由 Pd 功能化碳纳米复合材料增强的基质金属蛋白酶-7 电流生物传感器

背景

基质金属蛋白酶 7 (MMP-7) 是一种可降解细胞外基质组成的酶 [1]，因其在肿瘤进展和转移中的关键作用而备受关注 [2, 3]。血清样本中MMP-7的含量与某些癌症患者的淋巴结转移有关，如唾液腺癌[4]、结肠腺癌[5]和高级别肾细胞癌[6]。由于其在生理过程中的各种作用，MMP-7 的高灵敏度和准确检测引起了广泛的研究关注 [7]，导致了几种方法的发展，包括比色法 [8]、电化学发光 (ECL) [9] 和荧光法共振能量转移 (FRET) 分析 [10]。然而，这些方法的检测限 (LOD) 通常在皮克范围内，因此不够低。与这些方法相比，电化学生物传感器提供了更先进的 MMP-7 检测能力，具有更低的飞克级 LOD [11]。此外，由于其低成本和小型化，已经构建了一些分析方法以满足使用电化学测定法对MMP-7进行超灵敏电化学检测的迫切需求[12]。

在许多电化学方案中，酶促生物催化反应适用于信号放大，以提高安培生物传感器的性能 [13, 14]。然而，众所周知，酶是催化反应中应用最广泛的催化剂，在环境敏感和稳定性低方面存在明显的缺点[15,16,17,18,19]。因此，开发一种高效稳定的催化剂是构建用于 MMP-7 检测的超灵敏电化学检测方法的重中之重。 Pd 是一种贵金属材料，具有优异的催化性能，在催化反应中具有很高的化学稳定性 [20, 21]。此外，碳材料可以作为催化剂中的化学惰性载体吸附贵金属材料并保持催化性能[22, 23]。

考虑到上述情况，我们设计了一种 Pd 功能化的碳纳米复合材料作为阻抗增强剂，以显着提高 MMP-7 电流分析的灵敏度，它具有以下两个功能。 (1) 碳纳米球是一种导电性差的材料[24]； (2) Pd纳米颗粒可以催化4-氯-1-萘酚与H2O2的氧化，原位产生不溶性沉淀，在电极上形成高阻沉淀[25]。这两个因素增加了电阻率并显着降低了电流，可以显着提高生物传感器的灵敏度，使 LOD 低至 17.38 fg mL ^-1 .构建的用于催化沉淀反应的Pd功能化纳米复合材料可用于MMP-7的电流分析，具有高选择性和灵敏度。

方法

材料

HAuCl4·3H2O、H2PtCl4、4-CN、葡萄糖、H2O2（30%）、牛血清凝血酶（TBS）购自阿尔法埃莎（中国天津）。氧化石墨烯 (GO) 购自 JCNANO（中国南京）。牛血清白蛋白（BSA，标准级）购自北京新晶科生物技术有限公司（中国北京）。肽（NH2-KKKRPLALWRSCCC-SH）购自Science Peptide Biological Technology Co., Ltd.（中国上海）。神经元特异性烯醇化酶 (NSE) 和前列腺特异性抗原 (PSA) 购自 Shanghai Linc-Bio Science Co. Ltd. (Shanghai)。基质金属蛋白酶-2 (MMP-2) 购自 Yeasen Biotechnologies Co., Ltd.（中国上海）。 MMP-7 由 Sino Biological Inc.（中国北京）提供。临床人血清样品购自中科晨宇生物技术公司（中国北京）。所有水溶液均使用超纯水（电阻率> 18 MΩ cm）制备。磷酸盐缓冲液 (PBS) 含有 0.1 M KCl 和 10 mM 磷酸盐缓冲液 (pH =7.4)。

