多壁碳纳米管通过一氧化氮信号促进番茄侧根发育

摘要

大量研究表明多壁碳纳米管（MWCNTs）对植物有毒性。然而MWCNTs是否及如何影响侧根（LR）形成——根系适应各种环境线索的重要组成部分——仍存争议。本报告发现MWCNTs可进入番茄幼苗根部。MWCNTs处理以近似剂量依赖方式促进番茄侧根形成。内源一氧化氮（NO）产生被MWCNTs触发，经Griess试剂法、电子顺磁共振（EPR）、激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）及NO清除剂共同证实。MWCNTs与NO在诱导侧根发育中存在因果关系，因清除内源NO后，MWCNTs触发的NO合成和侧根形成明显被阻断。硝酸还原酶（NR）活性随MWCNTs处理增加。钨酸盐抑制NR不仅损害NO产生，也废除MWCNTs触发的侧根形成。添加哺乳动物一氧化氮合酶（NOS）样酶抑制剂Nᴳ-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）未影响侧根形成。综上，我们提出NO可能作为MWCNTs调控侧根发育的下游信号分子，至少部分通过NR介导。

引言

碳纳米管有诸多生物和生物医学应用。因其易穿透细胞膜的独特能力，碳纳米管生物安全性一直是争议话题。随着碳纳米管产量和使用快速增长，表征其在人类、哺乳动物和植物中细胞毒性详细机制变得重要。植物及其群落对人类和环境至关重要，也面临碳纳米管暴露风险，因其可通过生物固体肥料施用在土壤中累积。作为碳纳米管重要成员，多壁碳纳米管（MWCNTs，由多层卷曲石墨烯组成）毒性被广泛研究。哺乳动物研究显示MWCNTs和单壁碳纳米管暴露诱导人角质形成细胞和A549细胞氧化损伤和NF-κB激活。MWCNTs和单壁碳纳米管可与质膜融合，通过脂质过氧化和氧化应激造成细胞损伤。人脐静脉内皮细胞中观察到MWCNTs触发的细胞毒性、氧化应激及温和炎症反应。先前研究提示MWCNTs在红苋菜中主要毒性源于活性氧（ROS）过量产生，补充抗坏血酸可逆转毒性效应。在此意义上，MWCNTs被视为生物体（动物或植物）的新应激因子。

侧根（LR）形成是根系架构重要决定因素，被视为对各种胁迫适应性反应指标。高等植物中LR形成受植物激素和广泛环境线索影响，包括水分有效性、养分、非生物胁迫如缺氧和重金属胁迫。大量证据证实LR形成不仅提供物理支撑，还促进水分和养分吸收利于植物生长发育。不同环境线索可触发特定胁迫诱导形态发生反应（SIMR）表型，包括促进侧根形成和抑制主根伸长。LR形成调控也受植物激素严格控制，如生长素，建议细胞周期调控基因响应生长素激活。同时，一些小分子参与生长素触发根器官发生在黄瓜、番茄、大豆、油菜中被证实。这些小分子包括过氧化氢（H₂O₂）、一氧化氮（NO）、一氧化碳（CO）、氢气（H₂）。

其中NO作为自由基气体，在植物中显示多种生理功能。除增强植物抗逆性外，NO功能包括促进根毛发育、不定根形成和侧根形成，尽管上述过程中NO生物合成酶来源仍不明确。动物中NO由L-精氨酸在血红素酶一氧化氮合酶（NOS）催化下合成。虽植物中未鉴定编码NOS酶基因，但哺乳动物NOS样活性被广泛检测到，哺乳动物NOS抑制剂如Nᴳ-硝基-L-精氨酸甲酯盐酸盐（L-NAME）可抑制植物NO产生。重要的是，充分遗传证据揭示NO可由硝酸还原酶（NR）产生，NR是植物氮代谢已知关键酶。NR介导NO产生参与气孔关闭和冷驯化已获遗传学证实。我们前期研究显示NR依赖的NO合成参与生长素诱导氢气介导的侧根形成。

