钴磷化物纳米颗粒：一种用于敏感、无酶过氧化氢检测的稳健电催化剂

摘要

本工作利用简单温和的水热法制备钴磷化物纳米颗粒（Co₂P NPs），无需有害磷源。通过透射电镜、X射线衍射和X射线光电子能谱表征Co₂P形貌结构和表面成分。考虑到过渡金属磷化物优异的电催化还原活性和良好导电性，我们在氧化铟锡（ITO）衬底上制备Co₂P NPs（Co₂P/ITO）用于H₂O₂检测。Co₂P/ITO传感器显示响应时间<5 s、线性范围0.001–10.0 mM、检测限0.65 μM。此外，非酶Co₂P/ITO传感器表现出优异的选择性、重现性、重复性和稳定性，具备作为可靠H₂O₂生物传感器的潜力。

引言

过氧化氢（H₂O₂）是生物体内典型的活性氧物种，在正常生理功能中起关键作用[1]。细胞内H₂O₂浓度与细胞生理平衡密切相关[2]。大量研究表明，癌症、阿尔茨海默病、帕金森病等严重疾病可能由异常H₂O₂浓度引起[3,4,5]。开发准确、敏感、快速、选择性的H₂O₂检测方法（作为氧化应激生物标志物）无疑有助于早期诊断。目前已应用光谱法[6]、比色法[7]、荧光法[8,9]和电化学法[10,11,12]等多种分析方法进行H₂O₂测定。电化学法，特别是安培法，因其高灵敏度、优异选择性和低成本，正逐渐成为生物分析中H₂O₂检测最简单有效的方法之一。

酶电化学传感器已被证明对H₂O₂检测有效。然而，酶固定化复杂、环境不稳定性和低重现性限制了酶基传感器大规模应用。因此，开发非酶电化学H₂O₂传感器极为必要。

近年来，基于贵金属[13,14,15]、非贵金属及其化合物[16,17,18,19]或碳材料[20,21]的传感器越来越多用于电化学H₂O₂检测。作为制备非酶生物传感器的电化学活性材料，过渡金属化合物受到越来越多关注。过渡金属磷化物（TMPs）是一类新开发材料，具有优异电催化活性、良好导电性和诸多优异性质，已在析氢[22,23]、加氢脱硫[24]和超级电容器电极[25]等领域广泛研究。近期研究表明CoP、Ni₂P和Cu₃P[26,27,28]也可作为高效电催化剂用于非酶H₂O₂检测。但TMPs在生物分析应用研究仍有限。此外，制备TMPs使用三苯基膦[29,30]、白磷[31,32]或其他环境有害磷源[33]会增加操作风险。因此，开发TMPs绿色制备方法值得补充。

本工作利用醋酸钴和红磷为原料，通过一步水热法制备Co₂P NPs。通过滴铸法在ITO衬底上制备Co₂P/ITO电极用于H₂O₂检测。Co₂P对H₂O₂还原表现出优异电催化活性，且显示良好选择性、优异重现性和稳定性，展现作为敏感H₂O₂检测平台的潜力。

实验部分

试剂与材料

所有试剂均为分析纯，无需进一步纯化直接使用。醋酸钴四水合物(Co(Ac)₂·4H₂O)、氯化钴六水合物(CoCl₂·6H₂O)、D-(+)-葡萄糖、L-甘氨酸(L-Gly)、抗坏血酸(AA)、尿酸(UA)、尿素、NaCl、KCl、NaH₂PO₄、Na₂HPO₄、过氧化氢(30% H₂O₂)、乙醇、丙酮购自国药集团化学试剂有限公司。D-(-)-果糖、L-精氨酸(L-Arg)、L-赖氨酸(L-Lys)、多巴胺(DA)、对乙酰氨基酚(APAP)、氨基三亚甲基膦酸(ATMP, 50 wt%)购自阿拉丁公司。商品红磷(98.5%, 100目)购自能源化学科技(上海)有限公司。Nafion PFSA聚合物分散液(5%)购自北京鸿海天科技有限公司。所有实验用去离子水。氧化铟锡(ITO)玻璃(10×20×1.1 mm, ITO膜厚185±2 nm, 方阻6.6±0.1 Ω)由深圳南祥城科技有限公司提供。

