通过 ESAT-6 抗原-抗体复合物对结核病进行灵敏比色检测的红色光谱偏移：一种金纳米颗粒的新策略

背景

结核病 (TB) 是由结核分枝杆菌引起的 ，这是导致人类死亡的主要疾病之一，最初，它会攻击肺部。因此，它会扩散到身体的其他部位，例如肾脏、脊柱和大脑，并在免疫力降低时变得更加严重。为了通过预防措施挽救人们，必须在潜伏期识别和治疗结核病。在此阶段，患者已被M.感染。结核病;然而，病原体并不活跃。有多种方法可用于检测潜伏期结核病，包括结核病皮试和伽马干扰素试验。在大多数情况下，单靠结核皮试无法检测出活动性结核感染，需要通过其他辅助检查，如胸片、痰细胞学、痰培养等进行确诊[1]。但是这些测试需要更严格的实验室步骤，并且需要几个月的时间才能完成；因此，开发一种更简单有效的方法来早期检测结核病势在必行。

基于金纳米颗粒 (GNP) 的比色分析因其独特的物理和化学特性而在生物传感器领域受到极大关注，例如在可见光波长下具有较高的消光系数和可变的表面等离子体共振。单分散 GNP 溶液显示出高消光系数并显示可见光区域的光谱。如果 GNPs 之间有适当的空间，它们将呈现红色溶液，当它们在二价离子的可用条件下聚集时会变成蓝色 [2]。在适当的离子存在下，GNPs 之间的空间将被填充，达到聚集阶段，并显示向可见波长的光谱偏移，称为“红移”。通过利用这种光谱偏移，已经产生了许多比色分析来检测疾病，例如 HIV 和流感 [3, 4]。这类检测依赖于单链寡核苷酸序列，适体已被广泛用作检测目标的合适分子 [5, 6]。单链 DNA 或 RNA 序列可以通过 DNA 碱基中的金和氮原子之间的配位结合到 GNP 的表面 [7,8,9]。用寡核苷酸修饰的 GNP 在高盐条件下是稳定的。当分析物可用时，寡核苷酸将与金分离并在二价离子存在下聚集，然后显示蓝色溶液。所证明的 GNP 检测更便宜，检测时间更短，更容易功能化，并显示出具有良好灵敏度的视觉检测 [10,11,12,13,14]。由于这些积极的态度，基于 GNP 的比色分析已扩展到检测更小的分子，包括 DNA、RNA、蛋白质、全细胞和金属离子。通过使用基于 GNP 的简化适配体比色分析，几种适配体可用于检测这些分析物，显示红色光谱偏移 [15,16,17,18,19]。

尽管使用适体、DNA 或 RNA 进行比色测定已得到充分证明，但它们在某些情况下也会产生负面影响，因为它们的性能较差，序列较长，并且探针和目标交互分析失败 [20,21,22]。这可能是由于生物分子上的较高电荷与 GNP 表面产生更强的静电相互作用，最终使目标分子无法在 GNP 表面释放附着的探针分子。为了克服这一障碍，我们在这里引入了一种基于单步抗体的比色法来检测 ESAT-6 蛋白。 ESAT-6 蛋白是早期分泌蛋白，被确定为结核病的重要抗原 [23,24,25]。在早期诊断 ESAT-6 蛋白，必须治疗疾病并避免传播。图 1a、b 说明了使用基于 GNP 的比色红色光谱位移测定法通过其抗体检测 ESAT-6 的策略。以下是该检测方法所涉及的步骤：(i) 将抗 ESAT-6 多克隆抗体与 ESAT-6/CFP-10 抗原预混合，(ii) 将 GNP 添加到该溶液中，(iii) NaCl添加，和 (iv) 通过紫外光谱进行视觉检测和红色光谱位移分析。通过这些步骤，我们进行了关键分析，以阐明 GNP 与复合蛋白质之间基于电荷的相互作用，并得出了预混合抗体-抗原用于比色测定的适用性。对于对照实验，使用培养物滤液 protein-10 (CFB-10) 代替 ESAT-6（图 1）。

