硫酸辅助碳化聚合物发红光点的制备及生物成像应用

背景

碳点(CDs)由于其优异的水溶性、光学稳定性、独特的荧光特性、低毒性、低成本等优点而备受关注[1]。大多数 CD 被研究为各种应用的潜在候选者，例如电化学免疫传感器 [2]、生物成像 [3,4,5,6] 传感器 [7,8,9,10,11,12]，光-催化 [13,14,15]、发光器件 [16] 和光电子学 [17,18,19]。 CDs的合成在光学性质和应用的研究中起着重要作用。已报道的制备 CD 的方法主要可以概括为从各种碳材料“自上而下”和从有机分子、聚合物或天然产物“自下而上”[20]。 “自下而上”的方法是大规模合成荧光 CD 的有效途径 [21]。应用分子中的-OH、-COOH、-C=O和-NH2基团可以通过水热、微波、燃烧、热解等在高温下脱水和碳化。

由于在生物成像领域具有较大的穿透深度，红色发光点引起了相当大的兴趣。特别是纯色点在某些场合是至关重要的，因为与激发波长无关的发光材料可以提供单一且稳定的光致发光 (PL) 光。 CDs的大部分发射与激发波长有关，CDs通常发出蓝色、绿色或黄色光，少数CDs发出亮红色光[22]。

最近，苯二胺（PD）的异构体，如o -, m -, 和 p -PD，已被研究作为制备 CD 的碳源 [8, 9, 23, 24]。可以从 m 制备发蓝光、绿光和红光的 CD -, o -, 和 p -PD乙醇溶液，分别[23]。可以从 p 制备全彩发光 CD -PD和尿素水溶液[24]。在我们之前的工作 [25] 中，我们提出新的红碳点（量子产率 =15.8%，在水中）可以从“p -PD + HNO3”水相体系，应用于水中金属离子的检测。最近，类似的“o -PD + H3PO4” [26] 和“o -PD + HNO3” [27] 系统被报道，Liu 等人。 [27] 将他们的 CD（QYs =10.8%，在水中）重命名为“碳化聚合物点（CPD）”。与传统的碳点不同，CPDs的发射波长不依赖于激发波长，因此基于PD的“CDs”应该更准确地命名为CPDs。

在此，我们报告了一种简便高效的强酸辅助水热路线制备发红光 CPD 的方法以及具有双光子光致发光特性的生物成像的应用。利用Gaussian 09程序包提出了CPD的形成机制。

方法

从酸辅助 p 合成红色 CPD -PD系统

基于我们之前的工作[25]，我们选择硫酸（H2SO4）、盐酸（HCl）和高氯酸（HClO4）作为制备红色 CPDs 的助剂，相应的 CPDs 标记为 SA-CPDs、HC -CPD 和 PA-CPD，分别。为了优化H2SO4辅助系统的实验条件，我们选择了几个参数，如c （酸）到 c (p -PD) 比率，c (p -PD)、温度 (T ) 和反应时间 (t ）。 CPDs产物用己烷洗涤以除去未反应的p -PD 和乙醇去除酸，以 14000 rpm 离心 30 分钟去除聚合物沉淀，并通过 0.22 μm 滤膜过滤。如果需要粉末，纯化的 CPDs 溶液可以在 80°C 和低真空条件下通过旋转蒸发器进一步蒸发至接近干燥状态（剩余的将是粉末形式）。

表征和测量

在 200 kV 下运行的 JEM-2100 透射显微镜上记录高分辨率 TEM (HR-TEM) 图像。通过使用 KRS-5 窗片（TlBr 和 TlI 的混合物），使用 Prestige-21 FT-IR 光谱仪收集 CPDs 溶液的红外光谱，通常，将液相滴在一个切片上并干燥。切片被另一切片覆盖并固定在测试台上。然后记录红外光谱。

CPDs的荧光光谱在F-2500荧光分光光度计上测量。 UV-Vis吸收光谱在Lambda 950 UV/VIS/NIR光谱仪上记录。 CPD的双光子发射光谱由显微镜系统中的光纤光谱仪（QE65000，Ocean Optics）记录。将SA-CPDs水溶液和粉体复溶溶液旋涂在载玻片上，测定双光子光致发光性能。

CPD 的光致发光量子产率 (QYs) 是用罗丹明 B（QYs =56% 在乙醇中）作为参比染料在 580-610 nm 的发射范围内由 365 nm 紫外光激发 [25, 28] 来测量的，过程QY 测量值显示在附加文件 1 中。

计算方法

Gaussian 09 包用于密度函数理论 (DFT) 计算 [29]。平衡结构通过 B3LYP 方法结合 6-311++G (d) 基组水平进行优化 [30]。为了研究溶剂效应的作用，在极化连续模型 (PCM) 中使用了水。以相同的水平进行频率分析，以确认每个优化结构对应于一个静止点。

