石墨烯氧化物整合nHAC/PLGA支架促进成骨细胞增殖与骨再生

摘要

可降解多孔支架是骨组织工程核心。本研究采用冻干法制备纳米羟基磷灰石/胶原（nHAC）与聚(乳酸-共-乙酸)（PLGA）掺杂不同含量石墨烯氧化物（GO）的复合支架。复合支架呈连续三维孔网络。GO轻微增强亲水性，显著提高杨氏模量，1.5 wt% GO支架达10.20±1.28 GPa，无GO支架仅7.53±1.25 GPa。体外实验中，MC3T3-E1成骨细胞在1.5 wt% GO支架上表现出显著更高的粘附和增殖（CCK-8实验和SEM成像证实）。研究表明nHAC/PLGA/GO支架兼具优异细胞相容性和力学性能，是骨再生应用的有前景候选材料。

背景

模拟骨细胞外基质的三维多孔支架对骨修复成功至关重要。传统制备技术——电纺丝、计算拓扑设计（CTD）结合固态自由成形（SFF）、冻干——提供不同程度的结构控制和可扩展性。冻干通过真空升华冻结溶剂，提供制备高度互联孔隙的直接途径。

天然骨由胶原和羟基磷灰石（HA）分级组装而成。纳米羟基磷灰石/胶原（nHAC）复合材料模拟这一天然结构，具有良好生物相容性和生物可吸收性。但胶原固有脆性和快速降解限制其应用。聚(乳酸-共-乙酸)（PLGA）提供力学强度和可调降解率，而GO提供独特理化性质——高比表面积、力学增强、可调节细胞行为的官能团。

先前研究显示GO增强支架改善成骨分化和细胞增殖。本研究系统评估增量GO负载（0.0、0.5、1.0、1.5 wt%）对nHAC/PLGA复合材料结构、力学、亲水性和生物学性能的影响。

结果与讨论

nHAC/PLGA/GO复合支架结构

制备过程：I型胶原溶于乙酸，Ca和P离子共沉淀形成nHAC，与PLGA和分散GO混合，冻干。扫描电镜（SEM）显示高度多孔结构，互联孔隙0-200 nm。自动比表面分析仪量化孔隙分布（图2f），证实以<100 nm孔隙为主，有利于成骨细胞渗透。

理化与力学表征

粉末XRD确认六方HA存在；GO因低负载量信号不可辨。FT-IR显示胶原酰胺带和磷酸盐峰，微小位移表明胶原、HA、PLGA和GO间化学相互作用。

定量纳米力学AFM测量（QNM-AFM）显示杨氏模量随GO含量单调增加：0 wt% 7.53±1.25 GPa，0.5 wt% 8.34±1.00 GPa，1.0 wt% 9.15±0.85 GPa，1.5 wt% 10.20±1.28 GPa。1.5 wt% GO支架较无GO支架显著增刚，反映GO增强作用。

接触角测量显示随GO增加逐渐降低：无GO 125.1°降至1.5 wt% 101.4°，表明GO亲水官能团改善表面润湿性（图4f）。

细胞培养与细胞毒性

MC3T3-E1成骨细胞播种于支架，7天代谢活性递增（CCK-8实验）。早期（0.5和1.0 wt% GO）增殖略低于无GO对照，但1.5 wt% GO支架第3、5、7天追平并超越对照（图5）。SEM证实细胞广泛铺展和网络形成，GO负载支架上细胞形态更大、扁平（图6）。

NIH-3T3成纤维细胞暴露于支架悬浮液24 h，无显著细胞毒性；所有GO负载下活力>97%，确认复合材料生物相容性（图7）。

结论

冻干法制备的nHAC/PLGA/GO支架具有互联孔隙、增强力学刚度和改善亲水性。1.5 wt% GO支架展示优越成骨细胞粘附增殖并保持优异细胞相容性，凸显其作为骨组织工程支架的潜力。

方法

材料

I型胶原、PLGA（75:25, Mw=95 kDa）、GO、细胞培养试剂购自知名供应商。MC3T3-E1成骨细胞和NIH-3T3成纤维细胞来自权威细胞库。

支架制备

胶原溶于0.5 M乙酸（4 g/L）。Ca和P溶液（Ca/P=1.66）以100滴/min滴加，搅拌，37 °C氨水滴定至pH 9。24 h后收集沉淀，冻干研磨得nHAC粉末。

GO分散于二噁烷（0.0、0.5、1.0、1.5 g/L）超声处理，加入PLGA（10% m/v）搅拌12 h。按1:1重量比加入nHAC，超声4 h。混合物-20 °C过夜冻结，冻干得最终支架。

表征

SEM、AFM（QNM模式）、FT-IR、XRD、接触角、孔隙率按标准规程测定。所有数据三次重复。

细胞培养与实验

MC3T3-E1以2.5×10⁴ cells/mL接种于支架圆片，DMEM+10% FBS+3%抗生素，37 °C、5% CO₂培养。CCK-8于第1、3、5、7天测增殖。SEM样品4%多聚甲醛固定、脱水、临界点干燥、喷金。

细胞毒性测试

NIH-3T3暴露于100 mg/mL支架悬浮液24 h，CCK-8测定。活力相对对照培养计算。

统计分析

数据表达为均值±SD。Student's t检验；p<0.05为显著。