将碳点组装成具有增强稳定性和抗菌活性的框架

介绍

细菌感染对人类生命构成严重威胁，迫切需要开发有效的细菌消毒药物[1]。各种抗生素已被用于治疗细菌感染，但过度使用抗生素会导致其他问题，例如副作用和耐药性问题 [2]。包括抗菌聚合物 [3]、金属纳米材料 [4] 和碳纳米材料 [5, 6] 在内的纳米材料已被用作经典抗生素的替代品 [7]。耐药性和毒性问题都在缓解[8]。最近，CDs [9, 10] 和纳米团簇 (NCs) [11] 被很好地应用于对抗细菌感染，因为它们具有生物相容性 [12]、活性 [13]，并且由于尺寸超小，可以通过循环轻松清洁[14, 15]。尤其是研究人员发现，CDs 显示出优异的自由基清除能力，比许多传统的抗感染药物都要强 [16,17,18]。然而，由于较大的氧化表面积，一些超小型抗菌剂的稳定性较差[19]。迫切需要开发更有效的抗菌剂来对抗细菌感染并长期使用。

为满足实际应用的需求，抗菌剂应具备以下特点： (a) 优良的稳定性，在周围环境中在一定时间内保持不变； (b) 优良的生物相容性和低毒性： (c) 高抗菌活性。较大的纳米材料往往更稳定，但由于活性表面积较小，它们的抗菌活性可能相对较弱。考虑到小型和大型纳米材料的弱点，我们报告了通过简单地添加聚乙烯亚胺 (PEI) 将小型 CD 组装成大型 CDF（图 1）。 CD 没有融合，但保持其形态作为构建块。因此，整个 CDF 显示出更大的尺寸，但在不失去 CD 活性特性的情况下表现出更出色的稳定性。此外，我们发现 CDF 对革兰氏阴性大肠杆菌（大肠杆菌 ) 和革兰氏阳性金黄色葡萄球菌 (金黄色葡萄球菌 ) 与 CDs 相比，表明它们具有广谱抗菌性能，尽管许多 CDs 只能根除革兰氏阳性菌 [20]。此外，CDF 促进 PC12 细胞（一种从大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤中获得的细胞系）的增殖，显示出在神经恢复应用方面的巨大潜力 [21]。这项工作表明小CDs组装成大CDFs不仅增强了稳定性，而且放大了抗菌活性。

添加抗菌活性增强的PEI合成CDs并组装成CDFs的方案

材料和方法

材料和仪器

X 射线表面光电子能谱 (XPS) 记录在 ESCALAB250Xi X 射线表面光电子能谱 (XPS) 仪器上。透射电子显微镜 (TEM) 由在 200 kV 下操作的 JEM-2100 显微镜进行。使用F97荧光光谱仪获得材料的荧光。细菌细胞的 FDA/PI 染色用 Leica DFC450C 显微镜以轻敲模式记录。使用 Nanolog 分光荧光计（Horbia JY，日本）在时间相关单光子计数 (TCSPC) 系统上测量荧光寿命。紫外-可见光谱 (UV-vis) 光谱是从 UV-1600 仪器获得的。通过共聚焦显微镜（Olympus FLUOVIEW FV1000 c）观察细菌成像。所有试剂均为分析纯。实验使用去离子水。 Cell Count-8 Kit-8购自Beyotime Biotechnology。

准备 CD 和 CDF

L-半胱氨酸 (1.0 g) 溶解在 10.0 mL 去离子水中并充分混合。然后，用 1.0 M NaOH 将溶液的 pH 值调节至 9.0。将溶液转移到水热反应器中并在 160°C 下加热 24 小时。将溶液冷却至室温后，将所得溶液使用透析袋(MW 7000截止)透析一天。所获得的 CD 用于以下表征和实验。为了制备 CDF，将 40 µL 1% PEI 添加到 1 mL 的 CD 中。使混合物静置 1 小时。使用与纯化 CD 相同的方法通过透析纯化产物。对于HR-TEM表征，将样品浓缩成小体积，转移到硅胶柱上，用甲醇和二氯甲烷洗脱得到进一步纯化的产物。

