姜蒜绿色合成氧化镍纳米颗粒展现强抗菌与催化性能

摘要

具有降低化学毒性的植物合成纳米颗粒（NPs）受到全球关注，近期成为纳米技术重要组成部分。我们制备了植物化学（姜和蒜）还原NiO-NPs以替代纺织工业中合成杀菌和催化剂。采用紫外-可见光谱（UV-Vis）、X射线衍射（XRD）、X射线光电子能谱（XPS）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、能量色散X射线光谱（EDS）、扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）表征NPs。XRD和UV-Vis确认NPs合成，在350 nm处有强吸收，姜还原粒径16-52 nm，蒜还原11-59 nm。扫描和透射电镜确认多形性，呈立方和更多球形NPs。此外，FTIR成功确认合成NiO-NPs所用姜蒜提取物确切量（1:3.6 ml）。植物化学还原蒜NiO-NPs对多重耐药金黄色葡萄球菌在增加浓度（0.5、1.0 mg/50 μl）下表现出增强杀菌活性，且高效降解亚甲蓝（MB）染料。综上，绿色合成NiO-NPs是解决耐药性和环境友好催化剂的潜在选择，可在工业规模应用。

引言

纳米技术涉及至少一维尺寸1-100 nm物质，提供通过控制纳米尺度尺寸设计材料能力[17]。NPs因在医学等各领域独特化学、物理、生物学性质受到极大关注。其性质可通过纳米尺度改变尺寸轻松调控[47]。

镍（Ni）和氧化镍（NiO）NPs因在能源技术、磁性、生物医药、电子学中特定磁性、催化、电子性质具有重要意义[9, 26, 35]。NiO具有3.6-4.0 eV宽禁带和立方晶格结构，因p型半导体具有潜力。这些NPs具有高化学稳定性、超级电容性质、电子转移能力、电催化，用于生物医药、光催化、抗炎、抗菌活性[8, 10, 11, 45]。传染病出现，特别是抗生素耐药（MDR），严重破坏全球公共卫生。通常，致病革兰阳性（G+）和革兰阴性（G-）菌株均为主要公共卫生威胁。

奶牛乳腺炎是奶业主要问题疾病，具有巨大经济影响，特征为乳汁化学、微生物、物理变化，乳腺腺体组织病理变化[6, 19]。乳腺炎病因包括感染因子：细菌、病毒、真菌，最重要是细菌，分两组：主要病原体（链球菌、金黄色葡萄球菌、致病棒状杆菌、大肠杆菌）和次要病原体（牛棒状杆菌和凝固酶阴性葡萄球菌）[25]。多重耐药革兰阳性和革兰阴性菌株出现对公共卫生构成重大威胁[23, 32]。

Zingiber officinale（姜）是阿育吠陀、尤那尼和中草药重要成分，因含丰富挥发油如姜烯酚、单萜、倍半萜、倍半萜烃，用治疗抗恶心、助消化、风湿、出血疾病等[12, 13, 43]。而Allium sativum（蒜）含有机硫成分：烯丙基硫化物、蒜氨酸、ajoene、烯丙基半胱氨酸、大蒜素等，及维生素、磷脂、黄酮、氨基酸、脂肪酸定向药用性质[14, 24]。我们旨在评估植物化学还原Ni金属氧化物NPs对MDR（S. aureus）杀菌作用，这是牛乳腺炎分离株，将是兽医研究领域上述制剂来自巴基斯坦首份报告。

方法

本研究旨在调查植物化学还原NiO-NPs对MDR（S. aureus）杀菌作用，这是牛乳腺炎分离株。

材料

硝酸镍[Ni(NO₃)₂]、氢氧化钠（NaOH）、亚甲蓝（MB）、硼氢化钠（NaBH₄）分析纯购自Sigma-Aldrich®，鲜姜蒜根从当地市场收集。根阴干至恒重供后续处理。抗生素纸片购自Bioanalyse®（土耳其）。细菌生长培养基为TM Media（Titan Biotech Ltd，印度）分析纯。

水提取物制备

姜蒜根用电动研磨机粉碎成细粉，塑料容器保存。研磨根粉与控制量蒸馏水-DIW（1:10）剧烈搅拌70℃ 30 min。提取物冷却，Whatman No.1滤纸过滤，4℃保存（图1）待后续使用。