设备

微波合成通过 CEM Discover® SP 微波反应器（CEM，美国）进行。使用 HITACHI S-4800 SEM (HITACHI, Japan) 获得扫描电子显微镜 (SEM) 图像。在 HITACHI H7650 TEM (HITACHI, Japan) 上获得透射电子显微镜 (TEM) 图像。能量色散 X 射线光谱 (EDS) 在 HITACHI SU8010 SEM (HITACHI, Japan) 上测定。所有电化学测量均在 CHI600 电化学工作站（中国上海晨华仪器有限公司）上进行。以玻璃碳电极（GCE）（直径4 mm）为工作电极，铂丝和Ag/AgCl电极作为对电极和参比电极，构建了实验中的三电化学体系。高分辨率透射电子显微镜 (HR-TEM) 图像由 Tecnai G ² 拍摄 F30 TEM 在 300 kV 加速下。

钯功能化碳纳米复合材料的合成

根据先前报道的文献 [26] 合成了 Pd 功能化碳纳米复合材料 (Pd-CNCs)。简而言之，将 4 g 葡萄糖溶解在 40 mL 超纯水中以形成澄清溶液。然后将上述溶液转移到 50 mL 内衬聚四氟乙烯的不锈钢高压釜中，并在 170°C 下保持 5 小时。反应后，透明溶液变成深棕色。离心收集所得碳纳米球，用超纯水/乙醇洗涤数次。将所得产物重新置于 8 mL 超纯水中。

为了使碳纳米球上的 Pd 纳米颗粒功能化 [24]，将 1 mL 碳纳米球悬浮液与 25 μL HPdCl4 溶液混合。混合物在微波反应仪 (250 W) 中于 100°C 反应 15 分钟，然后自然冷却至室温。接下来，将得到的钯碳纳米球离心，用超纯水洗涤，再置于1 mL超纯水中。

为了避免 MMP-7 的非特异性吸附，在 Pd-碳纳米球上进一步修饰了 BSA。在室温下将纳米球悬浮液与 100 μL BSA 溶液 (1 wt%) 搅拌 1 小时。经过几次离心和洗涤步骤后，将 BSA 修饰的 Pd-碳纳米球重新置于超纯水中并储存在 4°C 以备进一步实验。

GCE 上的电镀 Au-rGO

在修饰之前，GCE 用 0.05 μm 氧化铝浆液抛光，超声处理分别在超纯水和乙醇中洗涤。通过以下步骤配置电沉积溶液[27]。首先，将 8 mg GO 粉末分散在 20 mL 超纯水中，超声处理 2 小时。然后，将 200 μL HAuCl4 溶液（4 wt%）加入到 GO 悬浮液中 随后，通过循环伏安法 (CV) 技术在 GCE 上电沉积 Au-rGO，范围在 1.5 和 - 1.5 V 之间，扫描速率为 50 mV s ⁻¹ 在上述电沉积溶液中。最后，将Au-rGO沉积的GCE（Au-rGO/GCE）用超纯水洗涤去除残留的电沉积溶液，然后在室温下用氮气吹干。

生物传感器的制作

Au-rGO/GCE 与 40 μL 肽溶液 (50 μM) 在 37°C 下孵育 40 分钟。随后，GCE 上的修饰肽用 50 μL 戊二醛溶液 (0.10 wt%) 再活化 30 分钟（肽/Au-rGO/GCE）。然后，将 20 μL Pd-CNCs 悬浮液滴在肽修饰电极上 1 小时（Pd-CNCs/肽/Au-rGO/GCE）。每个修饰步骤后，修饰电极用超纯水清洗。

电化学测量

八十微升 MMP-7 溶液（1 ng mL ⁻¹ ) 与 Pd-CNCs/肽/Au-rGO/GCE 在 37°C 下孵育 1 小时，并用超纯水充分洗涤。然后，滴加 50 μL 含有 10 mM H2O2 的 1.0 mM 4-CN 溶液以进行 50 分钟的沉淀反应。最后，方波伏安法 (SWV) 测量在 5 mM [Fe(CN)6] ^3-/4- 中从 - 0.2 到 0.6 V 进行 磷酸盐缓冲溶液（0.1 M，pH =7.4），脉冲幅度为 25 mV，增加电位为 4 mV s ⁻¹ .

