硫酸辅助合成亮红色碳化聚合物点用于双光子生物成像

摘要

在硫酸（H₂SO₄）催化影响下，从对苯二胺（p-PD）水溶液制备红光发射碳化聚合物点（CPDs）。所得SA-CPDs（平均直径≈5 nm）在测试酸中显示最亮光致发光，水中量子产率（QY）21.4%，总收率16.5%。300-580 nm激发均稳定产生600 nm发射，与激发波长无关。密度泛函计算显示质子化前体横向生长能量上更有利，驱动纳米级CPDs形成。850 nm飞秒激光激发下双光子发光（602 nm）在HeLa细胞成像中得到验证，凸显SA-CPDs在生物医学应用潜力。

背景

碳点（CDs）因优异水溶性、光学稳定性、低毒性、低成本合成受广泛关注。应用于电化学传感器、生物成像、催化、发光器件、光电子学。自下而上从有机单体、聚合物或天然产物合成路线利于大规模生产。官能团如-OH、-COOH、-C=O、-NH₂在高温脱水碳化生成荧光纳米颗粒。

红光发射CDs对生物成像尤为宝贵，因其组织穿透深、背景干扰小。但大多数CDs表现激发依赖性发射，稳定单一红光子源罕见。苯二胺异构体（邻、间、对）分别用于制备蓝、绿、红CDs。近期工作鉴定p-PD基点为碳化聚合物点（CPDs），因其激发无关发射。

本文呈现简易、高产、硫酸辅助水热合成红光发射CPDs，并演示其在HeLa细胞中双光子成像能力。

方法

酸辅助p-PD体系合成红色CPDs

考察H₂SO₄、HCl、HClO₄作为质子供体，所得CPDs分别标记为SA-CPDs、HC-CPDs、PA-CPDs。系统优化反应变量——酸与p-PD比、前体浓度、温度、时间。水热处理（200°C, 2 h）后，正己烷（除未反应p-PD）、乙醇（除酸）纯化，14,000 rpm离心，0.22 µm膜过滤，可选旋转蒸发得干粉。

表征与测量

高分辨TEM（JEM-2100, 200 kV）评估形貌和晶格条纹。FT-IR用Prestige-21光谱仪（KRS-5窗口）记录。荧光和UV-Vis光谱分别用F-2500分光光度计和Lambda 950光谱仪获取。双光子发光用光纤光谱仪（QE65000, Ocean Optics）耦合飞秒激光测量。量子产率以罗丹明B（乙醇中QY=56%）为参比，按补充文件1步骤计算。

计算方法

密度泛函理论（DFT）计算用Gaussian 09（B3LYP/6-311++G(d)，PCM水模型）评估纵向和横向生长路径能量。

细胞培养与处理

HeLa细胞（4×10⁴ cells/mL）接种于DMEM（Gibco），37°C、5% CO₂培养24 h。加入SA-CPDs（40 µg/mL）孵育12 h，PBS洗涤。共聚焦显微镜用850 nm飞秒激光（30 mW）成像。

结果与讨论

优化红色CPDs制备条件

所有酸体系在180°C以上（2 h）均得红色CPDs。高温（240°C, 4-12 h）增大粒径、降低荧光。最优条件：200°C, 2 h，H₂SO₄酸/p-PD比1，HCl和HClO₄比3。p-PD浓度范围（0.02-0.20 mol/L）容忍度高。这些参数下SA-CPDs达QY 21.4%、收率16.5%，优于HC-CPDs和PA-CPDs。

TEM表征与FT-IR分析

HR-TEM显示单分散球形CPDs（平均直径≈5 nm），0.21 nm晶格间距对应石墨烯(100)晶面。FT-IR显示SA-CPDs表面氧化程度更高，-OH和-COOH特征明显、-NH₂信号减弱，暗示更氧化、亲水表面。

CDs形成机制探讨

DFT计算显示横向生长（-1,406 kJ/mol）显著优于纵向生长（-616 kJ/mol），形成平面中间体自组装成球形CPDs。

光学性质

SA-CPDs在290 nm显强UV吸收（π→π*），430和510 nm有额外吸收带（菲嗪-胺跃迁）。激发光谱峰近580 nm，匹配600 nm发射，荧光在220-580 nm激发下保持激发无关，确认CPDs本质。

细胞成像

850 nm双光子激发产生602 nm发射（研磨前）和529 nm发射（研磨后），强度增强。共聚焦图像显示HeLa细胞胞质定位，因蓝移发射绿色通道荧光更强。

结论

我们展示了一种简单、可规模化、硫酸辅助水热法制备亮红色CPDs（≈5 nm, QY=21.4%, 收率=16.5%）。CPDs在300-580 nm激发下发射600 nm，850 nm双光子激发下发射602 nm。其激发无关、高亮度荧光和高效细胞摄取使其成为深层组织成像及其他生物应用的有力候选者。

缩写

CDs:

碳点

CPDs:

碳化聚合物点

HC-CPDs:

HCl辅助合成的CPDs

PA-CPDs:

HClO₄辅助合成的CPDs

SA-CPDs:

H₂SO₄辅助合成的CPDs

QYs:

量子产率

p-PD:

对苯二胺