通过单步预复合抗体比色法检测 ESAT-6 的示意图。 一 抗 ESAT-6 抗体预复合 ESAT-6 的策略。 b 抗ESAT-6抗体预复合CFP-10的策略（对照实验）

方法

试剂和生物分子

早期分泌抗原靶标 (ESAT-6) 和 10 kDa 培养滤液蛋白 (CFP-10) 购自 Sino Biological Inc.（中国北京）。 Anti-ESAT-6 购自 Santa Cruz Biotechnology（美国）。直径为 15 nm 的金纳米颗粒购自 Sigma Aldrich（美国）。整个实验使用RO去离子系统（18.3 MΩ·cm SASTEC (M) Sdn. Bhd）生产的去离子水。

优化二价离子聚合 GNP

为了在当前研究中检测 ESAT-6，使用二价离子 (NaCl) 来可视化 GNP 的聚集。为了优化 NaCl 的合适条件，将不同浓度（终浓度为 50 至 800 mM）添加到恒定体积 (20 μl) 的 GNP [一个光密度 (O.D.)]。 15 分钟后，使用 SONY 数码相机拍摄颜色变化。纳米光度计监测了这些变化引起的光谱位移。

GNP 表面的 ESAT-6 生物污垢：特异性验证

为了验证 ESAT-6 在 GNP 表面的非特异性（生物污染）结合，将不同浓度（最终浓度为 1.5 至 100 nM）添加到 20 μl GNP。 30 分钟后，将最佳浓度的 NaCl 添加到每个管中，然后按照上述实验观察颜色变化和光谱变化。同样，也用CFP-10测试了生物污垢。

GNP 表面强制抗 ESAT-6 抗体浓度的优化

为了优化评估当前实验所需的抗 ESAT-6 抗体浓度，将不同浓度的抗 ESAT-6 抗体（最终浓度为 30 至 500 nM）与 20 μl GNP 独立混合。孵育 30 分钟后，向每个管中加入最佳体积的 NaCl，拍照，15 分钟后观察光谱变化。

通过基于抗体的比色红色光谱偏移检测 ESAT-6

为了通过基于抗体的比色红移光谱变化开发 ESAT-6 的比色检测，最初将 1 μl 1 μM ESAT-6（最终体积为 500 nM）与 1 μl 最佳抗 ESAT-6 抗体浓度混合.孵育 30 分钟后，将 20 微升 GNP 添加到每个管中，然后等待 30 分钟。然后，加入最佳 NaCl 浓度，并在 400 至 800 nm 的波长下测量光谱变化。类似地，用相同的优化抗 ESAT-6 抗体浓度滴定其他浓度的 ESAT-6（0 至 500 nM）。为了检查检测限，从最低皮摩尔（从 1.25 pM）到纳摩尔（500 nM）顺序测试了 ESAT-6。其他分子（抗ESAT-6抗体、GNP和NaCl）的浓度保持恒定。

结果与讨论

基于抗体的比色测定显示光谱变化为红移，此处遵循以检测 ESAT-6。图 1a 显示了基于单步抗体的比色测定的示意图；在 ESAT-6 存在的情况下，在高浓度的二价离子 NaCl 下失去 GNP 的稳定性后，GNP 溶液的颜色变化预计为蓝色，光谱发生红色偏移，而在没有 ESAT-6 的情况下，由于抗 ESAT-6 抗体附着在 GNP 表面，GNP 是稳定的，即使在高浓度 NaCl 下也能保持其原始红色。该策略通过使用针对抗 ESAT-6 抗体的非特异性 CFP-10 得到证实，它应该显示红色 GNP 溶液（图 1b）。由于 CFB-10 也是导致结核病的主要蛋白质，因此我们在此用作对照蛋白质 [26]。一般来说，对于这种基于 GNP 的检测，13 到 15 nm 大小的 GNP 非常适合达到更高的灵敏度 [27]，而增加 GNP 大小不适合达到良好的检测限。这是由于 GNP 越来越大的原因需要更多的抗体来结合 GNP 表面。如果更多的抗体结合在表面上，则会导致假阴性结果。在这里，我们希望使用 15 nm GNP 并获得亚皮摩尔水平的最大灵敏度。