结果与讨论

肽裂解生物传感器的原理

基于肽裂解的生物传感器的构建过程如图1所示。首先，Au-rGO通过电化学方法沉积在玻璃碳电极（GCE）上，然后通过Au-S键将肽固定在Au-rGO上。 Pd-CNCs 作为催化增强剂组成，戊二醛被选为肽和增强剂之间的化学接头。 4-CN 和 H2O2 被用作催化沉淀底物以增强阻抗。特别是，MMP-7 被选为肽中丙氨酸 (A) 和亮氨酸 (L) 之间的肽裂解酶 [8]，这导致 SWV 测量的电流信号变化不明显。在 GCE 上电沉积 Au-rGO 有两个优点：（1）Au-rGO 可以有效提高传感界面的电导率； (2) 它允许位点固定肽。利用 Pd-CNCs 的高阻抗和催化性能，然后通过用特定肽 (NH2-KKKRPLALWRSCCC-SH) 切割替换 Pd-CNCs 来放大 ΔI。这种现象是导致 Pd-CNCs 导电性差和 Pd-CNCs 催化 H2O2 氧化 4-CN 产生的沉淀阻抗高的原因。

Pd功能化碳纳米球作为MMP-7电流测定阻抗增强剂的示意图

通过在肽/Au-rGO/GCE 表面上孵育 Pd-CNC，通过扫描电子显微镜 (SEM) 进一步表征 GCE 上的催化沉淀反应（图 1a）。 Pd-CNCs在沉淀反应后涂有不溶层，表明在修饰电极上形成了不溶性不良导电层（图1b）。因此，通过肽裂解和催化沉淀引起的灵敏度放大，成功建立了一种用于超灵敏检测MMP-7的生物传感器。

Pd-CNCs/peptides/Au-rGO/GCE (a ) 催化沉淀反应 (b )

Pd-CNC 的表征

通过典型的水热法，成功制备了均质的 Pd-CNCs。通过透射电子显微镜 (TEM) 和能量色散 X 射线光谱 (EDS) 表征碳纳米球、Pd-碳纳米球和 Pd-CNCs 的形貌。微波反应后 Pd 纳米颗粒形成并分布在碳纳米球上（图 2b），证明成功制备了直径为 150 nm 的 Pd-碳纳米球（图 2a）。 Pd-CNC 的形态如图 2c 所示。 EDS 结果证实了碳纳米颗粒、Pd-碳纳米球和 Pd-CNCs 的化学成分，这表明碳纳米颗粒含有 C 和 O（图 2d）。 Pd纳米颗粒功能化后，Pd也存在于Pd-碳纳米球的光谱中（图2e），而在Pd-CNCs光谱中发现的S和N来自BSA，用于阻挡Pd-碳纳米球（图 2f)。这些结果直观地揭示了 Pd-CNC 催化增强剂的成功合成。 Pd-碳纳米球的 HR-TEM 图像（图 3a）表明功能化的 Pd 纳米粒子（图 3b）处于面心立方（FCC）相，具有可观察的（1,1,1）晶格平面（图 3a）。 3c)。相应的快速傅里叶变换（FFT）图像（图 3d）也支持 Pd 纳米粒子的 FCC 结晶性质。

碳纳米球的 TEM 显微照片 (a ), Pd-碳纳米球 (b ) 和 Pd-CNC (c ) 碳纳米球的 EDS (d ), Pd-碳纳米球 (e ) 和 Pd-CNC (f )

Pd-碳纳米球的 HR-TEM 图像 (a ), Pd 纳米粒子的放大图像 (b, c ) 和 Pd 纳米粒子的 FFT 图像 (d )

