pH 响应铁蛋白纳米载体实现白藜芦醇可控递送靶向肿瘤化疗

摘要

本研究构建了基于铁蛋白 (Ft) 的 pH 诱导可逆组装系统 (PIRAS)，用于靶向肿瘤治疗。利用铁蛋白天然的 pH 敏感性与独特空心腔腔，实现抗癌药物白藜芦醇 (RV) 的高效装载与释放。在 RV 负载铁蛋白 (RV@Ft) 表面偶联肿瘤靶向肽 Arg-Gly-Asp (RGD)，形成生物相容性纳米颗粒 (RV@Ft-RGD)。铁蛋白在酸性条件下解离为中空多孔纳米球，中性条件下重组为密封中空纳米球。通过 pH 调控，RV@Ft-RGD (粒径 ~21 nm) 实现 79.6% 的高 RV 装载率。pH 触发释放实验显示：pH 5.0 下 24 小时释放率 50.3%；中性条件下 20 天极其稳定。共聚焦荧光成像显示 RV@Ft-RGD 细胞摄取率高，与溶酶体高度共定位，得益于 RGD 介导的靶向效应。凭借高药物负载、pH 触发释放与肿瘤细胞靶向，RV@Ft-RGD 体现优异的体内外杀瘤能力，生物相容性良好，无系统毒性。基于铁蛋白的 PIRAS 设计理念显著抑制肿瘤生长，拓宽了铁蛋白在纳米医学中的应用。

引言

肺癌是人类最致命的实体恶性肿瘤之一。环境恶化等因素导致发病率逐年上升，5 年生存率仅 17.4%。传统手术、放疗、一线化疗手段虽可用，但中位总生存率仍待提升，亟需开发更有效、更安全的疗法。许多化疗药物因靶向性低、副作用大而受限，纳米药物领域不断涌现新药。白藜芦醇 (RV) 为葡萄、大豆等植物提取物，临床用于促进血小板聚集、抑制血管舒张、降低血粘度等；近年发现其抗癌作用显著。但作为小分子药物，RV 存在溶解度差、血液半衰期短、缺乏肿瘤选择性等缺陷。RV 基纳米药物旨在克服这些不足。各类纳米载体 (脂质体、血清白蛋白、碳材料、二维过渡金属硫化物等) 均有报道，但仍存缺陷：脂质体/白蛋白缺乏高效主动触发释放能力；碳材料/二维材料潜在长期全身毒性。因此仍需更优纳米载体。

铁蛋白是天然纳米笼蛋白，由 24 个重/轻链亚基组装而成，内腔约 8 nm。作为内源性蛋白，铁蛋白生物相容性与安全性极佳。研究表明铁蛋白天然具有 pH 敏感性：酸性环境下可逆解离为中空多孔球，碱性环境下重组为密封中空球。这种独特的 pH 触发组装/解离行为使其成为理想药物递送系统。Zhang 等报道多柔比星 (DOX) 可包裹在铁蛋白中并通过 pH 调控释放用于肿瘤治疗。

本研究旨在开发基于铁蛋白的 pH 诱导可逆组装系统 (PIRAS)，实现 RV 的可控装载释放，强化肿瘤靶向化疗。铁蛋白球面偶联肿瘤靶向肽 RGD，制得纳米药物 RV@Ft-RGD。其在中性/碱性环境 (pH>7.4) 稳定，仅在酸性环境 (pH<7.4) 释放 RV。深入表征显示 RV@Ft-RGD 具备：(1) 靶向肿瘤细胞并积聚于溶酶体 (酸性环境)，促进 RV 释放入胞质；(2) 铁蛋白载体显著延长游离 RV 血液半衰期，提高体循环药物滞留，促进肿瘤部位药物聚集；(3) 铁蛋白结构稳定性防止递送过程中的 RV 爆发性泄漏；(4) 优异的体内外生物相容性。基于这些优势，RV@Ft-RGD 展现卓越抗肿瘤治疗效果，极具临床转化潜力。

材料与方法

材料

铁蛋白、白藜芦醇 (RV, ≥99%) 购自 Sigma-Aldrich。EDC、NHS、FITC 购自 Aladdin (上海)。NH₂-PEG₂₀₀₀-RGD 购自湖南华腾医药 (湖南)。DMEM 培养基、胎牛血清 (FBS)、PBS 购自 Invitrogen (美国)。CCK-8 试剂盒购自 Dojindo (日本)。