毒性评估

PC12 细胞在 96 孔板中接种 12 小时，然后与不同浓度的 CD 和 CDF 一起孵育。使用细胞计数试剂盒-8 测定法 (CCK-8) 研究活细胞的数量。以 1/10 的培养体积添加 3-(4, 5-二甲基噻唑-2-基)-2, 5-二苯基溴化四唑 (MTT)（PBS 中 5 mg/mL），并将细胞放回培养箱。弃去上清液，每孔加入200 μL二甲基亚砜（DMSO）。通过振摇板10分钟溶解晶体。使用 Microreader (Varioskan LUX Multimode Reader) 测量 490 nm 处的吸光度。所有吸光度测量均包括空白对照孔。

抗菌实验

E。大肠杆菌 和S。金黄色葡萄球菌 在不存在和存在 CD 和 CDF 的情况下，在 37°C 下以 250 rpm 摇动孵育。细菌细胞在溶原性肉汤 (LB) 培养物中的生长通过 Microreader 在 600 nm 波长 (OD600) 下进行测量。 LB培养基用作空白对照。 OD600 代表细胞密度，相对细胞活力是基于在材料存在下培养的细菌细胞与对照组之间的比较（细菌细胞在没有 CDs 或 CDFs 的情况下的 OD600）计算得出的。活/死细菌通过FDA/PI染色方案进行评估[22]。

检测 Ros 活性氧 (ROS)

在用 CD 和 CDF 处理 12 小时之前和之后，使用 2', 7'-二氯荧光素二乙酸酯 (DCFH-DA) 探针按照说明测量细胞内 ROS 的产生。发射波长为 525 nm，激发波长为 488 nm。

结果和讨论

材料特性

尺寸调查

图 2 显示了 CDF 粉末在暴露于空气中数小时后的 SEM，具有相对较低（图 2a0）和较高的放大倍数（图 2b0）。可以看出，CDF 分布良好，平均大小约为25 纳米。根据 TEM 和 AFM 研究，CD 应该显示出单分散的小尺寸（附加文件 1：图 S1），但这些小颗粒在暴露于空气一段时间后通过 SEM 观察到聚集（附加文件 1：图 S2 ）。另一方面，尽管 CDF 暴露在周围环境中，但它们仍保持其形态。这表明所获得的 CDF 在实际应用中更有前景。 CDF 通过 TEM 进一步表征（图 2b1）。可以看出，CDFs 展示了以小 CDs 为构建块的组装结构。高分辨率透射电子显微镜（HR-TEM）（图 2b2）分析表明，CDF 的构建块表现出 d 间距为 0.21 nm 的晶格条纹，对应于石墨的（100）面晶格，其为类似于经典 CD [23,24,25]。因此，组装CDFs不失CDs的特点，可以兼具整个大框架和内部小积木的优点。

具有相对较低 (a0 ) 和更高的放大倍数 (b0 );透射电镜 (b1 ) HR-TEM (b2 ) 的 CDF

泽塔电位

Zeta 电位研究用于测量分散系统中相邻带电粒子之间 CD 和 CDF 的静电排斥程度（图 3）。可以看出，暴露在周围环境中的CDs的zeta电位峰没有很好地表征。此外，获得了多个 zeta 电位峰，具有较大的 zeta 偏差（表 1），表明 CD 非常不稳定且不可重复。另一方面，CDF 的 zeta 电位峰值集中在一个相对稳定的范围内。我们还得到了基于 3 次测量的更小的 zeta 偏差，表明 CDF 更稳定，并且分散系统具有更高纯度的样品。

CD 的 Zeta 电位 (a ) 和 CDF (b )

