用于提高溶解度的蝌蚪形和球形血红素纳米颗粒的制备和表征

介绍

铁是人体代谢过程中必不可少的元素，例如电子转移、储存和氧气运输 [1]。缺铁是最常见的营养缺乏症之一，影响着世界上大约 20% 的人口 [2]。缺铁最不利的后果是缺铁性贫血。它主要是由于膳食铁摄入量不足引起的，通常是在需求量很高的时候。在人类中，膳食铁可以以两种主要形式进入人体：一种是无机铁（非血红素铁），主要从蔬菜和植物性食物中释放出来，另一种是血红素铁，从体内存在的血红蛋白或肌红蛋白的分解中获得。动物。在血液和肉制品中发现了血红素，是许多血红蛋白（包括肌红蛋白、血红蛋白和细胞色素 b 和 c）的一种成分，比非血红素铁更容易吸收 2 或 3 倍 (50–87%) [3] .最近，研究人员见证了我们对血红素生理作用的理解的重大进展。不幸的是，由于存在大的四吡咯大环，血红素是疏水的 [4]。由于氯化血红素在中性水溶液中疏水性高、溶解性差，限制了其在各个领域的应用。因此，迫切需要提高氯化血红素的溶解度。

为了应对这一挑战，许多努力致力于提高血红素的溶解度。 Berner [5] 发现部分酶溶液蛋白（大豆分离物、大豆粉或大豆浓缩物）可以与血红素铁结合，增强铁的吸收，从而提高铁的生物利用度。王等人。 [6]表明结晶血红素和L-精氨酸可以制备水溶性血红素-精氨酸凝聚物，可作为食品添加剂、功能性食品和药物中的新型血红素铁补充剂。张等人。 [7] 报道说，血红素可以通过七个 α 连接葡萄糖单元的环状寡糖与 β-环糊精结合 [1, 4]，从而显着提高血红素的溶解度。虽然在血红素铁的溶解度提高方面取得了一些进展，但由于制备工艺复杂，工业化并不容易。因此，开发一种简单的方法来提高氯化血红素的溶解度仍然是一个重大挑战。

纳米科学和纳米技术有可能为功能性物质的开发提供新的解决方案，特别是在不影响消费者感官知觉和改善某些成分吸收的情况下加入生物活性化合物 [8]。纳米粒子有几个优点 [9]，包括促进疏水性物质的溶解性 [10]。杜海姆等人。 [11] 通过纳米技术开发了新型的基于维生素 E 的纳米药物，在药物递送方面具有多种优势，如生物相容性、提高药物溶解性和抗癌活性。张等人。 [12] 报道，由琥珀酸酐修饰的短葡聚糖链制备的纳米颗粒可以负载疏水性叶黄素，从而提高叶黄素的水溶性。尽管纳米粒子具有巨大的潜力，但尚未报道纳米级血红素。我们假设与游离血红素相比，血红素纳米颗粒的溶解度可以增加，这可能具有有价值的应用。

目前工作的主要目标是使用简便的透析技术开发不同形状的氯化血红素纳米颗粒并提高它们的溶解度。评估了初始氯化血红素浓度和透析条件的制备参数。此外，还评估了所形成的血红素纳米颗粒对 pH、热处理和盐的溶解度和稳定性。总的来说，提高氯化血红素的溶解度具有多种潜在的应用领域。

材料和方法

材料

截留分子量为 8-12 kDa 的血红素和透析膜购自北京阳光生物科技有限公司（中国北京）。丙酮（CH3COCH3，≥ 99.5%）购自康德化工有限公司（中国莱阳）。其他试剂均为分析纯。

血红素纳米颗粒的制备

使用透析方法制备血红素纳米颗粒：将 0.1 mg/mL（或 0.5 mg/mL）血红素溶解在用 0.1 ml 浓盐酸酸化的丙酮中。血红素溶液透析不同天数，每天换水，冻干得到血红素纳米粒。为了确定可变参数对血红素纳米颗粒制备的影响，血红素/水的体积比设置为 1:3、1:5、1:10 和 1:50；培养温度设置为 4 和 25 °C；孵育时间分别设置为1、3、5 天。

