稳定碳点框架展现卓越抗菌功效

摘要

碳点（CDs）因其活性表面而被广泛用作抗菌剂，但部分碳点存在稳定性不足的问题，导致其抗菌活性难以在长期应用中保持可靠。本研究通过水热法合成了蓝光荧光碳点，并利用聚乙烯亚胺（PEI）将碳点组装成碳点基框架（CDFs）。表征结果显示，CDFs荧光受到淬灭，但根据扫描电镜和Zeta电位分析，其性能表现出更高的稳定性。碳点和CDFs均对革兰氏阴性菌大肠杆菌（E. coli）和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌（S. aureus）具有抗菌活性，但CDFs展现出更优异的抗菌性能，对S. aureus的最低抑菌浓度（MIC）为30 μg/mL即可完全抑制。这表明CDFs同时增强了稳定性和抗菌活性，更具实际应用前景。

引言

细菌感染严重威胁人类健康，开发高效杀菌药物迫在眉睫。虽然各类抗生素被广泛用于治疗细菌感染，但滥用抗生素导致副作用和耐药性等问题。包括抗菌聚合物、金属纳米材料和碳纳米材料在内的纳米材料已成为传统抗生素的替代选择，可缓解耐药性和毒性问题。近年来，碳点和纳米簇因生物相容性好、活性高、超小尺寸易随循环清除，被广泛应用于抗菌感染研究。研究发现碳点具有优异的自由基清除能力，甚至强于许多传统抗感染药物。然而，部分超小抗菌剂因氧化表面积大而稳定性差，亟需开发更稳定、高效的长效抗菌剂。

为满足实际应用需求，抗菌剂应具备：(a) 环境中长期稳定性；(b) 良好生物相容性和低毒性；(c) 高抗菌活性。大尺寸纳米材料虽稳定但活性表面积小、抗菌活性相对较弱。针对大小纳米材料的短板，本研究通过简单添加聚乙烯亚胺（PEI）将小尺寸碳点组装成大尺寸CDFs（图1）。碳点未融合且保留形态作为构建单元，使CDFs整体尺寸增大，稳定性显著提升，同时保留了碳点的活性特性。实验发现，CDFs对革兰氏阴性菌E. coli和革兰氏阳性菌S. aureus均表现出增强的广谱抗菌活性（许多碳点仅杀灭革兰氏阳性菌）。此外，CDFs促进PC12细胞（大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系）增殖，显示神经修复应用潜力。本工作表明，将小碳点组装成大框架不仅提高稳定性，还能放大抗菌活性。

材料与方法

材料与仪器

X射线光电子能谱（XPS）采用ESCALAB250Xi仪器测定；透射电镜（TEM）使用JEM-2100显微镜（200 kV）；荧光光谱用F97荧光光谱仪；FDA/PI染色细菌成像用Leica DFC450C显微镜；荧光寿命采用时域相关单光子计数（TCSPC）系统（Horbia JY, Japan）测量；紫外-可见光谱（UV-vis）用UV-1600仪器；细菌成像用共聚焦显微镜（Olympus FLUOVIEW FV1000）；所有试剂为分析纯，实验用去离子水；CCK-8试剂盒购自Beyotime Biotech。

碳点与CDFs制备

L-半胱氨酸（1.0 g）溶于10.0 mL去离子水，用1.0 M NaOH调pH至9.0，转入水热反应釜，160°C反应24 h。冷却后用透析袋（MWCO 7000）透析1天得碳点。制备CDFs时，向1 mL碳点溶液加入40 μL 1% PEI，静置1 h，同法透析纯化。HR-TEM表征样品经浓缩、硅胶柱分离、甲醇和二氯甲烷洗脱进一步纯化。

毒性评价

PC12细胞接种于96孔板12 h后，与不同浓度碳点和CDFs共孵育。用CCK-8法检测活细胞数：加入MTT（5 mg/mL PBS）1/10培养体积，继续孵育，弃上清，加DMSO（200 μL/孔）溶解结晶，摇床振荡10 min，用微孔板读数仪（Varioskan LUX）测490 nm吸光度。所有测量含空白对照孔。

