基于聚苯乙烯-丙烯酸纳米颗粒和金纳米颗粒的超灵敏电化学 DNA 生物传感器检测霍乱弧菌

摘要

本文报道一种高灵敏电化学 DNA 生物传感器检测霍乱弧菌 DNA。传感器使用聚苯乙烯-共-丙烯酸 (PSA) 乳胶纳米球负载金纳米颗粒 (AuNPs) 作为 DNA 载体基质。利用蒽醌基寡核苷酸标记的差分脉冲伏安法 (DPV) 测量杂交信号。AuNPs 显著放大法拉第电流，产生可重现线性响应范围 1.0×10⁻²¹ 至 1.0×10⁻⁸ M (RSD=4.5%, n=5)，检测限 (LOD) 1.0×10⁻²¹ M (R²=0.99)。加标样本回收率 91%–109% (n=3)。传感器 58 天后保留 95% 原始响应，可重复使用六次 (RSD=5%, n=5)。

背景

霍乱弧菌仍是全球健康威胁，特别是资源匮乏地区。传统培养法缓慢繁琐，PCR 需昂贵设备和熟练操作员。快速、廉价、高灵敏诊断对及时控制疫情至关重要。电化学 DNA 生物传感器提供高灵敏度、特异性和小型化潜力，适合即时检测 (POC)。

方法

化学试剂

聚苯乙烯、丙烯酸、HAuCl₄·3H₂O、柠檬酸三钠等来自 Fluka、Sigma-Aldrich、Riedel-De Haën。靶标、错配、报告寡核苷酸由 Bio Service Unit (NSTDA) 和 Bioneer 合成。

仪器

丝网印刷碳电极 (SPE) 配 Ag/AgCl 参比和铂对电极，Autolab PGSTAT12 电化学工作站进行 DPV 测量。电化学参数：0.02 V 步长、0.5 V s⁻¹ 扫描速率、0.05 M 磷酸盐缓冲液 pH 7。

AuNPs 和 PSA 乳胶颗粒合成

AuNPs 采用柠檬酸还原法 (Turkevich 法) 制备。PSA 乳胶球经无皂乳液共聚苯乙烯和丙烯酸合成，得亚微米颗粒 (~186 nm) 具丰富羧基用于 DNA 连接。

电极修饰与 DNA 固定

PSA 颗粒滴涂于 SPE，继之 AuNPs 沉积。pH 5 缓冲液中 EDC/NHS 偶联活化羧基，随后固定 5 µM 捕获探针。含 5 mM 蒽醌标记 (AQMS) 的 1 µM 靶 DNA 杂交分两阶段：捕获-靶标和报告结合，各 1 小时。

优化

探针负载 (1–6 µM) 和 AQMS 浓度 (0.1–5 mM) 优化；4 µM 探针和 1 mM AQMS 给最大响应。pH 7、0.05 M 磷酸盐缓冲液、2.0 M NaCl 提供最优离子条件。杂交时间 60 分钟、探针固定时间 8 小时入选。

性能评估

传感器展示 1.0×10⁻²¹ 至 1.0×10⁻⁸ M 线性范围，LOD 1.0×10⁻²¹ M。加标样本 (1.0×10⁻⁴ 至 1.0×10⁻⁶ µg µL⁻¹) 回收率 91.4%–108.9% (n=3)。货架寿命研究显示 58 天后 95% 活性保留；0.1 M NaOH 再生可重复使用六次，RSD 5%。

结果与讨论

SEM 确认均匀 PSA 球体 (~186 nm)。DPV 分析显示 AuNP 负载减小峰电位分离 (ΔEₚ)，指示电子传递改善。杂交实验显示仅当靶标和报告探针同时存在时 DPV 峰电流显著增加，确认三明治型特异性。确定最优探针负载和 AQMS 浓度；高探针密度导致响应平台，过量 AQMS 引起背景噪声。pH 7、Na⁺ 离子、高离子强度 (2.0 M NaCl) 最大化杂交效率。

标定曲线显示优异线性 (R²=0.99)。传感器亚zeptomolar LOD 超越前报 PSA 基或亲和素-生物素系统，同时保持快速检测 (~60 分钟)。稳定性测试显示 58 天信号损失极小，再生方案恢复最多六循环全活性。

结论

开发了一种稳健、无需扩增的电化学 DNA 生物传感器，以高特异性和重现性在亚zeptomolar 浓度检测 V. cholerae DNA。其简单制备、快速检测、长货架寿命使其适合疫情现场部署。