (a ), oHA-Cur/Cur-胶束 (b ) 和 TPP-oHA-S-S-Cur/Cur-胶束 (c ) 在不同的时间。 d 在游离HA（2 mg/mL）存在下用TPP-oHA-S-S-Cur/Cur-胶束处理的细胞，显示了HA在MDA-MB-231细胞中的完成效果

此外，有HA的Cur/TPP-oHA-SS-Cur胶束组的荧光强度低于没有HA组的荧光强度，很可能是由于游离HA分子占据了CD44受体，进一步证明了靶向能力TPP-oHA-SS-Cur 对 CD44 的影响。

此外，通过用 Mito-tracker Red CMXRos 染色，在 MDA-MB-231 细胞系中证实了 TPP-oHA-S-S-Cur 的线粒体定位（图 8）。图像显示，Cur/TPP-oHA-SS-Cur 胶束的绿色荧光与线粒体追踪器的红色荧光很好地重叠，表明药物可以在癌细胞的线粒体中积累，而 TPP-oHA-SS -Cur 具有线粒体靶向性。

线粒体定位。线粒体定位是通过用 MCF-7 细胞中的线粒体示踪剂染色确定的，游离 Cur (a ), oHA-Cur (b ) 和 TPP-oHA-S-S-Cur (c );比例尺：100 μm

流式细胞术

用流式细胞术测量平均荧光强度（MFI）。如图 9 所示，与 Cur/TPP-oHA-S-S-Cur 胶束和 Cur/oHA-Cur 胶束一起孵育的 MDA-MB-231 细胞的 MFI 与给药时间成正比。与共聚焦显微镜观察一致，Cur/TPP-oHA-S-S-Cur胶束处理细胞的MFI在同一时间点显着高于Cur/oHA-Cur胶束组（p <0.05).

MDA-MB-231 细胞与不同 Cur 制剂 (20 μg Cur/mL) 孵育的荧光强度。数据表示为平均值 ± SD (n =3)。 *p <0.05，单向方差分析

结论

本研究为提高Cur的溶解性和治疗效果，减少传统疗法的副作用，增加药物的肿瘤靶向性，我们以氧化还原反应性二硫键为连接臂，构建了线粒体和CD44受体双重靶向氧化还原反应性聚合物-药物偶联物 (TPP-oHA-SS-Cur)。 TPP 靶向线粒体，抗肿瘤药物 Cur 作为疏水部分，而靶向 oHA 的 CD44 受体作为亲水部分。 Cur作为模型药物负载于两亲性嵌段共聚物中并通过自组装形成胶束。

这种通过化学方法和物理方法包封Cur的给药系统不仅提高了其DL/EE，还增加了其稳定性和血液循环时间，可以实现更好的肿瘤靶向。体外药物释放试验表明，TPP-oHA-SS-Cur 的二硫键在肿瘤细胞中高 GSH（2-10 mM）的作用下断裂，随后药物快速释放，然后证明其还原-敏感的。细胞摄取、线粒体定位和细胞毒性的结果表明 Cur/TPP-oHA-S-S-Cur 胶束具有 CD44 受体靶向能力和线粒体靶向能力。下一步，我们将评估Cur/TPP-oHA-S-S-Cur胶束在体内的抗肿瘤活性。

此外，本研究开发的这种智能多功能纳米载体平台显示出用于疏水性药物的潜力，具有显着提高的溶解性、稳定性和治疗效果。同时，该方法为肿瘤治疗提供了新思路。

缩写

oHA：

低聚透明质酸

S-S-Cur：

二硫代二丙酸-姜黄素

TPP：

(5-羧基戊基)三苯基溴化鏻