荧光特性

荧光发射光谱用于监测 CD 到 CDF 的组装过程（图 4）。随着 PEI 的滴定，350 nm 处的荧光发射逐渐淬灭（图 4a）。但是没有观察到显着的荧光光谱偏移，表明没有发生聚集。 CDF 的组装结构改变了 CD 的整体大小，从而影响荧光。同时，附近的 CD 标记了彼此的荧光。除此之外，表面化学在荧光特性中也起着重要作用。 CDs表面的氮原子和硫原子可以产生能量陷阱。 CD 的明亮荧光归因于具有许多羰基和氨基的缺陷表面。 PEI 功能化后，CDFs 的表面以氨基为主，随着尺寸的增加，它会淬灭荧光。 TCSPC 进一步检查了 CD 和 CDF 的荧光行为的比较，以了解材料的光生电荷复合途径（图 4b）。在 430 nm 监测发射。荧光衰减需要两分量指数拟合。时间常数和相对幅度在表 S1 中拟合和总结。可以看出，CD 的主要组件的寿命为 2.45 ns，而其他组件的寿命为 7.47 ns。另一方面，CD 的主要组件的寿命为 1.98 ns，而另一个组件的寿命为 7.30 ns。 CDs和CDFs之间没有观察到显着的寿命变化，这也表明CDs在组装成CDFs时的性质没有实质性改变[26]。

荧光发射光谱a CDs 作为 PEI 的滴定和寿命 b 用于 CD 和 CDF

毒性

为了评估材料的安全性，研究了 CDs 和 CDFs 对 PC12 细胞的毒性。进行 MTT 分析以研究材料对细胞活力的影响（图 5）。 PC12 与 CD 和 CDF 孵育后，细胞活力在 24 小时内没有太大影响。有趣的是，这两种碳材料都促进了 PC12 的增殖，这在神经损伤的治疗中起着重要作用。这些结果表明该材料的低毒性，该材料有望用于涉及PC12细胞的神经保护[27]。

存在 CD 时 PC12 的细胞活力 (a ) 和 CDF (b ）。细胞活力（%） =（实验组吸光度—空白组吸光度）/（对照组吸光度—空白组吸光度） × 100%

抗菌研究

CDs 和 CDFs 的抗菌活性最初是通过在 600 nm 处测量细菌密度来评估的 [28]。图 6 显示了 CD 和 CDF 对 S 的显着抗菌作用。金黄色葡萄球菌 和E。大肠杆菌 细胞。尤其是 S 的生存能力。金黄色葡萄球菌 当使用大于 30 µg/mL 的 CDF 时，细胞几乎为 0。同样，E。大肠杆菌 细胞被 CD 和 CDF 消毒。 CD 显示多个电荷（图 3a）。另一方面，CDF 带微量电荷（图 3b），这可能会抑制弱排斥下的细菌粘附，从而更容易与细菌表面相互作用。相比之下，基于当使用大于 6 µg/mL 的材料时，相对较大比例的细胞被杀死的现象，CDF 显示出更高的抗菌活性。 CDFs 增强的抗菌活性可能归因于 CDs 作为构建单元的协同作用以及更稳定的表面电荷。为了深入了解抗菌机制，测量了可以将非荧光 DCFH 氧化为荧光 DFC 的 ROS（图 6C）。两种碳材料在处理 E 后均未显着诱导 ROS 产生。大肠杆菌 .然而，CDF 在与 S 相互作用时显着增强了细胞内 ROS。金黄色葡萄球菌 .由于 ROS 会破坏细菌的 DNA、RNA 和蛋白质，因此增强的值有利于细菌的消毒。此外，ROS 受 H2O2 刺激。值得注意的是，与单独的 H2O2 处理相比，ROS 的产生都得到了显着提升，而 CDF 的增强效果最高。这表明H2O2与这两种碳材料的结合可能进一步增强抗菌活性，尤其是对CDFs。