透射电子显微镜 (TEM)

纳米粒子的 TEM 图像是用 7700 透射电子显微镜（日立，东京，日本）以 80 kV 的加速电压拍摄的。将微小的样品滴沉积在涂碳的铜网上，然后冷冻干燥观察。

平均尺寸和 Zeta 电位测量

使用 Malvern Zetasizer Nano（Malvern Instruments Ltd.，UK）通过动态光散射 (DLS) 测量颗粒的平均尺寸、zeta 电位（ζ 电位）和多分散指数（PDI）。样品在 MilliQ 水中稀释并在 25 °C 下分析。稀释样品的浓度为0.05%。

紫外-可见吸收光谱

在紫外-可见分光光度计（TU-1810，北京，中国）上对溶解在酸化丙酮水溶液中的游离氯化血红素和氯化血红素纳米颗粒进行紫外-可见光谱测量。在200-800 nm波长处以1nm间隔扫描分子吸收光谱。

溶解度测定

根据 Gidwani 等人报道的方法研究了纯氯化血红素和纳米颗粒的定量水溶性。 [13]。简而言之，将纯氯化血红素和纳米颗粒的过饱和溶液分别加入试管中的 5 ml 去离子水中。试管在不同温度（25、37、60和80 °C）下不断（500 rpm）搅拌30 分钟。然后，将溶液以 3500g 离心 上清液用酸化的丙酮水溶液适当稀释。通过紫外-可见分光光度计在 640 nm 处测定样品的浓度。每次测量均以空白酸化丙酮水溶液为参照建立基线。

pH、温度和盐稳定性

测量纳米颗粒的尺寸、ζ 电位、PDI 和浊度 (0.5 mg/mL) 并与初始值进行比较以评估纳米颗粒的稳定性。将颗粒悬浮液分为十组：六组调节至所需的pH值[2、3、5、7、9、11]，并使用盐酸（0.1 M）或氢氧化钠溶液（0.1 M）；三组分别加热至25、60和80 °C，然后冷却至室温；另一种是用不同浓度的氯化钠（NaCl，0、10、50、100、250 和 500 mM）分别进行的。混合溶液在25 °C下静置过夜。

傅立叶变换红外 (FTIR) 光谱

使用 FTIR 光谱（Tensor 27，Jasco Inc.，Easton，MD，USA）确认了血红素纳米颗粒的化学结构。以 4 cm ^{− 1} 的分辨率共扫描 32 次 使用快速扫描软件在 OMNIC 8.0 中累积以获得单个光谱。光谱范围为400-4000 cm ^{− 1} .

荧光光谱

使用荧光分光光度计（F-7000，Hitachi，Japan）进行游离氯化血红素和纳米颗粒的荧光测量。样品的荧光光谱在300～600 nm波长范围内，激发波长为402 nm。

X 射线衍射图 (XRD)

使用 X 射线衍射仪（AXS D8 ADVANCE；Bruker，Karlsruhe，Germany）获得游离氯化血红素和纳米颗粒的 XRD，并在 2θ 4-40°的范围。游离氯化血红素和纳米颗粒的相对结晶度是通过在衍射图上绘制峰的基线并根据 Jivan 等人报告的方法使用软件光谱查看器计算面积来确定的。 [14]。曲线上方和下方的面积分别对应于结晶域和非晶区域。上部面积与总面积之比为相对结晶度：

相对结晶度(%) =峰下面积/总曲线面积 × 100。

统计分析

获得所有定量结果的三份样品。结果报告为平均值和标准偏差。使用 SPSS V.17 统计软件包（SPSS Inc., Chicago, IL, USA）通过 Duncan 多极差检验进行统计分析。