迄今，补充纳米材料（包括MWCNTs、金纳米颗粒Au NP、氧化锌纳米颗粒ZnO NP、二氧化钛纳米颗粒TiO₂ NP、氧化石墨烯GO等）在不同植物种类中分别报道了侧根形成促进或抑制的不同反应（表1），但无研究提供NO在上述反应中作用的确凿证据。本研究通过Griess试剂法、LSCM、EPR分析检测内源NO，揭示MWCNT处理番茄幼苗NO水平升高。随后观察LR形成。我们通过NO清除剂和抑制NR及哺乳动物样NOS活性的拮抗剂操纵内源NO水平，进一步研究NO在MWCNTs触发LR形成中的作用。进一步实验揭示NR依赖的NO可能至少部分上是MWCNTs响应侧根形成所必需。此工作为理解纳米材料在植物中生物学效应开启新窗口。

材料与方法

化学试剂

除特别说明，其他化学品均从Sigma-Aldrich（St Louis, MO, USA）购买。MWCNTs从Sigma-Aldrich购买，按文献[50]表征。外径、内径、长度分别为6-12 nm、2.5-5 nm、1-9 μm。超声处理后获得均匀胶体悬液，灭菌后使用。

其他碳纳米颗粒从南京希纳诺材料科技购买：单壁碳纳米管（SWCNTs，XFS22；纯度>95%，直径1-2 nm，长度5-30 μm，比表面积>1075 m²/g）、石墨烯（XF001W；纯度~99%，直径0.5-5 μm，厚度~0.8 nm，单层比~80%，BET比表面积500-1000 m²/g；电阻率≦0.30 Ω·cm）、活性炭（AC，XFP06；纯度>95%，粒径5±1 μm，孔容1-1.2 cm³/g，孔径2.0-2.2 nm，比表面积~1500-1700 m²/g）。

此外，硝基脲（SNP）用作NO释放化合物。2-(4-羧基苯基)-4,4,5,5-四甲基咪唑啉-1-氧基-3-氧化物钾盐（cPTIO）作为NO清除剂。钨酸盐（Tg，NR抑制剂）和Nᴳ-硝基-L-精氨酸甲酯盐酸盐（NAME，哺乳动物NOS样酶抑制剂）也被应用。本研究中上述化学品浓度由预实验确定，以观察显著反应。

植物材料、生长条件与侧根形成测定

番茄（Solanum lycopersicum L.）种子"江薯14"由江苏农业研究院提供。同等大小种子在25±1°C黑暗中蒸馏水发芽3天。选取子根长2-3 mm同等幼苗转移至含指定浓度MWCNTs、200 nM 1-萘乙酸（NAA，已知生长素）、0.1 mM SNP、0.2 mM cPTIO、20 μM钨酸盐（Tg）、0.2 mM NAME及其他碳纳米颗粒（5 mg/mL SWCNTs、石墨烯、活性炭AC）单独或组合的6 mL处理液中，指定时间点处理。幼苗在光照培养箱（25±1°C，光强200 μmol m⁻² s⁻¹，14/10 h光/暗周期）生长。

处理后拍照，用Image J软件测定每株幼苗萌发侧根（>1 mm）数目和长度。如前所述，仅用侧根可诱导段进行后续分析。

透射电镜成像MWCNTs分布

透射电镜（TEM，JEOL JEM-200CX，东京，日本）表征番茄幼苗根部分布。TEM样品制备按前文方案[59]。

激光扫描共聚焦显微镜成像内源NO

用特异性NO荧光探针4-氨基-5-甲基氨基-2′,7′-二氟荧素二乙酸酯（DAF-FM DA）成像NO。探针充分洗涤后，蔡司LSM 710共聚焦显微镜（Carl Zeiss，Oberkochen，德国，激发488 nm，发射500-530 nm用于NO分析）获取图像。每处理随机选取20个单独样品测量。照片代表同一结果。

Griess试剂法测定NO含量

按前文方法[50]用Griess试剂法测定NO含量。重要的是，为避免植物体内高浓度硝酸盐和亚硝酸盐干扰，用200 μM cPTIO（NO清除剂）预孵育30 min的同同样品作为空白样品。加入Griess试剂30 min后，540 nm记录吸光度，对照NaNO₂标准曲线测定NO含量。

电子顺磁共振（EPR）测定NO

按前文方法[39,55,60]用EPR测定NO水平。有机溶剂层用于在Bruker A300谱仪（Bruker Instrument，Karlsruhe，德国）下测定NO，条件：室温；微波频率9.85 GHz；微波功率63.49 mW；调制频率100.00 kHz。

硝酸还原酶（NR）活性测定

按前文方法[57]在540 nm分光光度法检测NR活性。产生亚硝酸盐经加入1 mL 1%（w/v）磺胺酸在3 M HCl中与1 mL 0.02%（v/v）N-(1-萘基)-乙二胺后，在540 nm分光光度法测定。