Co₂P纳米颗粒合成

商品红磷(2 g)分散在15 mL水中超声处理，在50 mL聚四氟乙烯衬里不锈钢高压釜中200°C水热处理12 h去除氧化层[34]。水热处理后红磷在真空烘箱干燥。预处理后，1 mmol Co(Ac)₂·4H₂O溶于30 mL蒸馏水得水溶液。将水热处理后红磷在超声下加入溶液15 min，Co/P摩尔比1/10。制备悬浊液快速倒入50 mL聚四氟乙烯衬里高压釜，在电子烘箱中分别于160, 200, 240°C水热处理12 h。产物离心收集，分别用蒸馏水和乙醇洗涤三次。最后Co₂P NPs在空气中60°C干燥3 h。

Co(PO₃)₂合成

Co(PO₃)₂制备参考前文[35]。先配制0.1 M CoCl₂·6H₂O甲醇溶液。向20 mL上述紫色溶液中滴加2 mL ATMP(50 wt%)并搅拌30 min。溶液中随后形成不溶性钴偏磷酸盐配位聚合物。所得粉红粉末在Ar气流下以5°C/min升温至900°C保温2 h。冷却至室温收集黑色产物，在空气中650°C再加热4 h去除碳化有机配体。最终得浅紫色Co(PO₃)₂粉末。

Co₂P/ITO电极制备

首先将ITO玻璃(1 cm×2 cm)分别在丙酮、乙醇、去离子水中超声清洗10 min。处理后ITO在氮气吹扫下干燥。电极改性时，5 mg Co₂P NPs分散于1 mL去离子水形成5 mg/mL悬浊液。加入5 μL 5% Nafion溶液并超声15 min得均匀墨水状悬浊液。将100 μL Co₂P悬浊液滴铸于ITO表面，空气干燥得工作电极。Co₂P/ITO电极制备示意图见Scheme 1。

表征

X射线衍射(XRD)数据由D8 ADVANCE衍射仪(Cu Kα辐射)分析。透射电镜(TEM)用Tecnai G2 F20(带能量色散谱探测器)测量。X射线光电子能谱(XPS)用Thermo ESCALAB 250XI光谱仪测量。

电化学测量

伏安测量用CHI 660E电化学工作站，三电极系统：Co₂P/ITO为工作电极，铂片(1 cm×1 cm)为对电极，3 M KCl饱和Ag/AgCl为参比电极，研究合成样品对H₂O₂电化学活性。磷酸盐缓冲液(PBS; 0.1 M, pH 7.4)作为电解质模拟人体生理环境。用循环伏安(CV)和安培法(I-t)研究Co₂P/ITO对H₂O₂检测性能。所有检测实验在室温100 rpm搅拌下进行。电化学阻抗测试用VersaSTAT 3F工作站，以铁氰化物溶液为电解质。

结果与讨论

Co₂P NPs表征

Co₂P NPs晶体结构经XRD确认。图1a显示160, 200, 240°C下12 h制备Co₂P样品XRD图谱。200°C样品在40.7°, 40.9°, 52.0°, 56.2°显示衍射峰，对应Co₂P斜方相(121)、(201)、(002)、(320)特征衍射面(JCPDS 32-0306)。温度从160°C升至200°C，衍射峰强度增强、峰变窄变尖，表明200°C产物结晶度更高。但240°C时生成杂质，29.7°衍射峰归属于Co(PO₃)₂(-222)衍射面(JCPDS 27-1120)。合成时间对200°C下Co₂P制备影响见附件Fig.S1。反应时间控制在12 h内时，Co₂P NPs(121)峰半高全宽最小，结晶度最好；反应时间6–24 h间无杂质。根据Scherrer公式，200°C、12 h制备Co₂P NPs晶粒尺寸计算为14.2 nm。

Co₂P NPs形貌经TEM评估。图1b显示200°C产物由直径10–20 nm不规则纳米颗粒组成，高分辨TEM(HRTEM)图像(图1b插图)清晰可见两组晶格条纹。相邻晶面间距0.22 nm，对应Co₂P(121)晶面，进一步确认形成TMP为Co₂P。