结果与讨论

血红素纳米颗粒的形成和表征

通过透射电镜检查使用透析方法制造的氯化血红素纳米颗粒的形态和尺寸。当血红素浓度为 0.5 mg/mL 时，在不同的血红素/水体积比和不同的透析天数下，会形成不同尺寸的血红素纳米结构（图 1，附加文件 1：图 S1-S3）。当透析 3 天后血红素/水的体积比为 1:10 时，纳米颗粒具有明确的球形形状，直径为 50-100 nm。随着血红素/水体积比 (1:50) 的增加，纳米颗粒聚集成棒状颗粒（图 1）。特别是，我们发现随着透析时间从 1 天增加到 3 天，氯化血红素纳米颗粒变得均匀分散（附加文件 1：图 S1-S3）。透析温度（4 和 25 °C）对血红素纳米颗粒的粒径和分散几乎没有影响（附加文件 1：图 S4）。

使用不同的血红素/水体积比透析 3 天制备的血红素纳米粒子的 TEM 图像，包括 1:3 (a ), 1:5 (b ), 1:10 (c ) 和 1:50 (d ) 在 25 °C。血红素浓度为0.5 mg/mL

图 2 显示了血红素浓度为 0.1 mg/mL 时为不同透析日制备的血红素纳米颗粒的典型 TEM 图像。产物主要是定义明确、单一分散、结构异常和蝌蚪状纳米粒子。蝌蚪状纳米颗粒优选在透析3天后分布。蝌蚪从头部的最大宽度 (200 nm) 到尾部的最大宽度 (100 nm) 显示出显着的大小差异。我们的结果表明，对于球形和蝌蚪形纳米颗粒，在 1:10 的氯化血红素/水体积比下以及在 25 °C 下透析 3 天后，均可以形成均匀分散的纳米颗粒。因此，我们选择了这两种氯化血红素纳米颗粒进行后续研究。

以 1:10 的血红素/水体积比制备的血红素纳米粒子在不同透析天数（包括 1 天）的 TEM 图像（a ), 3 天 (b ) 和 5 天 (c ) 在 25 °C。血红素浓度为0.1 mg/mL

为了进一步检查氯化血红素纳米颗粒的大小，使用 DLS 测定来确认纳米结构的形成。球形和蝌蚪形纳米粒子的直径分别约为 218.2 ± 6.2 和 299.8 ± 7.6 nm（图 3a）。 DLS 测量的纳米颗粒的尺寸比 TEM 测量的结果稍大；这种差异归因于纳米颗粒在水溶液中溶胀。已知 DLS 测量表明溶液中纳米粒子的流体动力学直径 [15]。球形纳米粒子的 ζ 电位（- 21.4 mV）大约是蝌蚪形纳米粒子（- 10.8 mV）的两倍（图 3b）。还测定了氯化血红素纳米颗粒的 PDI 以分析粒径分布。结果表明，球形和蝌蚪形纳米粒子的 PDI 分别为 0.348 和 0.402（图 3c）。这一发现表明所获得的氯化血红素纳米颗粒具有良好的多分散性。

平均大小 (a ), ζ-电位 (b )、PDI 和浊度 (c ) 和廷德尔效应 (d )不同形状的血红素纳米粒

当光束穿过胶体分散体时，一部分光被溶液中存在的胶体颗粒散射，导致光束发散。这种行为称为法拉第-廷德尔效应 [16]。在这种情况下，游离氯化血红素溶液没有出现廷德尔效应（附加文件 1：图 S5）。尽管如此，在球形和蝌蚪形纳米粒子的悬浮液中都观察到了廷德尔效应（图 3d），证实了在精细悬浮液中胶体或纳米粒子的形成。透析法形成氯化血红素纳米粒的机理可能是由于溶剂通过外部水相和内部有机溶剂相之间的界面扩散，导致氯化血红素溶解度降低并形成晶核。随后，由于单晶核以不同方式生长和自组装，形成了不同形状的氯化血红素纳米颗粒。