RV@Ft-RGD 合成

参考文献 [21, 28] 并修改。首先将 NH₂-PEG₂₀₀₀-RGD (10 mg) 分散于 Ft 溶液 (1.5 mg/mL) 中，加入 20 μL EDC (5 mg/mL) 和 20 μL NHS (20 mg/mL)，4 °C 搅拌反应 2 小时，透析纯化 (MWCO 5 kDa) 过夜得 Ft-RGD 纳米颗粒。将水不溶性 RV 溶于 DMSO 配成 2 mg/mL，加入 Ft-RGD 溶液 (终浓度 1.5 mg/mL)。将混合液 pH 调至 5 解离多肽亚基，再用 1 M NaOH 缓慢调至 pH 7.4 重组亚基。蒸馏水透析过夜除去游离 RV，得终产物 RV@Ft-RGD。通过 UV-vis 分光光度计 (UV3100, Shimadzu) 监测 306 nm 吸收峰测定装载量。装载率 = (Aa - Ab)/Ac，其中 Aa、Ab、Ac 分别为初始 RV、未装载 RV 与 Ft-RGD 重量。

表征

动态光散射 (DLS, BI-9000AT, Brookhaven) 测粒径与 zeta 电位。透射电镜 (TEM, JEM-100S, JEOL) 观察形貌。荧光光谱：Perkin-Elmer LS50B。细胞荧光信号：LSM 510 激光扫描显微镜 (Zeiss) 与 FCM (EPICS XL, Beckman)。

RV 释放研究

500 μL RV@Ft-RGD 溶液置于 D-tube (MWCO 6–8 kDa, Novagen)，用不同缓冲液调节 pH，37 °C 透析。不同时间取 1 mL 外渗液替换等量新鲜培养基，UV-vis 测定释放量。此外，将 RV@Ft-RGD 溶于不同 pH (5, 6.5, 7.4, 8.5) 冲洗液中，37 °C 孵育 24 小时后用 DLS 表征粒径变化。

细胞培养

人肺癌细胞 A549、NCI-H358 来自中科院上海细胞库，DMEM+10% FBS+1% 青霉素链霉素，5% CO₂、37 °C 培养。

细胞摄取与定位

FITC 标记纳米颗粒：FITC 乙醇溶液 (2.0 mg/mL) 与 RV@Ft 和 RV@Ft-RGD 水溶液 (1.0 mg/mL) 暗室搅拌 4 小时，透析除去多余 FITC/乙醇。溶酶体特异性染料 Lyso Tracker Red (Invitrogen) 染色经 FITC 标记 RV@Ft 和 RV@Ft-RGD 处理 5 小时的细胞，CLSM 观察内化情况。简述：A549 细胞与 FITC 标记 RV@Ft 和 RV@Ft-RGD (相同 FITC 浓度) 共孵育 5 小时，再用 Lyso Tracker Red (100 nM) 染色 30 分钟，PBS 洗涤 3 次，激光扫描显微镜观察。ImageJ 分析荧光强度。

体外肿瘤化疗与凋亡研究

CCK-8 法评价 Ft-RGD 载体细胞毒性。A549、NCI-H358 (1×10⁵ cells/mL, 0.5 mL) 接种 96 孔板 24 小时，更换含 0、0.01、0.1、0.5、1 mg/mL Ft-RGD 的新鲜培养基孵育 24 小时，PBS 洗涤 3 次，加入 100 μL CCK-8 工作液 (10% CCK-8+90% DMEM) 孵育 30 分钟，450 nm 测吸光度。光学显微镜观察细胞形态。

游离 RV、RV@Ft、RV@Ft-RGD、RV@Ft-RGD+RGD 预处理 (0、10、20、30、40 μg/mL RV 当量) 处理 A549 细胞 24 小时，CCK-8 测活力；Annexin V-FITC/PI 双染配合 FCM 分析凋亡。

血液循环时间

游离 RV 或 RV@Ft-RGD (6 mg/kg RV 当量) 尾静脉注射健康 Balb/c 裸鼠 (n=5/组)。不同时间点取静脉血，肝素抗凝离心得血浆，酸化异丙醇提取 RV，306 nm 激发吸光度测浓度。