姜蒜提取及植物化学还原NiO-NPs合成方案

NiO-NPs绿色合成

不同比例（1.2、1.8、2.4、3.0、3.6、4.2 ml）姜蒜水提取物加入硝酸镍（0.1 M）持续搅拌。用NaOH（2 M）维持搅拌溶液pH 12，90℃反应2 h。形成沉淀10,000 rpm离心10 min，DIW洗涤，90℃热风烘箱过夜干燥，见图1。

表征

合成NPs吸收最大值（ƛ_max)用UV-可见分光光度计（Genesys 10 S）200-800 nm波长扫描。相组成和结构信息用X射线衍射（XRD）BUNKER D2 phaser分析，2θ范围（10-80°），配备Cu Kα1辐射λ=1.540 Å。绿色合成NiO-NP官能团用傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）记录。NPs尺寸、形状、元素分析用场发射电子显微镜（FESEM）和透射电镜Hitachi H7100FA（TEM）分析。样品组成对应带隙用X射线光电子能谱（XPS）研究。

MDR S. aureus 分离鉴定

S. aureus 分离

从巴基斯坦旁遮普省公私立兽医医院和农场收集临床阳性牛奶样本，接种5%羊血琼脂，37℃培养24-48 h。获得特征菌落进一步划线甘露醇食盐琼脂（MSA）TM Media（Titan Biotech Ltd，印度）三重复分离纯化S. aureus。

MDR S. aureus 鉴定

细菌菌落鉴定通过形态学特征、革兰染色、生化程序（凝固酶和过氧化氢酶测试）按Burgey确定性细菌学手册描述。特征菌落抗生素敏感性用纸片扩散法按国家临床实验室标准委员会（NCCLS）指南评估分离MDR S. aureus。含氧四环素（30 μg）、泰洛星（30 μg）、庆大霉素（10 μg）、环丙沙星（5 μg）、甲氧苄啶+磺胺恶唑（1.25 μg+23.75 μg）抗生素纸片无菌接种Mueller-Hinton琼脂（MHA）TM Media（Titan Biotech Ltd，印度）1×10⁸ CFU/ml，37℃培养24 h[7]。对至少三种抗生素耐药菌株判定为MDR[28]。

抗菌活性

采用琼脂孔扩散法经抑制区测量（mm）评估姜蒜根提取物和绿色/植物化学还原NiO-NPs体外抗菌作用潜力，针对从乳腺炎乳汁收集十个代表性MDR S. aureus分离株。培养皿用1.5×10⁸ CFU/ml（0.5 McFarland标准）MDR S. aureus涂布MSA。用无菌钻孔器打6 mm直径孔。施加不同浓度姜、蒜单独水提取物和绿色合成（植物化学还原）NiO-NPs。水提取物浓度（10 mg/100 μl）和（50 mg/100 μl），NiO（0.5 mg/50 μl）和（1.0 mg/50 μl）。环丙沙星（0.005 mg/50 μl）作阳性对照，DIW作阴性对照（50 μl）。

统计分析

抗菌功效按抑制区（mm）大小计算，抑制区直径用SPSS 20单因素方差分析（ANOVA）统计分析。

催化

为评价合成提取物NiO催化性，新制水溶液硼氢化钠（300 μl）与3 ml亚甲蓝（0.03×10⁻³ M）溶液混合。随后加入300 μl所需浓度胶体样品。亚甲蓝染料（MB）浅蓝色消失代表染料降白亚甲蓝，见图2。用UV-Vis分光光度计200-800 nm记录吸收。

绿色合成NPs催化MB还原LMB示意图

结果与讨论

姜蒜水提取物植物化学还原NiO 200-600 nm光学性质见Fig. 3a, b。NiO-NPs最大吸收（λ_max)在350 nm附近（1:3.6 ml），随提取物浓度增加伴随蓝移而增强。姜蒜提取物吸收峰分别出现约275和280 nm。反应混合物加入根提取物后颜色从酒红骤变浅绿。峰展宽指示颗粒团聚和随提取物浓度NiO价带向导带电子跃迁，显示强吸收带[20]。因此Fig. 3a, b结果显示合成NPs吸收随提取物体积超优化值（1:3.6 ml）增减而降低。带隙用Tauc图（公式1）计算。

$$ \left(\alpha hv\right)=B{\left( hv-{E}_g\right)}^{\raisebox{1ex}{$1$}\!\left/ \!\raisebox{-1ex}{$2$}\right.} $$ (1)

a-d 姜（a）蒜（b）提取物绿色合成NiO-NPs吸收光谱。姜（c）蒜（d)植物化学还原NiO带隙

其中α吸收系数，h普朗克常数，B常数，υ光子频率，E_g能隙。从（αhʋ)^1/2对光子能量（hʋ)图切线x轴截距记录，提供样品带隙能量见Fig. 3c, d。姜掺杂NiO带隙能量变化确定为4.15至3.1 eV，蒜为3.5至3.0 eV（Fig. 3c, d）。