XPS技术分析Co₂P表面化学成分。附件Fig.S2显示Co₂P XPS全谱，检测到Co、P、O元素，确认Co₂P及部分氧化产物存在。Co₂P能量色散X射线谱(EDX)(附件Fig.S3)进一步确认样品中Co、P、O三元素共存。Co 2p和P 2p高分辨XPS谱见图1c, d。Co 2p谱中781.1 eV和797.6 eV峰分别归属Co²⁺ 2p₃/₂和Co²⁺ 2p₁/₂结合能(BE)[26,36]。786.0和803.1 eV为两个明显卫星峰。Co 2p BE 778.2 eV较金属Co(777.9 eV)正向偏移，表明Co₂P中Co带部分正电荷(δ⁺, 0<δ<2)[37]。相反，P 2p BE 129.4 eV较元素P(130.2 eV)负向偏移，P在Co₂P中带部分负电荷(δ⁻)。Co和P元素BE变化相对于其单质揭示Co₂P中电子密度从Co向P转移[38]。Co₂P表面氧化生成少量氧化P物种，因此高BE区133.2 eV峰归属氧化物[39]。

Co₂P/ITO电极电化学检测H₂O₂

为研究Co₂P NPs对H₂O₂还原电催化活性，通过滴铸Co₂P NPs悬浊液于裸ITO表面制备非酶H₂O₂电极。图2a显示裸ITO和Co₂P/ITO在0.1 M PBS(pH 7.4)中有无5.0 mM H₂O₂时CV曲线。虚线显示裸ITO对H₂O₂还原响应可忽略。但Co₂P/ITO电极在H₂O₂存在下于−0.5 V显示显著还原峰，证明Co₂P NPs对H₂O₂还原具有显著电催化活性。图2b展示Co₂P/ITO在2.5 mM H₂O₂下不同扫描速率(30–100 mV/s)CV曲线。扫描速率增加时还原峰电流增大、峰电位向负电位偏移，表明Co₂P/ITO上H₂O₂还原为不可逆反应。对应标定曲线(图2b插图)显示还原峰电流密度随扫描速率线性增加，提示Co₂P/ITO电极表面H₂O₂电化学还原为表面控制过程[40]。

图2c, d显示−0.5 V搅拌下Co₂P/ITO连续加入H₂O₂的安培响应和标定曲线。Co₂P/ITO对H₂O₂加入反应迅速，5 s内达稳态电流。图2d标定曲线显示传感器H₂O₂浓度多线性范围：0.001–1.0 mM、1.0–5.0 mM、5.0–10.0 mM。灵敏度随H₂O₂浓度增加而变化，因电极表面H₂O₂电催化还原动力学改变。据前文[10]，低浓度H₂O₂还原控速步骤为H₂O₂吸附，高浓度为H₂O₂活化，中间区两者共同控制[41]。高浓度下大量分析物吸附覆盖Co₂P活性位点导致灵敏度下降。

不同反应温度和时间制备Co₂P样品H₂O₂检测性能对比见附件Fig.S4, S5和Table S1，表明200°C、12 h样品性能最佳。温度升至240°C时生成Co(PO₃)₂杂质。为阐明Co(PO₃)₂对H₂O₂检测影响，研究其电化学性质。附件Fig.S6显示Co(PO₃)₂对H₂O₂电化学响应可忽略，导电性劣于Co₂P，降低安培测试电流信号。因此Co₂P样品高纯度和良好结晶度有助于提升传感性能。故选择200°C、12 h制备Co₂P为最佳H₂O₂敏感材料。标定I-t曲线在1.0–50 μM(生物体内H₂O₂生理浓度范围[28])也呈良好线性(Fig.S7)，有助于提高传感器实际应用可能性。此外，信噪比3时H₂O₂传感器检测限(LOD)计算为0.65 μM。相比前文报道H₂O₂传感器，Co₂P/ITO综合电化学性能在灵敏度、线性范围和LOD方面均更优(Table 1)。