统计分析

结果以三次独立实验、每实验三个生物学重复的平均值±SE表示。SPSS Statistics 17.0软件统计分析。Duncan多重检验（p<0.05）作为适当方法。

结果

MWCNTs不仅进入根细胞，还促进侧根形成

侧根形成是根系架构主要决定因素。为研究MWCNTs对侧根形成影响，3日龄番茄幼苗孵育系列浓度MWCNTs（0.05、0.5、5、50 mg/mL）3天。施用NAA作为阳性对照。实验中侧根数目和长度作为侧根形成两参数。图1显示，与对照相比，外源MWCNTs以近似剂量依赖方式显著诱导侧根形成，5和50 mg/mL最大效应。施用200 nM NAA观察到相似诱导反应。考虑MWCNTs成本和侧根诱导反应，后续实验采用5 mg/mL MWCNTs。

为验证MWCNTs诱导侧根形成特异功能，进一步考察其他碳同素异形体是否有此诱导效应。图2a显示所有碳纳米材料均对茎生长表现毒性（数据未显示）。有趣的是，相同浓度（5 mg/mL）下MWCNTs、SWCNTs、石墨烯、活性炭对照无化学物质对照植物均不同程度增加侧根数目和长度（图2b）。其中MWCNTs孵育番茄幼苗发现最大诱导反应。

透射电镜（TEM）评估MWCNTs分布。图3结果显示外源施用MWCNTs可被番茄幼苗吸收，MWCNTs分布在根细胞中。这可理解，因幼苗根直接培养于含MWCNTs液体溶液中。

MWCNTs诱导NO合成及随后侧根形成对cPTIO敏感

为研究NO是否参与MWCNTs诱导侧根形成，用NO释放化合物和清除剂操纵内源NO水平评估NO功能。类似前文结果[31]，施用硝基脲（SNP）可诱导侧根形成，SNP与MWCNTs联用观察到加成反应（图4）。加入cPTIO（NO清除剂）后，MWCNTs引起的侧根形成促进反应显著受损。单独cPTIO较无化学物质对照可抑制侧根发育，表明内源NO在根器官发生中重要作用。

为进一步评估内源NO在MWCNTs响应中重要角色，首先用Griess试剂法检测体内NO产生时间历程。上述测定中，用cPTIO预处理同一样品作为空白以获准确结果。观察到番茄幼苗根部NO产生MWCNT处理后显著增加至24 h达峰，随后恢复初始水平（48 h；图5a）。MWCNTs触发24 h最大内源NO水平被cPTIO明显废除，提示NO特异性作用。

为确认上述结果，采用LSCM和EPR。首先用细胞渗透、较特异NO荧光探针DAF-FM DA标记NO，LSCM成像监测番茄幼苗根内源NO水平变化。类似前文结果（图5a），cPTIO存在下MWCNTs触发的DAF-FM依赖荧光强度增加大幅废除（图5b）。结果暗示DAF-FM触发荧光与番茄幼苗根内源NO水平相关。

EPR光谱证实MWCNTs诱导NO产生。预期24 h MWCNTs处理幼苗根呈现NO复合物典型超精细三重线结构。但加入cPTIO废除上述信号，表明MWCNTs暴露确实导致强NO产生（图5b）。综上数据提示NO合成可能为番茄幼苗MWCNTs触发侧根形成所必需。

NR可能负责MWCNTs诱导NO产生及随后侧根形成

因NR和哺乳动物样NOS是植物NO合成相关两主要酶，后续实验应用钨酸盐（NR抑制剂）和NAME（哺乳动物NOS抑制剂）。钨酸盐处理实质性抑制MWCNTs处理番茄幼苗根侧根形成促进（图6）。相比之下，NAME加入未强烈抑制MWCNTs触发侧根形成，表明哺乳动物样NOS可能非MWCNTs诱导NO产生靶合成酶。单独施用钨酸盐或NAME时，番茄幼苗侧根形成轻微但无显著下降。

通过监测施用MWCNTs伴随或不伴随钨酸盐时NO产生，进一步考察NR在MWCNTs触发侧根形成中作用。与内源NO产生变化（图5a）相比，NR活性时间历程分析显示相似趋势（图7a），MWCNTs处理后24 h达峰。结果提示MWCNTs诱导NO产生增加主要源于NR活性增强。一致地，Griess试剂法（图7b）、LSCM和EPR（附件1：图S1）证实钨酸盐抑制NR依赖NO产生。