NiO-NPs结晶度、尺寸、相组成XRD确认见Fig. 4 a, b。2θ值37.10°、43.32°、62.81°、76.51°峰分别对应（111）、（200）、（220）、（311）（JCPDS卡号：00-047-1049）（Fig. 4a, b）参考[30]。峰强度指示六方和面心立方（fcc）NiO，姜植物化学还原NiO-NPs平均尺寸32.9 nm，蒜29.92 nm，按D=0.9λ/βcosθ计算。宽峰指示样品存在氧空位和局部晶格无序[38]。姜多种植物化学物质（黄酮、生物碱、鞣质、皂苷）和蒜水提取物（大蒜素、烯丙基硫化物、蒜氨酸、脂肪酸、糖脂、酚类、氨基酸、黄酮）作为封端剂负责金属氧化物NPs平均晶粒尺寸[14, 46]。

不同浓度姜（a）蒜（b）植物化学还原NiO XRD图谱及标准NiO（c）

姜蒜根生物合成NiO记录FTIR光谱见Fig. 5 a, b。3380 cm⁻¹宽吸收对应OH，峰展宽指示羰基与（N-H）胺伸缩振动[50]。2313 cm⁻¹尖锐吸收指示CO₂空气或NP晶粒内CO₂伸缩振动。大气CO₂快速吸收指示材料更大表面积[18]。1629 cm⁻¹宽吸收对应C=C芳环伸缩，1392和1064 cm⁻¹尖锐峰对应C-N脂肪族胺伸缩振动[48]。978 cm⁻¹强峰确认NiO金属氧伸缩频率[44]。

姜提取物至NiO（a）和蒜（b）FTIR光谱

NiO生物还原后观察峰位移2535-2313、1828-1629、1585-1392 cm⁻¹指示植物化学物质、萜类、黄酮、多元醇、蛋白质含酮、醇、羧酸、胺官能团负责生物还原螯合封端[42]。

场发射扫描和透射电镜确定植物化学还原NiO-NPs表面形貌和尺寸见Fig. 6a-f。NiO-NPs显示多形性，立方和更多球形（<50 nm）轻微团聚[40]。NPs团聚可能源于聚合物附着和颗粒间磁相互作用[49]。

a-f 姜（a）蒜（b）植物化学还原NiO SEM图像。姜（c）蒜（d）TEM图像及姜（e）蒜（f）尺寸分布

能量色散X射线光谱（EDS）描述合成NiO-NPs元素分析和进一步特征，确认纯NiO相见Fig. 7a, b。EDS光谱确认1-10 kV间三个峰直接关联测试样品高纯度Ni。光谱观测原子重量百分比Ni、O、C、Zn分别为54.69、27.81、18.06、-0.55。

a、b 绿色合成NiO-NPs EDS光谱

XPS显示植物化学还原NiO-NPs C1s、O1s、Ni2p光谱Fig. 8a-d，表明合成样品化学性质和键合态。284.8和286.2 eV最强峰显示C1s光谱（Fig. 8b）对应C-C和C-OH/C-O-C[21]。O1s峰530.8 eV（Fig. 8c）可分配给氧原子羟基、氧原子邻近镍空位、或氧键合碳原子C=O[1, 15, 37]。532.2 eV贡献归因于吸附水分子氧原子（NiOH）[31, 41]。Ni2p光谱含Ni2p3/2和Ni2p1/2峰可用高斯-洛伦兹函数分离五组分（Fig. 8d）。872.72和855.82 eV最强峰分别属Ni2p1/2和Ni2p3/2，对应卫星峰879.36和861.57 eV[16]。Ni（2p1/2）和Ni（2p3/2）自旋-轨道劈裂17.28 eV与早期报道吻合[33, 34]。