动物模型与体内肿瘤化疗

Balb/c 小鼠 (4–6 周) 购自 Charles River (北京)。动物实验遵照郑州大学实验动物护理使用委员会批准指南。皮下注射 2×10⁶ A549 细胞建立移植瘤模型，7–9 天后分组。肿瘤体积 = 长 × 宽²/2。

移植瘤小鼠随机分 5 组 (各 5 只)：对照 (生理盐水)、RV、RV@Ft、RV@Ft-RGD+RGD、RV@Ft-RGD。治疗开始连续 3 天每日 1 次尾静脉注射。每 5 天记录肿瘤体积与体重。45 天后收集肿瘤组织，10% 甲醛固定、切片、H&E 染色。

体内生物相容性

200 μL RV@Ft-RGD 尾静脉注射健康 Balb/c 小鼠 (RV 剂量 15 mg/kg)。同法生理盐水注射作为空白对照。第 0、10、45 天采血检测全血细胞计数 (WBC、RBC、HGB、MPV、MCH、HCT、MCV、PLT、MCHC)。第 45 天取心、肝、脾、肺、肾组织 H&E 染色。

统计分析

数据呈现为均值±标准差。Student's t 检验，p<0.05 为显著差异。

结果与讨论

RV@Ft-RGD 合成与表征

RV 装载释放基于铁蛋白 pH 诱导可逆解离/重组 (图 1)。先将铁蛋白与 RGD 偶联得 Ft-RGD，醋酸缓冲液 (pH=5) 中解离为中空多孔球，加入 RV 使其进入腔腔，缓慢调 pH 至 ~7.4 重组封存 RV。缓冲液 pH 降至 ~5 时纳米颗粒孔洞可逆打开释放 RV。图 2a 和补充图 S1 SEM/TEM 显示 RV@Ft-RGD 呈球形。DLS 分析：RV@Ft-RGD 粒径 ~22.5 nm，大于原始 Ft (~11.8 nm) (图 2b)；zeta 电位相近 (~ -29.6 mV) (图 2c)。20 天内水、FBS、细胞培养基、PBS 中 PDI 无显著变化 (图 2d)，表明胶体稳定性极佳。图 2e 吸收光谱：RV@Ft-RGD 相对游离 RV 和 Ft-RGD 在 306 nm 出现新峰 (RV 特征)，证实装载成功。325 nm 激发下 RV@Ft-RGD 与游离 RV 均在 400 nm 处显示强发射荧光 (图 2f)。

药物装载与释放

Ft-RGD 最大装载量达 252.6%，得益于巨大空心腔腔。利用铁蛋白 pH 敏感性考察不同 pH 下装载效率。图 3a 显示 pH 从 5.0 升至 8.5 时装载效率急剧下降。不同 pH (5.0–8.5) 下释放曲线构建 pH/时间依赖释放谱 (图 3b)。pH 5.0 下 24 小时最大释放率 51.6%，高于 pH 6.5、7.4、8.5。相关报道：pH 5.0、6.5、7.4 分别对应细胞溶酶体、肿瘤组织、血液/正常生理环境。生理条件 (pH 7.4) 下 50 小时 RV 含量保持高位 (图 3c)，表明 RV@Ft-RGD 稳定不易泄漏。不同 pH 下孵育 12 小时后 DLS 粒径变化 (图 3d)：pH 8.5 和 7.4 稳定 ~23 nm；pH 6.5 和 5.0 分别增至 25 nm 和 28.6 nm。这证实了 pH 诱导可逆解离/重组行为，利于体外可控装载与肿瘤组织释放。

体外细胞摄取与定位

FITC 通过氢键/物理吸附标记 RV@Ft 和 RV@Ft-RGD。图 4a：游离 FITC 组细胞质荧光极弱；RV@Ft-RGD 组显示强烈 FITC 绿色荧光，高于 RV@Ft 组；RV@Ft-RGD+RGD 预处理组荧光降低。结论：RV@Ft-RGD 经 RGD 介导主动靶向高效摄取。FCM 结果 (图 4b) 统计荧光强度得出相同结论。溶酶体特异性染料 Lyso Tracker Red 染色 (图 4a) 显示所有组细胞质红色荧光强；合并后 RV@Ft-RGD 组黄色荧光 (绿+红) 最强。统计分析 (图 4c) 显示 RV@Ft-RGD 组 FITC 与 Lyso Tracker Red 共定位系数最高。表明 RV@Ft-RGD 主动进入细胞并转运至溶酶体 (pH≈5.0)，结合 pH 响应释放，赋予体内肿瘤治疗巨大潜力。

