温度/pH双响应PNIPAM基纳米凝胶实现β-莰烯酮的可控递送

摘要

聚N-异丙基丙烯酰胺（PNIPAM）纳米凝胶与丙烯酸（AAc）共聚以调节下临界溶解温度（LCST）。所得PNIPAM-co-AAc纳米凝胶呈现两个明显的体积相变，LCST随AAc含量增加而升高。载药β-莰烯酮（β-LP）后，药物释放受温度和pH双重调控，且强烈依赖AAc比例。值得注意的是，PNIPAM-co-AAc20配方在酸性-中性pH和体温下药物释放<10%，而在碱性pH下释放>70%。这些结果表明温度/pH双响应PNIPAM纳米凝胶是口服给药实现肠道特异性递送的有前景载体。

引言

刺激响应纳米载体在药物递送、成像和诊断中应用日益广泛。在诸多触发因子——pH、温度、氧化还原、磁场、光——中，温度和pH仍是控制释放最广泛利用的手段。PNIPAM作为热响应聚合物，因疏水作用在其LCST（~32 ℃）以上发生塌缩；AAc引入的去质子化羧基带来额外静电排斥，使LCST上移。PNIPAM与AAc共聚因此提供了一个可同时响应温度和pH的可调平台。β-莰烯酮作为天然抗癌药物，因代谢快、脱靶毒性大而治疗窗狭窄；封装入响应性纳米凝胶可缓解这些缺陷。本研究报道了不同AAc含量的PNIPAM-co-AAc纳米凝胶合成、其双刺激药物释放行为及在成纤维细胞中的细胞毒性评价。

方法

材料

NIPAM（97%，Sigma-Aldrich）、N,N'-亚甲基双丙烯酰胺（MBA）、AAc、蒸馏水、EtOH、过硫酸钾（KPS，98%，大田）、β-LP（天然产物）、PBS均为分析纯，开瓶即用。

PNIPAM-co-AAc纳米凝胶合成

500 mL烧瓶中溶解2.26 g NIPAM、0.154 g MBA、0–0.145 g AAc于200 mL水中，75 ℃下氮气吹扫后加入37.5 mg KPS，回流10 min得浑浊溶液。透析（12–14 kDa）7天，液氮速冻，冻干3天得干纳米凝胶（PNIPAM、PNIPAM-co-AAc5、PNIPAM-co-AAc10、PNIPAM-co-AAc20）。

β-LP负载

1 mg干纳米凝胶溶于1 mL EtOH，加入0.1 mg β-LP，避光磁力搅拌过夜，透析（6–8 kDa）、速冻、冻干，得β-LP负载纳米凝胶，4 ℃保存。

表征

形貌用TEM（200 kV）和FE-SEM（15 kV）观察。FT-IR光谱用Nicolet 6700记录。药物负载与释放用UV-Vis光谱（200–800 nm）定量。LCST通过动态光散射（DLS）在30–50 ℃范围内以1 ℃步长测定。

药物释放研究

10 mL β-LP负载纳米凝胶置于3.5 kDa透析袋中，在pH 2、4、7.4、8.0的PBS中分别于24 ℃和37 ℃孵育。设定时间点（0–12 h）取样2 mL经UV-Vis分析。累积释放量相对总负载β-LP计算。

细胞活力实验

NIH3T3成纤维细胞（2×10⁴ cells/well）分别用游离β-LP、PNIPAM-co-AAc5-β-LP、PNIPAM-co-AAc20-β-LP处理，浓度0–20 µg/mL。3 h后进行MTT实验（595 nm）和LIVE/DEAD®染色评估细胞毒性。

结果与讨论

制备与形貌

TEM和SEM图像（图1）显示单分散纳米凝胶，PNIPAM-co-AAc5平均粒径~250 nm。Zeta电位从PNIPAM的−13.6 mV降至PNIPAM-co-AAc20的−23.6 mV，反映表面羧基增加。

温度响应行为

DLS测定（图2）显示两个明显的溶胀-塌缩转变。第一转变始于~30 ℃，第二转变现于~40 ℃，PNIPAM-co-AAc20移至45 ℃。因此LCST随AAc含量升高，与前人报道一致。

双刺激药物释放

37 ℃下，PNIPAM-co-AAc20在6 h内仅释放~61% β-LP，而PNIPAM和PNIPAM-co-AAc5释放~80%。pH 8.0时，PNIPAM-co-AAc20释放量较中性或酸性pH增加~10%（图3）。结果证实药物释放受碱性pH和高温协同增强。

体外细胞毒性

游离β-LP降低细胞活力程度高于纳米凝胶制剂。PNIPAM-co-AAc20在20 µg/mL下表现出更高细胞活力，与其37 ℃下低药物释放相关。Live/dead染色（图4）显示PNIPAM-co-AAc5-β-LP在3 h呈显著细胞毒性，而PNIPAM-co-AAc20-β-LP在pH 8.0前6 h基本无毒，此时观察到协同杀伤效应。