生物传感器构建过程的表征

通过 SWV 测量（图 4a）和电化学阻抗谱（EIS）（图 4b）监测生物传感器的构建过程。与裸 GCE 的电流信号（曲线裸 GCE）相比，电沉积 Au-rGO 后电位范围内的峰值电流增加到约 420 μA（曲线 Au-rGO/GCE），这可能归因于Au-rGO。然后，由于肽和增强剂（曲线 Pd-CNC）的高阻抗，将肽固定在电极上后（曲线肽）信号电流峰值降低，并在肽与 Pd-CNC 连接后进一步降低。与 MMP-7 孵育后，峰值电流增加（曲线 MMP-7 裂解），这可能是由 MMP-7 对肽的特异性裂解和电极表面增强剂的部分去除引起的。在相同条件下，计算出曲线“Pd-CNCs”和“MMP-7 裂解”之间的电流变化 (ΔI1) 为 48.7 μA。然后，在 4-CN 催化沉淀反应后峰值电流降低，电流峰值为 136.1 μA（曲线 MMP-7 裂解沉淀）。相比之下，不含 MMP-7 的生物传感器在催化沉淀反应后诱导了较低的电流峰值（54.9 μA，曲线沉淀），这被称为空白信号。在这种情况下，ΔI2 是曲线“沉淀”和曲线“MMP-7 裂解沉淀”之间的电流信号差，从 48.7 μA 增加到 81.2 μA。 EIS 还用于监测生物传感器的制造。电子转移电阻对应于奈奎斯特图的半圆直径（图 4b）。为了进行比较，肽/Au-rGO/GCE（曲线肽）的曲线比 Au-rGO/GCE（曲线 Au-rGO/GCE）和裸 GCE（曲线裸GC) 具有最小圆圈，表明肽已在 GCE 上成功修饰。当肽通过戊二醛（曲线 Pd-CNC）与增强剂连接时，抗性增加。与 MMP-7 孵育后半圆的直径略有减小（曲线 MMP-7 切割），这可能归因于 MMP-7 特异性切割肽。相反，当生物传感器浸入 4-CN 和 H2O2 的溶液中时，电阻显着增加（曲线沉淀）。同时进行肽裂解和催化沉淀反应，抗性明显下降（曲线MMP-7裂解沉淀）。

SWV (a ) 和 EIS (b ) 电极在 5 mM [Fe(CN)6] ^3−/4- 中改性过程的响应 磷酸盐缓冲液 (0.1 M, pH =7.4)

检测条件优化

肽的数量和孵育时间作为生物传感器检测性能的重要因素，得到了进一步优化。发现当肽浓度从 20 μM 增加到 40 μM 并在 50 μM 和 80 μM 之间保持恒定时，电流信号相应降低（图 5a）。为避免非特异性吸附，我们选择 50 μM 进行后续测量，然后优化 50 μM 肽的孵育时间（图 5b）。 SWV 电流从 20 分钟逐渐降低到 40 分钟，然后在 40 分钟后保持恒定。因此，选择 40 分钟作为肽的孵育时间。裂解反应时间也是生物传感器分析性能的重要因素（图 5c）。当裂解时间在30-50 分钟之间时，生物传感器的信号增加，然后在50 分钟后保持不变，表明肽已被完全裂解。因此，选择 50 分钟作为以下实验的切割时间。沉淀反应也会影响生物传感器的灵敏度（图 5d），发现在 50 分钟内增加，并且电化学信号持续降低。由于电流信号随着反应时间的进一步增加而保持恒定，因此选择50 min作为后续实验的沉淀反应时间。

肽浓度的影响 (a )，50 μM 肽的孵育时间 (b ), 肽裂解时间 (c ) 和沉淀反应时间 (d ) 关于生物传感器的电流响应

拟议生物传感器的性能

在最佳条件下与不同浓度的 MMP-7 孵育后，确定了所提出的生物传感器的性能。如图 6 所示，随着 MMP-7 浓度的降低，SWV 信号降低。校准图显示当前峰与分析物浓度的对数之间存在良好的线性关系，范围为 0.1 pg mL ^-1 到 100 ng mL ⁻¹ .线性方程被确定为 (I =− 16.53lgCMMP-7-137.26)，相关系数为 0.9967。生物传感器的检测限为 17.38 fg mL ^-1 对于 MMP-7，信噪比为 3 (S/N =3;是空白溶液中信号的标准偏差）。与最近关于 MMP-7 肽裂解检测的报道相比，该生物传感器表现出更好的分析性能（表 1）。