反复检测1.0 mM H₂O₂ 35次后(Fig.3a, b)，分析Co₂P XPS Co 2p和P 2p区谱以探究传感机制。P 2p区峰位置检测前后无显著变化。但Co 2p谱中778.2和793.0 eV峰消失。778.2 eV峰指示Co₂P中存在还原Co物种[37]，其消失表明Co₂P中低价还原Co物种在检测过程中可能被H₂O₂氧化，尤其高浓度H₂O₂时。Co 2p区残留峰(782.1和798.3 eV)分别归属Co²⁺ 2p₃/₂和Co²⁺ 2p₁/₂，表明多次测量后Co₂P中仅存Co(II)物种。据前文钴基电催化剂H₂O₂检测报道[46,47,48]，Co²⁺物种为H₂O₂还原催化活性位点。通常H₂O₂电化学还原在PBS中经两步[49,50]：

H₂O₂ + e⁻ → OH_ad + OH⁻ (1)

OH_ad + e⁻ → OH⁻ (2)

2OH⁻ + 2H⁺ → 2H₂O (3)

第一步H₂O₂获电子生成吸附OH⁻(OH_ad)。中间体OH_ad获额外电子生成H₂O₂最终还原产物H₂O。因H₂O₂/H₂O氧化还原电位高于Co³⁺/Co²⁺，电子转移过程中Co₂P中Co(II)物种氧化为Co(III)，H₂O₂不可逆还原为H₂O。安培测试施加偏压−0.5 V vs Ag/AgCl(等于0.14 V vs NHE)，低于Co³⁺/Co²⁺标准氧化还原电位。结果氧化Co(III)还原为Co(II)，Co(II)催化活性位点再生。因此可得出结论：H₂O₂电化学检测中Co(II)物种催化循环发生，重复测量后低价还原Co物种被H₂O₂氧化。

Co₂P/ITO电极选择性、稳定性、重现性和重复性

抗干扰性能是生物传感器另一重要性质。用高纯氮气吹扫避免溶解氧影响，因氧在安培测试施加电位下可被还原[51]。对比Co₂P/ITO在0.1 M PBS有无氮吹扫CV曲线，2.5 mM H₂O₂还原电位和电流响应相似(Fig.S8)，表明溶解氧干扰可忽略。用体液中常见无机盐、糖类、氨基酸和还原性生物分子测试Co₂P/ITO选择性。图4a显示添加上述干扰物后电流响应与1.0 mM H₂O₂响应相比可忽略。因H₂O₂两个O原子可与一个或两个Co原子结合[52]，H₂O₂分子可特异性化学吸附于Co₂P中Co(II)物种。此外，检测过程施加负偏压显著降低真实生物样本中某些还原性化合物无差别氧化干扰[53]。因此Co₂P对H₂O₂良好选择性主要得益于Co(II)物种特异吸附位点和检测时负偏压。

此外评估Co₂P/ITO传感器稳定性、重现性和重复性。图4b显示50 μM H₂O₂中连续10次扫描CV阴极峰电流，10循环后峰电流仅下降2.7%。此外，电极空气存放一月后保留约98.2%初始电流响应(Fig.S9)，显示理想检测稳定性和优异长期耐久性。电极间重现性通过计算H₂O₂电流响应相对标准偏差(RSD)考察。为尽可能消除电极制备潜在误差，H₂O₂存在下稳态电流密度减去个别电极初始背景信号，差值视为各电极电化学响应。同条件制备六个Co₂P/ITO电极对照实验，电流响应RSD为1.24%(图4c)，表明Co₂P/ITO重现性优异。同时单电极重复检测1.0 mM H₂O₂八次，RSD达1.14%(图4d)。上述结果说明电极在非酶电化学H₂O₂检测中具有满意稳定性、重现性和重复性。

结论

总之，Co₂P NPs成功通过水热法合成。200°C、12 h制备Co₂P NPs被证明为pH 7.4 PBS中H₂O₂电化学还原高效催化剂。作为非酶H₂O₂传感器，Co₂P/ITO电极显示<5 s快速安培响应、0.001–10.0 mM宽线性范围、0.65 μM低检测限，以及满意选择性、重现性和稳定性。本工作旨在拓展过渡金属磷化物在小分子生物分子电化学检测应用研究，Co₂P/ITO传感器可设计为新型非酶H₂O₂检测平台。