细胞培养和处理

1.35 mL 在 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM；Gibco）中的 HeLa 细胞，初始密度为 4 × 10 ⁴ 每毫升细胞接种在每个培养皿中，并在 37°C 下在含有 5% CO2 的湿润气氛中培养 24 小时。将 SA-CPD 粉末重新溶解在水中以制备储备溶液 (400 μg mL ^{− 1} ）。 1350 μL 细胞与 150 μL SA-CPDs 储备液（终浓度为 40 μg mL ^{− 1} ) 12 小时，然后用 PBS 洗涤 3 次以去除游离的 SA-CPD。最后，在 850 nm 飞秒激光激发（30 mW）下用共聚焦显微镜收集细胞成像结果。

结果与讨论

为红色 CPD 优化准备

在基本实验中，研究了具有不同浓度比、反应温度和时间的不同酸辅助系统（参见附加文件 1：图 S1）。我们发现，对于不同的酸系统，在 180°C 以上（反应 2 小时）可以形成红色 CPD，并且反应不受溶液中阴离子的影响。长时间（H3PO4 和 HF 系统为 4-12 小时，240°C，参见附加文件 1：图 S1f）反应会增加粒径，最终红色荧光会消失，而荧光变化不明显HCl 系统（2-6 小时，200°C，参见附加文件 1：图 S2）。考虑到特氟龙内胆的节能和温度上限，选择最佳温度和反应时间分别为200℃和2h。基于p的优化策略 -PD + HCl 系统（参见附加文件 1：图 S2），我们优化了 p -PD + H2SO4 和 p -PD + HClO4体系得到优化结果如表1所示。

SA-CPD、HC-CPD 和 PA-CPD 由 p 制备 -PD 溶液分别在 H2SO4、HCl 和 HClO4 的帮助下。优化后的c （酸）到 c (p -PD) H2SO4-、HCl-和 HClO4 辅助系统的比率分别为 1、3 和 3（参见附加文件 1：图 S3a）。合适的c (p -PD) 制备红色 CPD 的范围很广（从 0.02 到 0.20 mol L ^{− 1} ）。优化温度 (T ) 和反应时间 (t ) 是 200°C 和 2 小时。 SA-CPD 是最亮的红色 CPD，QY 高达 21.4%（附加文件 1：图 S3b）。与 HCl-、HClO4- 和 HNO3 辅助碳点相比，H2SO4 辅助碳点具有更好的质量有两个原因（发表于我们之前的工作 [25]）。首先，H2SO4 是一种不挥发的强酸，它在高温高压反应溶液中保持其酸性。其次，H2SO4 辅助系统是唯一一种可以在前驱体中形成铵盐沉淀的系统，沉淀缓慢释放游离反应物，避免形成大颗粒聚合物沉淀，进一步促进高质量碳点的形成。 HA-CPD 和 PA-CPD 是深红棕色浓溶液，在 365 nm 紫外光照射下发出深红色 PL，而制备的 SA-CPD 是亮红色透明稀溶液，发出亮红光（附加文件1：图 S3c)。经过洗涤、浓缩、过滤和蒸发纯化后，得到深红棕色的 SA-CPDs 粉末（附加文件 1：图 S3d），产品收率为 16.5%。粉末可以重新溶解在水中，溶液会发出明亮的红色荧光（附加文件 1：图 S3e）。

TEM 表征和 FT-IR 分析

样品 OpPD（不含 H2SO4）和 SA-CPD（含 H2SO4）的 TEM 图像如图 1 所示。样品 OpPD 由片段（低聚物，图 1a）和聚合物（图 1a 插入物）组成。 SA-CPD 是单分散的 CPD，平均尺寸约为 5 nm（图 1c）。它表现出良好分辨的晶格指，间距为~ 0.21 nm（图1b插入），对应于石墨烯的（100）面内晶格间距[31, 32]。

样品 OpPD（不含 H2SO4）的 TEM 图像 (a ) 和 SA-CPD (b ）。 c SA-CPD 的尺寸分布。 d 样品 OpPD 和红色 CPD 的 FT-IR 光谱。样品 OpPD 和 SA-CPD 由 p 制备 -无和有H2SO4辅助的PD水溶液