CDs和CDFs对S的抗菌活性。金黄色葡萄球菌 (a ) 和 大肠杆菌 (b ), c DCF 在 525 nm 处的荧光强度与 ROS 水平呈线性关系，在 H2O2 (100 μM) 不存在和存在下处理 CDs 和 CDFs

一些 CD 以前曾被报道用于消毒 S。金黄色葡萄球菌 ，将其列于表 2 中以供比较。当前的 CDF 显示出具有竞争力的 MIC。此外，CDFs不仅降低了研究的细胞活力，还促进了PC12的细胞增殖，表明其在治疗细菌感染时具有多功能性。

通过活/死染色实验研究 CD 和 CDF 处理后细菌膜的完​​整性（图 7）。绿色荧光 FDA 染色只能显示活细胞，而红色荧光 PI 专门染色破膜的死细菌，但未染色的活细菌膜完整 [30, 31]。从荧光图像中可以看出，CDs处理的样品中可见明显的红色荧光，CDFs处理的样品中死细胞密度更高。

FDA/PI 染色 S。金黄色葡萄球菌 和E。大肠杆菌 在 30 µg/mL 的 CD 和 CDF 不存在和存在的情况下。比例尺，200 µm

基于上述比较，我们得出结论，CDFs 有希望杀死革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌细胞。因此，E。大肠杆菌 和S。金黄色葡萄球菌 在用 30 µg/mL CDF 处理前后通过 SEM 进行表征（图 8）。如图 8a、c 所示，用 CDF 处理前的细菌表现出规则的表面。然而，在与 CDF 孵育后，包括 S 在内的细菌细胞的形态。金黄色葡萄球菌 （图 8b）和大肠杆菌 （图 8d）发生了巨大变化。此外，许多细菌细胞的细胞膜破裂了。在细菌表面观察到一些小物质，它们起源于附着的 CDF。这表明CDFs可以通过破坏细胞膜对细菌细胞进行消毒[32]。

S 的 SEM。金黄色葡萄球菌 (a , b ) 和 大肠杆菌 之前 (a , c ) 和之后 (b , d ) 用 30 µg/mL CDF 处理。比例尺：2 µm

由于 CD 和 CDF 都具有荧光性，因此在消毒过程中研究了 6 µg/mL 的试剂用于细菌成像。 S 的成像。金黄色葡萄球菌 研究并显示在图 9 中。有趣的是，发现 CD 和 CDF 均可用于 S 的成像。金黄色葡萄球菌 .然而，CDF 显示出更高的吸收效率，因为从明场和暗场观察的细菌细胞几乎重叠。另一方面，只有 S 的一部分。金黄色葡萄球菌 细胞被 CD 染色。此外，通过CDFs的处理，细菌细胞密度更小，代表CDFs消毒的S。金黄色葡萄球菌 与相同剂量的 CD 相比，效率更高。这些结果还表明CDFs可作为替代染料用于各种细菌细胞的成像。

S 的成像。金黄色葡萄球菌 12 h 后吸收 CDs 和 CDFs

结论

CDs 组装成 CDFs 导致更强大的抗菌活性。得出的结论是，组装结构使性能更稳定，但放大了 CD 的抗菌活性。这项工作也为将小纳米材料组装成框架提供了新的途径，以实现更多的实际应用。

数据和材料的可用性

支持本文结论的所有数据均包含在本文中。

缩写

CD：

碳点

CDF：

基于碳点的框架

PEI：

聚乙烯亚胺

E.大肠杆菌 ：

大肠杆菌

S.金黄色葡萄球菌 ：

金黄色葡萄球菌

TEM：

透射电子显微镜

HR-TEM：

高分辨率透射电镜

XPS：

X射线表面光电子能谱

MIC：

最低抑菌浓度

NC：

纳米团簇

TCSPC：

时间相关单光子计数

CCK-8：

细胞计数Kit-8检测

ROS：

Ros活性氧

SEM：

扫描电子显微镜

ZP：

Zeta电位