控制 GNP 聚合的二价离子优化

对于此检测优化，我们使用 NaCl 来聚合 GNP。如图 2 所示，当我们筛选出所需的 NaCl 浓度时，将不同浓度的 NaCl 添加到 GNP 中，溶液的颜色开始呈现蓝色，表明与 100 mM NaCl 发生聚集。而且从光谱中可以清楚地看出，只有聚集的 GNP（NaCl 浓度从 100 到 800 mM），在波长 ~ 600 nm 处发生红移，而分散的 GNP（NaCl 浓度从 0 到 50 mM) 仍将其光谱保持在 ~ 500 nm。然而，50 mM NaCl 的峰值光谱变化微不足道。从这些结果可以得出结论，我们需要至少 100 mM NaCl 来聚合 GNP，但为了获得更高的灵敏度，我们使用更高浓度 (800 mM) 的 NaCl 进行进一步实验。以前，Gopinath 等人显示了用于 GNP 聚集的类似 NaCl 范围。 [10].

二价离子的优化。 0 到 800 mM 的 NaCl 与恒定的 GNP (1 O.D.) 混合。 15 分钟后，以 400 到 800 nm 的波长进行扫描。照片由数码相机拍摄，如图插图所示。光谱和颜色变化通过 GNP 与 100 mM NaCl 的聚集来指示。峰用各自的彩色球体表示

用于 GNP 分散的 ESAT-6 抗体优化

在NaCl优化之后，接下来，我们确定了抗ESAT-6抗体的合适浓度来进行实验。由于灵敏度高度依赖于抗体浓度，因此需要合适的抗 ESAT-6 抗体浓度以诱导 GNP 分散。背后的概念是，如果需要最小的抗体浓度，它可以很容易地在添加目标后复合，并且 GNP 上没有游离分子，而如果有几种抗体可用，当我们尝试检测低浓度的ESAT-6，仅复合少量抗体。然后，剩余的抗体结合在 GNP 表面并诱导 GNP 的稳定性，从而导致灵敏度降低。抗体的 IgG 具有较高的分子量（~ 150 kDa），使得游离抗体通过 GNP 表面的表面末端阴离子基团之间的静电相互作用或离子/氢键很容易与 GNP 表面结合 [28]。由于较高的分子量，抗体的数量较少，在这里，它与 6 kDa 分子量的 ESAT-6 平衡，即使在较低的浓度下也有更多的分子。如图 3a 所示，我们首先从最低浓度的抗 ESAT-6 抗体 (30 nM) 开始，然后增加到 GNP 的最大浓度 (500 nM)。结果表明，即使使用 800 mM NaCl，30 nM 具有 GNP 的抗 ESAT-6 抗体也处于聚集状态，因为 GNP 表面上没有足够的抗体可用，但是从 60 nM 的抗 ESAT-6 抗体中，由于结合在 GNP 表面上的抗 ESAT-6 抗体数量足够，溶液保持其红色。在测试最大浓度 (500 nM) 之前，GNP 颜色保持红色，具有高稳定性。在确定合适的抗体浓度为 60 nM 后，为了检查抗 ESAT-6 抗体和 GNP 偶联物的稳定性，我们尝试增加 NaCl 浓度。如图 3b 所示，即使添加 1 M NaCl，制备的抗体 GNP 偶联物（60 nM 抗体与 GNP）也非常稳定。图 3c 中的光谱也显示了与视觉检测相同的结果；制备的抗 ESAT-6 抗体 GNP 偶联物即使在高浓度 NaCl 的情况下也保持在 ~ 520 处的峰值，同时，只有 GNP 与 800 mM NaCl 聚集，峰值最大值在 ~ 500 nm。