紫外-可见光吸收分析

根据上述结果，我们研究了两种形状的氯化血红素纳米颗粒在生色团生成方面是否存在差异。球形和蝌蚪形纳米粒子的 UV-Vis 光谱在 265 nm 处显示出相同的吸收带（图 4a）。球形纳米粒子在 667 nm 和 775 nm 处呈现窄吸收带。相比之下，蝌蚪状纳米颗粒溶液在 658 nm 处有一个宽峰，而在 775 nm 处没有一个峰。此外，球形纳米粒子的吸收强度高于蝌蚪形纳米粒子的吸收强度。如此大的差异既不能通过将蝌蚪视为球体和锥形杆的总和来解释，也不能通过有点不完美的球体配置来解释。对应于沿长轴的等离子体吸收的电子振荡被延迟和/或在反射路径上。因此，氯化血红素纳米颗粒的光学特性取决于形状，类似于 Hu 等人的报告。 [17]发现蝌蚪形和球形金纳米粒子具有不同的光学性质。

一 紫外-可见光谱，b FTIR 光谱，c 荧光发射光谱和d 游离氯化血红素、球形纳米颗粒和蝌蚪形纳米颗粒的 XRD 谱。纳米颗粒分散在去离子水中。 RC，相对结晶度

游离氯化血红素溶液在 344 nm 处显示出最大吸收，这归因于通常与卟啉相关的 Soret 带（附加文件 1：图 S5）。氯化血红素纳米粒子的吸收带从344nm移至265 nm，这表明氯化血红素纳米粒子的π-π共轭效应增强。令人惊讶的是，与游离血红素相比，这两种纳米颗粒都表现出高、强的近红外吸收，非常适合基于吸收的应用，如光热疗法和光声成像 [18]。马格诺等人。 [19] 还报道了具有近红外吸收的卟啉纳米粒子在光疗和光诊断中的应用受到了极大的关注，甚至作为磁性纳米粒子用于磁热疗和药物输送系统。

溶解度

血红素的溶解度是一个重要的因素，它可以直接影响体内的吸收效果。测试了纯氯化血红素和氯化血红素纳米颗粒在不同温度下的定量水溶性（表 1）。随着温度升高，所有样品的水溶性均增加。例如，游离氯化血红素在 25、37、60 和 80 °C 下的溶解度分别为 0.009 ± 0.000、0.060 ± 0.002、0.144 ± 0.004 和 0.209 ± 0.002、0.144 ± 0.004 和 0.2045 毫克/0.2045 毫升。

在 25、37、60 和 80 °C 下溶解的球形纳米粒子的量分别为 1.333 ± 0.023、1.499 ± 0.072、1.889 ± 0.081 和 3.889 ± 0.081 和 3.853mL，分别为 1.333 ± 0.023、1.889 ± 0.081 和 3.853mL分别为 0.997 ± 0.045、1.231 ± 0.035、1.521 ± 0.058 和 1.795 ± 0.050 mg/mL。与纯氯化血红素相比，纳米颗粒的水溶性研究结果显示出显着增加。球形纳米粒子在 25、37、60 和 80°C 的温度下表现出比蝌蚪形纳米粒子更高的溶解度。这一发现表明，在 25 °C 下，球形纳米颗粒的溶解度可能是游离氯化血红素的 308.2 倍。这种溶解度的增加主要是由于独特的纳米级粒径。该结果与 Gidwani 和 Vyas [13] 报道的其他研究一致。

FTIR 光谱分析

FTIR 光谱可用于识别官能团的类型。 3470 cm ^{− 1} 处的波段 主要归因于血红素中 N-H 和羟基的伸缩振动（图 4b）。 1460 cm ^{− 1} 处的波段 归因于 N-H 面内振动，这是由于来自血红素芳香吡咯环的 –CH3 的面外弯曲振动。 1600 cm ^{− 1} 处的峰值 是血红素表面结合羧基的C=O伸缩振动引起的酰胺键的特征峰，表明血红素中存在仲酰胺键。这些结果与 Xi 等人的结果一致。 [20]。然而，峰值在 3470 cm ^{− 1} 氯化血红素纳米颗粒比游离氯化血红素的范围更广，清楚地表明纳米颗粒之间的氢键相互作用增强。