体外生物相容性与肿瘤治疗

先考察 Ft-RGD 载体细胞毒性。图 5a 和补充图 S2、S3：Ft-RGD 对 A549、NCI-H358 细胞在 1 mg/mL 以下无明显活力抑制；1 mg/mL 处理组细胞形态与对照组无异 (图 5b)，证实载体生物相容性优异。图 6a, b：游离 RV、RV@Ft、RV@Ft-RGD 均呈浓度依赖性杀伤细胞。40 μg/mL 下 RV@Ft-RGD 组细胞活力仅 11.2%，低于 RV@Ft 和 RV@Ft-RGD+RGD 预处理组。FCM 初步研究 (图 6c) 显示三种处理主要通过凋亡诱导细胞死亡。结果表明：RV 装载入 Ft-RGD 后杀瘤效应大幅增强，主要归因于 RV@Ft-RGD 在溶酶体大量积聚，酸性 pH 触发更多促凋亡 RV 释放入胞质。

RV@Ft-RGD 血液半衰期

注射后不同时间点测血浆 RV 浓度。图 7a：RV@Ft-RGD 血液半衰期 5.1±0.23 h；游离 RV 仅 0.43±0.11 h，快速清除。显著延长的半衰期有利于提高体循环药物滞留，促进肿瘤部位药物聚集。

体内抗肿瘤效果与全身毒性

图 7b 相对肿瘤体积显示：RV@Ft 组一定程度抑制肿瘤 (因摄取低)；RV@Ft-RGD 组显著优于对照、RV、RV@Ft、RV@Ft-RGD+RGD 组。治疗期间各组体重无显著下降 (图 7c)，表明生物安全性高。治疗结束 H&E 染色 (图 7d)：RV@Ft-RGD 组肿瘤大面积凋亡，对照、RV、RV@Ft、RV@Ft-RGD+RGD 组仅少量凋亡。正常小鼠全身毒性评价：第 0、10、45 天采血全血细胞计数 (图 8a, b)，RV@Ft-RGD 组 WBC、RBC、HGB、MPV、MCH、HCT、MCV、PLT、MCHC 与第 0 天无显著差异。第 45 天主要器官 H&E 染色 (图 8c) 无明显病理改变，提示无长期不良毒性。所有结果证明 RV@Ft-RGD 在体内增强癌症化疗的巨大潜力。

结论

成功开发了具有 pH 可控装载释放抗肿瘤药物 RV 的 PIRAS 系统，用于增强肿瘤靶向化疗。酸性 (pH=5.0) 条件下系统解离装载/释放 RV，中性 (pH=7.4) 下 RV@Ft-RGD 高度稳定、药物泄漏极少。RGD 介导靶向效应使 RV@Ft-RGD 高浓度被 A549 细胞摄取并积聚于溶酶体，利于体内外 RV 释放。溶酶体酸性 pH 触发 RV 释放入胞质，使 RV@Ft-RGD 相比游离 RV 展现卓越杀瘤与促凋亡效果。RV 装载后 RV@Ft-RGD 血液半衰期大幅延长。体内结果证实 RV@Ft-RGD 显著抑制肿瘤且无明显全身毒性。研究表明基于铁蛋白的 PIRAS 在药物装载释放与增强抗癌治疗方面极为高效。

数据与材料可用性

本文结论基于的所有数据均呈现于文中。

缩略语

BSA:

牛血清白蛋白

CCK-8:

细胞计数试剂盒-8

DLS:

动态光散射

EDC:

1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺

FBS:

胎牛血清

FITC:

荧光素异硫氰酸酯

Ft:

铁蛋白

HCT:

红细胞压积

HGB:

血红蛋白

MCH:

平均红细胞血红蛋白含量

MCHC:

平均红细胞血红蛋白浓度

MCV:

平均红细胞体积

MPV:

平均血小板体积

NHS:

N-羟基琥珀酰亚胺

PIRAS:

pH 诱导可逆组装系统

PLT:

血小板

RBC:

红细胞

RGD:

精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸

RV:

白藜芦醇

WBC:

白细胞