ESAT-6 抗体优化和稳定性。使用 800 mM NaCl 测试了不同浓度的抗 ESAT-6 抗体。 一 GNP 与抗 ESAT-6 抗体（0 至 500 nM）的聚集或分散；箭头表示最佳抗体浓度的过渡区域。 b 60 nM 抗体与不同 NaCl 浓度（0.012 至 1000 mM）复合 GNP 的稳定性。 c 不同配合物的光谱。峰用各自的彩色球体表示

ESAT-6 检测使用预复合抗体通过比色红色光谱偏移和 ESAT-6 生物污垢的验证

由于来自 60 nM 的抗体显示出极好的稳定性，最初，我们尝试检测与 60 nM 抗 ESAT-6 抗体复合的 ESAT-6。 ESAT-6 是分子量较小的蛋白质，大小为 6 kDa，非常适合基于比色的测定。在进行检测实验之前，我们检查了 GNP 表面上 ESAT-6 的生物污垢；由于 ESAT-6 有可能与 GNP 结合，可能导致假阳性或假阴性。如图 4 所示，在浓度为 100 nM 的 ESAT-6 中，GNP 在 800 mM NaCl 下不稳定，表明 ESAT-6 不会静电结合到 GNP 表面。这种无污染还暗示 ESAT-6 的氨基酸组成在该测定中发挥着重要作用。在此确认后，我们检测到 ESAT-6 与 60 nM 的抗 ESAT-6 抗体预复合。不同浓度的 ESAT-6 与恒定浓度 (60 nM) 的抗体复合，然后加入 GNP。最后，添加 800 mM NaCl 以评估具有红色光谱偏移的聚集。如图 5a（插图）所示，与对照（只有 60 nM 抗体）相比，从 0.5 nM 到 500 nM 的 ESAT-6 检测证实了明显的颜色变化和转变。即使在 0.5 nM 时，溶液的颜色也从红色变为蓝色，并在 15 nM 时更加强烈，这可能是由于 ESAT-6 完全饱和。即使在 0.5 nM 时，似乎也没有抗体与 GNP 结合。参考图 5a 的图形表示，15 到 500 nM 的 ESAT-6 显示完全饱和。从图 5b 清楚地证明，对照实验（无 ESAT-6 蛋白）的光谱在~ 500 nm 处表现出良好的分布，而使用 0.5 和 500 nM 的 ESAT-6，光谱发生红移。从这些结果可以得出结论，我们可以从 0.5 nM 检测到 ESAT-6 蛋白，并且由于明显的蓝色外观，仍然可以检测到较低的浓度。

测试 GNP 表面的 ESAT-6 污垢。将不同浓度的 ESAT-6 与 GNP 混合，30 分钟后，加入 800 mM NaCl。还显示了图示。出现蓝色表示聚集

较高浓度下的 ESAT-6 检测。 一 用于检测 ESAT-6 的图形表示。将不同浓度的 ESAT-6 与 60 nM 的抗体混合，孵育 30 分钟后，加入 GNP。然后加入 800 mM NaCl 以诱导颜色变化。检测到 0.5 nM 的 ESAT-6 具有清晰的颜色变化（红色到蓝色）。照片由数码相机拍摄，如图插图所示。 b 400 到 800 nm 波长处的光谱变化。峰用各自的彩色球体表示

比色红色光谱偏移对 ESAT-6 的检测极限

由于 60 nM 的抗 ESAT-6 抗体对 ESAT-6 的检测显示出明显的改善，为了找出检测限，我们将 ESAT-6 进一步微调至最低皮摩尔（1.25 pM 至 5000 pM ）。如图 6a 所示，从 ESAT-6 的 1.25 pM 开始，由于 ESAT-6 和抗体之间形成复合物，蓝色开始。从 2.5 pM 开始，已变为蓝色的溶液颜色变深，并随着浓度的增加保留了颜色变化。在对照实验（没有 ESAT-6）中，溶液的颜色呈红色，支持当前实验的特异性（图 6a）。该结果也由图 6b 中所示的光谱证实。对于对照溶液，光谱没有变化，但从 1.25 到 5 nM 的 ESAT-6 蛋白，光谱向 600 nm 红移。在 ESAT-6 的 5 nM 处，观察到具有峰值最大值的完整光谱偏移。基于这些实验结果，我们可以得出结论，使用抗体 ESAT-6 前复合物对 ESAT-6 的检测限约为最低皮摩尔 (1.25 pM)。