荧光光谱

游离氯化血红素和氯化血红素纳米颗粒的荧光特性也通过荧光光谱进行监测。与游离氯化血红素相比，球形和蝌蚪形纳米粒子的荧光信号在 500 nm 处的表观发射最大值增加（图 4c）。这可能是由于纳米颗粒形成后血红素的溶解度增加所致[21]。

XRD 分析

XRD 证实了游离氯化血红素和氯化血红素纳米颗粒的结晶性质。如图 4d 所示，游离氯化血红素的 XRD 谱在 2θ 处显示出几个相对较强的反射峰 =6.8、9.6、11.5、16.2、21.5 和 23.9°。球形纳米颗粒的特征峰与游离血红素的特征峰相同，表明球形纳米颗粒的晶体结构在纳米颗粒配方中没有变化。然而，对于蝌蚪形纳米粒子，大多数特征峰消失了。此外，球形和蝌蚪形纳米颗粒的相对结晶度分别显着降低至 47.0% 和 35.7%，而游离氯化血红素为 56.7%。这些结果表明纳米颗粒制剂可以破坏血红素的部分结晶区域。

pH、温度和盐浓度对稳定性的影响

测量了在不同 pH 值 [2,3,4,5,6,7,8,9,10,11] 下孵育后氯化血红素纳米颗粒的尺寸、PDI、ζ 电位和浊度的变化（图 5a） , b)。在酸性条件下，血红素纳米颗粒的尺寸几乎保持不变，平均直径约为 200 nm（图 5a）。在 2 的低 pH 值下，氯化血红素纳米颗粒的尺寸减小到大约 122.4 nm。在 pH 为 7 时，纳米颗粒的尺寸增加到 293.6 nm，并且显着增加（P <0.05) 在碱性条件下（pH 值为 9 和 11.0），平均直径超过 400 nm。在酸性条件下，纳米颗粒的 PDI 小于 0.5，表明纳米颗粒没有明显的聚集 [22]。纳米颗粒的 ζ 电位随着 pH 值的增加而降低（图 5b）。纳米颗粒的浊度显示出相同的尺寸趋势。这些结果表明纳米颗粒在酸性条件下稳定，在碱性条件下不稳定。

血红素纳米颗粒的稳定性。不同 pH 值的影响 (a )、温度 (c ) 和盐浓度 (e ) 关于纳米颗粒的粒径和 PDI。不同 pH 值的影响 (b )、温度 (d ) 和盐浓度 (f ) 上的 ζ 电位和浊度

确定了热处理（25、60 和 80 °C）30 分钟对氯化血红素纳米颗粒的尺寸、PDI、ζ 电位和浊度的影响（图 5c、d）。当温度升高时，纳米颗粒的粒径、PDI、ζ-电位和浊度略有增加。结果表明氯化血红素纳米颗粒具有优异的热稳定性。同样，随着离子强度的增加，纳米颗粒的尺寸、ζ电位和浊度也增加，导致纳米颗粒的解离（图5e，f）。

结论

在这项工作中，我们首先使用简便的透析技术开发了蝌蚪形和球形的血红素纳米颗粒，在 25 °C 下，其溶解度可显着提高 308.2 倍。此外，血红素纳米粒子在酸性条件下稳定，并显示出优异的热稳定性。此外，两种纳米颗粒都表现出强烈的近红外吸收。未来的工作将集中在用于活性成分负载的光热响应血红素纳米载体系统的设计的深入研究。具有增强溶解性的血红素纳米粒子在生物医学、食品、光动力疗法和光动力-光热疗法等领域具有潜在的应用价值。

缩写

DLS：

动态光散射

FTIR：

傅里叶变换红外

TEM：

透射电子显微镜

XRD：

X射线衍射图