一 MMP-7 在 5 mM [Fe(CN)6] ^3−/4− 中电化学检测的 SWV 响应 磷酸盐缓冲液 (0.1 M, pH =7.4)，浓度为 100 fg mL ^-1 到 100 ng mL ⁻¹ . b 电流与MMP-7浓度对数的线性校准曲线。误差线是 n 的标准偏差 =3

免疫传感器性能评估

为了评估生物传感器的重现性，三个修饰电极与 0.01、0.1、1、10 和 100 ng mL ^-1 一起孵育 MMP-7。计算出的相应标准偏差分别为 1.3%、1.4%、4.0%、1.0% 和 3.0%，表明生物传感器具有良好的重现性。 MMP-2、NSE、PSA、TBS 和 BSA 被用作分析该生物传感器的特异性的干扰物。当生物传感器与 1 ng mL ^-1 的单独混合物一起孵育时，没有观察到明显的反应 MMP-7 与 (100 ng mL ⁻¹ 每个) MMP-2、NSE、PSA、TBS 和 BSA。与仅用 1 ng mL ^-1 孵育的生物传感器相比 MMP-7，每种混合物的电流信号几乎相同（图 7a），这表明生物传感器对 MMP-7 显示出优异的特异性。为了研究稳定性，构建的生物传感器在 4°C 下储存 28 天，每 7 天评估一次其检测 MMP-7 的性能（图 7b）。平行实验之间的相对标准偏差（RSD）均小于10%，表明该生物传感器具有显着的稳定性。

SWV 当前响应 (a ) 关于生物传感器的抗干扰能力（误差线是 n 的标准偏差 =3)。干扰浓度：MMP-2 (100 ng mL ⁻¹ ), NSE (100 ng mL ⁻¹ ), PSA (100 ng mL ⁻¹ ), THR (100 ng mL ⁻¹ ) 和 BSA (100 ng mL ⁻¹ ）， 分别。混合物包含所有这些干扰（100 ng mL ⁻¹ ) 和 MMP-7 (1 ng mL ⁻¹ ）。 SWV 响应 (b ) 在 4 °C 下储存不同时间的拟议生物传感器，用于检测 1 ng mL ⁻¹ MMP-7

为了研究所提出方法的实用性，进行了回收实验。回收率范围为 86.3% 至 117.2%（表 2），进一步表明该生物传感器在临床分析中具有良好的实用性。

结论

总之，制备了一种 Pd 功能化的碳纳米复合材料作为一种新型的阻抗增强剂，它显示了对 4-CN 氧化具有良好的 H2O2 催化性能。利用电极上不溶性氧化4-CN沉淀的高阻抗，构建了用于检测MMP-7的电流型生物传感器。该生物传感器对MMP-7的检测具有相当的灵敏度、较宽的检测范围、良好的实用性和出色的选择性，表明其在各种生物应用中具有潜在的应用价值。我们的工作进一步强调了阻抗增强剂在提高电流分析性能方面的重要性，鼓励制造具有先进催化活性和高电阻的新型增强剂。

缩写

4-CN：

4-Chloro-1-naphthol

BSA：

牛血清白蛋白

EDS：

能量色散X射线光谱

FCC：

面心立方

FFT：

快速傅里叶变换

GCE：

玻碳电极

开始：

氧化石墨烯

HR-TEM：

高分辨透射电子显微镜

细节层次：

检测限

MMP-2：

基质金属蛋白酶-2

MMP-7：

基质金属蛋白酶-7

NSE：

神经元特异性烯醇化酶

PBS：

磷酸盐缓冲液

Pd-CNC：

Pd功能化碳纳米复合材料

PSA：

前列腺特异性抗原

RSD：

相对标准偏差

SEM：

扫描电子显微镜

SWV：

方波伏安法

待定：

牛血清凝血酶

TEM：

透射电子显微镜