CPD 的表面状态可能会影响光学特性。样品 OpPD 和 SA-CPD 的表面化学基团通过 FT-IR 光谱表征（图 1d）。两个样品有几个相似的组，例如 Ar-H (2700–3200 cm ^{− 1} [33]，属于芳香族C-H伸缩振动），C-C（~ 1433 cm ^{− 1} , 属于芳香族碳骨伸缩振动，揭示了苯类单元特有的芳香伸缩振动的存在) [34], 和 C=O (1628 cm ^{− 1} , 属于 –COOH 基团）。与样本 OpPD 相比，新组，例如 O-H (3300–3700 cm ^{− 1} 和 1175 cm ^{− 1} 属于 –COOH 基团），C-O-C（1055 cm ^{− 1} , 存在于酯中）和 C-H (2400–3000 cm ^{− 1} 属于开环反应中形成的烷基），存在于 CPD 中，而 -NH2 或 -NH- 相关基团如 N-H (3100–3300 cm ^{− 1} 和 1512 cm ^{− 1} 和 C-N（1126、1261 和 1305 cm ^{− 1} 属于来自 p 的游离 -NH2 或 -NH- 基团 -PD前兆，减弱或消失。 -OH或-COOH基团的存在表明SA-CPDs（添加H2SO4）表面的氧化程度高于样品OpPD（未添加酸）。

CD 形成的建议机制

使用 Gaussian 09 程序包计算形成能。双聚物经酸助质子化后，可以通过纵向和横向两种方式聚合。横向生长的计算形成能 (− 1406.07 kJ mol ^{− 1} ) 显着高于纵向生长 (− 616.25 kJ mol ^{− 1} ）。它表明完全质子化的双聚合物（pH 3，在过量 H ⁺ 添加）倾向于以横向方式聚合以形成平面结构（图 2）。然后将这些平面结构自组装形成球形CPD。

纵向和横向生长的形成能

光学性质

尽管是通过不同酸的辅助制备的，但所有 CPD 都具有相似的光学特性 [25]。对于 SA-CPDs 水溶液的 UV-Vis 光谱（图 3a），位于 ~ 290 nm 的吸收峰与苯环中的跃迁相关，位于 430 nm 和 510 nm 的峰可归于 π分别与相邻胺基上的孤电子对共轭的取代吩嗪的 -π* 跃迁和电子从苯环到醌环的跃迁 [32]。激发曲线描述了可见光区域的宽且逐渐上升的趋势，最大激发峰 (~ 580 nm) 接近发射峰 (~ 600 nm)。当从 220 nm 激发到 310 nm 时，CPD 在红光区（600-700 nm）发射，而在从 310 nm 激发到 580 nm 时发射橙色光（~ 600 nm）（图 3b）。值得注意的是，这种发红光的CPDs的荧光与激发波长无关[22, 35]。

一 UV-Vis 吸收、激发（600 nm 处的峰值）和 b SA-CPD 的发射（激发 220-580 nm）光谱

细胞成像

图 4a 显示了粉化前后 SA-CPD 的双光子光致发光特性。飞秒脉冲激光 (30 mW) 在 850 nm 的相同激发波长下，从 602 nm（上粉工艺前）到 529 nm（上粉工艺后）发生蓝移。粉化后PL强度增加。

SA-CPDs的双光子光致发光光谱(a ) 和经 850 nm、30 mW 飞秒脉冲激光激发的 SA-CPD 处理的 HeLa 细胞的共聚焦荧光显微镜图像 (b –e )

SA-CPD 粉末重新溶解在 PBS (1X) 中，并使用共聚焦荧光显微镜和 850 nm 飞秒脉冲激光 (30 mW) 应用于 HeLa 细胞成像（见图 4b-e）。与 HeLa 细胞一起培养 12 h 后，SA-CPDs 被 HeLa 细胞吞噬，CPDs 进入细胞质。红色通道（645-675 nm）的荧光强度较弱，而绿色通道（526-574 nm）的荧光强度较亮，这与粉化过程中的蓝移一致。

结论

报道了一种简便的酸辅助水热法制备碳点的方法及其在生物成像方面的应用。在 H2SO4-、HCl-和 HClO4 辅助系统中，由 H2SO4 辅助系统制备的 SA-CPD 是最亮的 CPD，平均粒径为 ~ 5 nm，QY 为 21.4%，产品产率为 16.5%。 SA-CPDs 水溶液在被 300 到 580 nm 的光激发时在 600 nm 处发射。发射波长与激发波长无关。此外，当被 850 纳米飞秒脉冲激光 (30 毫瓦) 激发时，SA-CPD 具有双光子光致发光特性，发射波长为 602 纳米。该方法也已用于 HeLa 细胞的成像，并具有在例如生物成像应用方面的潜力。

缩写

CD：

碳点

CPD：

碳化聚合物点

HC-CPD：

碳点由 p 制备 -带HCl辅助系统的PD

PA-CPD：

碳点由 p 制备 -带HClO4辅助系统的PD

p -PD：

P -苯二胺

QY：

量子产率

SA-CPD：

碳点由 p 制备 -H2SO4辅助系统PD