a-d 植物化学还原颗粒XPS全谱（a）、C1s轨道（b）、NiO O1s光谱（c）、Ni2p（d）

采用琼脂孔扩散法经抑制区测量（mm）评估姜蒜根提取物和绿色/植物化学还原NiO-NPs抗菌/杀菌作用见Fig. 9a-d和表1。结果显示NP浓度与抑制区（mm）强相关。样品1（1.2 ml:1）、2（1.8 ml:1）、3（2.4 ml:1）、4（3 ml:1）、5（3.6 ml:1）、6（4.2 ml:1）在低高浓度植物化学还原NiO-NPs姜（Fig. 9c, d）记录显著抑制区（mm）（P<0.05）分别为（3-4.9 mm）和（3.05-5.2 mm），蒜对MDR S. aureus（Fig. 9e, f）分别为（3.15-5.3 mm）和（3.75-5.9 mm）。姜水提取物显示零功效（Fig. 9a），蒜根低高浓度显示2.65和5 mm抑制区（Fig. 9b）。所有结果与阴性对照DIW（0 mm）和阳性对照环丙沙星（12.55 mm）比较。总体，植物化学还原蒜NiO-NPs对MDR S. aureus显示显著（P<0.05）增强杀菌作用。

a-f 体外抗菌活性：姜水提取物（a）、蒜（b）、姜提取物低高剂量植物化学合成NiO-NPs（c、d）、蒜（e、f）

氧化应激耐受差异取决多种因素，合成纳米材料表面积、形貌、粒径在抗菌作用潜力中起推断作用[29, 36]。细菌菌株与纳米材料静电相互作用产生活性氧种导致细菌细胞死亡[2,3,4,5, 22]。纳米材料与细菌菌株两种可能反应：阳离子Ni²⁺与细菌细胞负电部分强相互作用导致崩解；第二反应光照NiO表面激发电子从价带跃迁导带。进一步电子与O₂反应生成O⁻₂自由基产生H₂O₂。h⁺与水反应生成·OH。因此产生O⁻₂·和·OH物种在分解细菌细胞外表面脂质或蛋白质分子起重要作用[39]。

催化活性

Fig. 10 a-e展示室温下根提取物和绿色/植物化学还原NiO-NPs存在下MB催化还原。Fig. 10a显示常规路线合成NiO-NPs催化潜力，（Fig. 10b, c）代表姜蒜根水提取物催化潜力。植物化学还原NiO-NPs催化能力见Fig. 10d, e。显然NiO和植物根提取物非高效纳米催化剂，消耗15、21、38 min亚甲蓝还原（Fig. 10a-c）。姜植物化学还原NPs显示快速降解（λ_max=8 min）高效转化MB为白亚甲蓝（Fig. 10d）。蒜介导NiO-NPs显示类似模式5 min 100%染料还原（Fig. 10e）。

a-e 催化活性：NiO（a）、姜提取物（b）、蒜提取物（c）、姜植物化学还原NiO（d）、蒜还原NPs（e）

绿色/植物化学还原NPs通过从给体物种（BH₄）向受体（MB）转移电子、降低活化能稳定系统执行显著催化染料降解[27]。数据揭示绿色NPs为高效纳米催化剂，优于常规NPs和单独提取物。

结论

含姜蒜根提取物NiO-NPs作为优异杀菌和催化剂。根提取物掺入植物化学基团导致成功NiO-NP合成，FTIR揭示。XRD峰确认NiO六方和面心立方（fcc）晶格，SEM确认多形性，立方和更多球形NPs形貌，平均尺寸16-52（姜掺杂）和11-59 nm（蒜掺杂）。然而，元素分析揭示化学性质和键合态经EDS和XPS分析呈现镍氧实际百分比，UV分析验证350 nm范围吸收峰差异和高掺杂量蓝移。植物化学蒜还原NiO高浓度对MDR S. aureus比姜还原NPs更强效，且高效还原MB。因此，蒜根提取物绿色/植物化学还原NiO可作为先进医学抗生素耐药替代品和纺织工业无环境危害催化剂采用。

数据与材料可用性

所有数据无限制完全可用。

缩略语

EDS：

能量色散X射线光谱

fcc：

面心立方

FTIR：

傅里叶变换红外光谱

G+ve：

革兰阳性

G-ve：

革兰阴性

JCPDS：

粉末衍射标准联合委员会

MB：

亚甲蓝

Ni：

镍

NiO：

氧化镍

nm：

纳米

NPs：

纳米颗粒

SEM：

扫描电子显微镜

TEM：

透射电子显微镜

UV-Vis：

紫外-可见光谱

XPS：

X射线光电子能谱

XRD：

X射线衍射