基于抗体的比色法对 ESAT-6 的检测限。 一 用于检测 ESAT-6 的图形表示。将不同浓度的 ESAT-6 与 60 nM 的抗体混合，孵育 30 分钟后，加入 GNP。然后，添加 800 mM NaCl 以诱导颜色变化。 ESAT-6 蛋白从 1.25 pM 滴定到 5000 pM。照片由数码相机拍摄，如图插图所示。 b 400 到 800 nm 波长处的光谱变化。峰用各自的彩色球体表示

具有特异性的微调

由于我们可以用 60 nM 的抗 ESAT-6 抗体检测 ESAT-6，接下来，我们尝试使用高浓度的抗 ESAT-6 抗体进行相同的检测，达到 75 nM。获得的结果在图 7a 中。已经发现在 850 pM ESAT-6 下使用 75 nM 预复合抗体会发生轻微的颜色变化。我们将 ESAT-6 浓度增加到 100 nM，我们可以观察到颜色变为蓝色的过程。通过这些实验，注意到使用 75 nM 预复合抗体的检测限在纳摩尔范围内。最后，为了确认 ESAT-6 结合的特异性，我们还使用来自 M. 的抗 ESAT-6 和 CFP-10 蛋白的预复合物测试了类似的测定。结核病 .结果清楚地看到，只有 ESAT-6 具有特异性，而 CFP-10 可以是合适的对照（图 7b）。综上所述，从以上结果可以看出，优化抗体浓度是提高比色法灵敏度的必要条件。

使用 75 nM 抗 ESAT-6 抗体检测 ESAT-6。 一 表示颜色变化。将不同浓度的 ESAT-6 与 75 nM 抗体混合，孵育 30 分钟后，加入 GNP。然后，添加 800 mM NaCl 以诱导颜色变化。检测到 0.85 nM 的 ESAT-6 具有清晰的颜色变化（红色到蓝色）。照片是用数码相机拍摄的。 b 400 到 800 nm 波长处的光谱变化。峰用各自的彩色球体表示。使用CFP-10进行特异性测定，显示为阴性对照

结论

结核病 (TB) 是一种威胁人类生命的主要疾病，早期发现结核病可以防止传播和治疗疾病。在这项研究中，我们选择了一种早期分泌抗原靶点 (ESAT-6)，这是 TB 中的主要蛋白质之一。我们引入了使用金纳米颗粒的基于单步抗体的比色红色光谱位移测定法，发现检测限为 1.25 pM。通过使用对照蛋白 (CFP-10) 阐明了该测定的特异性，并且在添加 GNP 后不显示颜色变化。另一方面，仅 ESAT-6 与 GNP 无关。有了这个证据，预先复合的 ESAT-6 和抗 ESAT-6 抗体的存在就证明了比色红色光谱位移测定的可靠性。该策略简单快捷，只需一步即可检测相似种类的分析物。此外，该检测可以通过与适当抗体复合的小分子进行扩展，以适用于即时检测。这种方法肯定适用于较小尺寸的蛋白质和肽。对于较大尺寸的蛋白质，根据氨基酸电荷的不同，可能会发生变化。

缩写

CFP-10：

10 kDa 培养滤液蛋白

DNA：

脱氧核糖核酸

ESAT-6：

6 kDa 早期分泌抗原靶点

国民生产总值：

金纳米粒子

NaCl：

氯化钠

外径：

一光密度

RNA：

核糖核酸

结核病：

结核病

紫外线：

紫外线