讨论

植物毒性是理解纳米颗粒潜在环境影响重要考量。大量证据揭示MWCNTs对植物有毒，包括诱导氧化损伤、抑制种子萌发、根生长发育。然而作为SIMR表型，侧根形成通过根分枝是根系适应各种环境线索重要组成部分。本工作整合生物学、药理学、生物化学分析，显示NR介导NO产生参与MWCNTs诱导侧根形成，至少在我们实验条件下部分成立。NO在MWCNTs刺激根器官发生中功能强调了这一第二信使在植物发育过程和逆境适应中核心作用。

首先确证5 mg/mL MWCNTs（外径6-12 nm）可进入根组织（图3）。随后观察番茄侧根形成诱导（图1），模拟NAA和SNP诱导角色（图4），SNP为已知NO释放化合物。树脂树、莴苣、拟南芥挑战MWCNTs（外径分别6-13 nm、~9.5 nm、30-40 nm）也发现相似诱导反应。例如原始MWCNT（p-MWCNT）或羧基功能化MWCNT（c-MWCNT，平均直径9.5 nm）均可促进莴苣幼苗侧根发育。相反，大豆植物受MWCNTs（外径20-70 nm）同时发现主根抑制甚至侧根形成抑制。对比MWCNTs外径数据（表1），我们推测MWCNTs对侧根形成影响随直径变化：小直径促进、大直径抑制。相关机制当然需仔细研究。植物盐耐受性中确认类似现象。结合上述结果，进一步推断纳米材料功能可能因物种而异，反之不同类型纳米材料可能引起各异生物学效应。但其他影响因素如不同MWCNTs剂量、植物生长条件等难以完全排除。

相比相同浓度其他纳米材料（SWCNT、石墨烯、AC），MWCNTs观察到最大侧根形成诱导甚至茎生长毒性效应（图2）。这可能与MWCNTs特殊物理特性相关：高导电性、大比表面积、高长径比、卓越热稳定性等纳米材料特性。纳米材料毒性在黄瓜、卷心菜、胡萝卜、洋葱等广泛报道。

大量证据显示NO作为信号分子，可调控从环境适应到发育（包括种子萌发和根器官发生）广泛植物过程。后续实验揭示NO可能参与MWCNTs诱导侧根形成。虽多种植物细胞NO成像方法被应用，但每种方法可能存在灵敏度不足、NO非依赖分子干扰等缺点。因此我们实验条件下应用Griess试剂法、LSCM、EPR三种NO成像测定方法，配合cPTIO（NO清除剂）应用。三法均观察到MWCNTs诱导番茄幼苗内源NO产生增加被cPTIO废除（图5）。重要的是，该过程与MWCNTs诱导侧根发育生物学响应相关，同步施用cPTIO时严重阻断（图4）。

进一步评估这些响应及外源施用MWCNTs诱导NO潜在来源，揭示NO产生及随后侧根形成可归因于NR活性。植物中NO产生主要来自NR和哺乳动物NOS样蛋白。但植物NOS基因仍未鉴定，尽管用哺乳动物NOS酶抑制剂实验提供一些L-精氨酸依赖途径NO产生证据。NR被确认为植物中最重要NO来源。前期研究显示NR依赖NO产生作为硝酸盐相关信号参与根系架构调节。此外NR依赖NO产生与冷驯化、盐耐受性、脱落酸诱导气孔关闭密切相关。我们结果进一步揭示钨酸盐（NR抑制剂）明显损害MWCNTs诱导侧根形成，特别是侧根长度（图6）。相反，L-NAME（哺乳动物NOS抑制剂）仅侧根长度轻微下降，侧根数目无显著差异。一致地，生化分析显示NR活性被MWCNTs明显增加（图7a），与NO产生变化平行（图5a）。上述反应均可被钨酸盐完全阻断（图7a，附件1：图S1）。因此我们推断MWCNTs诱导内源NO产生增加主要归因于NR途径。当然，进一步遗传学证据仍需探究。

结论

总之，我们提供证据表明MWCNTs通过NR诱导NO产生可能是番茄侧根形成所需，总结见图8。重要的是，上述发现为理解MWCNTs在植物中复杂分子机制功能提供见解。