抗菌实验

E. coli和S. aureus于37°C、250 rpm摇床培养，有无碳点/CDFs条件下测OD600反映菌密度。LB培养基作空白对照，相对存活率=处理组OD600/对照组OD600。活/死菌用FDA/PI染色法评估。

ROS检测

细菌经碳点/CDFs处理12 h后，用DCFH-DA探针检测胞内ROS，激发488 nm、发射525 nm测荧光强度。

结果与讨论

材料表征

尺寸分析

图2展示CDFs粉末SEM图像（不同放大倍数，暴露空气数小时后）。CDFs分布均匀，平均粒径约25 nm。碳点虽经TEM/AFM证实为单分散小颗粒，但SEM观察到暴露空气后发生聚集（补充图S2）；而CDFs暴露环境中仍保持形态，更适合实际应用。TEM（图2b1）显示CDFs为小碳点组装的结构；HR-TEM（图2b2）晶格条纹d=0.21 nm，对应石墨(100)晶面，与经典碳点一致，说明组装过程未改变碳点本征特征，兼具大框架稳定性与小构建单元活性。

Zeta电位

Zeta电位反映分散体系中带电粒子间静电排斥程度（图3）。碳点暴露环境后Zeta电位峰不明显，多峰且偏差大（表1），表明极不稳定、重现性差；CDFs电位峰集中在稳定区间，三次测量偏差极小，说明分散体系稳定、纯度高。

荧光性质

荧光发射光谱监测组装过程（图4）。随PEI滴加，350 nm处荧光逐渐淬灭（图4a），但无显著光谱位移，排除团聚。组装改变整体尺寸影响荧光，相邻碳点相互淬灭；表面化学也起关键作用：碳点表面氮、硫原子形成能阱，羰基/氨基缺陷赋予强荧光；PEI修饰后表面以氨基为主，伴随尺寸增大导致荧光淬灭。TCSPC进一步对比光生电荷复合路径（图4b，监测430 nm发射）。双指数拟合显示：碳点主寿命分量2.45 ns、次要7.47 ns；CDFs主分量1.98 ns、次要7.30 ns。寿命无显著变化，表明组装未实质改变碳点光物理特性。

毒性评价

MTT法检测碳点/CDFs对PC12细胞毒性（图5）。24 h共孵育后，两种碳材料均不降低细胞活性，反而促进PC12增殖，提示低毒性及神经保护潜力。

抗菌研究

OD600法初步评价抗菌活性（图6）。碳点和CDFs均对S. aureus和E. coli有显著抑菌效果。CDFs浓度≥30 μg/mL时S. aureus活性近乎为0；E. coli也被两者有效杀灭。碳点带多重电荷（图3a），CDFs电荷可忽略（图3b），弱排斥利于接触细菌表面。对比显示，≥6 μg/mL时CDFs杀菌比例更高，抗菌活性增强。机制可能归因于：碳点构建单元的协同效应 + 更稳定的表面电荷。ROS检测深入机制（图6c）：两材料处理E. coli均不显著诱导ROS；但CDFs处理S. aureus显著增强胞内ROS。ROS可损伤细菌DNA/RNA/蛋白，促进杀菌。外源H₂O₂联合两材料均大幅增强ROS产生，CDFs增强最明显，提示联合疗法潜力。

表2列举前人报道碳点抑制S. aureus的MIC对比，本研究CDFs具有竞争力。且CDFs促进PC12增殖，显示治疗细菌感染的多功能性。

FDA/PI活/死菌染色考察菌膜完整性（图7）。绿色FDA染活菌，红色PI仅染膜破裂死菌。碳点处理组可见明显红荧光，CDFs处理组死菌密度更高。

基于上述对比，CDFs对革兰氏阳/阴性菌均有效。SEM观察30 μg/mL CDFs处理前后E. coli和S. aureus形态（图8）。处理前菌体表面规整；处理后形态剧变，膜破裂，菌表观察到小颗粒物质（来自吸附CDFs），证实CDFs通过破坏菌膜杀菌。

利用碳点/CDFs荧光特性（6 μg/mL）对S. aureus杀菌过程成像（图9）。两者均可成像，但CDFs摄取效率更高（明/暗场图像近乎重合），碳点仅染部分菌体。且CDFs处理组菌密度更低，同剂量下杀菌更高效。提示CDFs可作为替代染料成像多种细菌。

结论

碳点组装成CDFs显著增强抗菌活性。组装结构赋予更稳定性能的同时放大了碳点抗菌活性。本工作为小尺寸纳米材料组装成框架结构以实现实际应用提供了新思路。