绿色合成植物化学（姜和大蒜）减少氧化镍纳米颗粒证实具有杀菌和催化潜力

介绍

纳米技术影响至少一个尺寸为 1-100 nm 的尺寸，通过控制材料的尺寸提供设计材料的能力 [17]。 NPs由于其独特的化学、物理和生物学特性，在包括医学在内的各个领域受到了极大的关注。通过在纳米尺度上改变尺寸可以很容易地改变它们的性质[47]。

镍 (Ni) 和氧化镍 (NiO) NPs 由于它们在能源技术、磁性、生物医学和电子学中的特殊磁性、催化和电子特性而具有重要意义 [9, 26, 35]。由于 p 型半导体，NiO 具有 3.6 到 4.0 eV 的宽带隙和立方晶格结构，具有潜力。这些具有高化学稳定性、超电容特性、电子转移能力和电催化作用的 NPs 被用于生物医学和光催化、抗炎和抗菌活性 [8, 10, 11, 45]。传染性疾病的出现，尤其是抗生素耐药性 (MDR)，已经破坏了全世界的公共卫生。一般来说，致病性革兰氏阳性（G +ve）和革兰氏阴性（G -ve）菌株都是主要的公共卫生威胁。

在乳制品行业，牛乳腺炎是一种具有重大经济影响的重大问题疾病，其特征是牛奶中的化学、微生物和物理变化，而乳房腺组织发生病理变化[6, 19]。乳腺炎的病因包括传染性病原体，即细菌、病毒和真菌，最重要的是细菌，分为两组：主要（链球菌、金黄色葡萄球菌 , 化脓棒状杆菌 , 和 大肠菌 ）和次要病原体（牛棒杆菌 和凝固酶阴性葡萄球菌 ) [25]。多重耐药革兰氏阳性和革兰氏阴性菌株的出现对公众健康构成重大威胁[23, 32]。

生姜 （生姜）是阿育吠陀和尤那尼的重要成分，中草药由于其挥发油种类繁多，如姜酚、单萜、倍半萜和倍半萜烃 [12, 13, 43]。然而，大蒜 （大蒜）含有有机硫成分，即烯丙基硫醚基团、蒜氨酸、阿霍烯、烯丙基半胱氨酸和大蒜素，以及其他如维生素、磷脂、黄酮类化合物、氨基酸和脂肪酸，这些成分决定了大蒜的药用特性 [14, 24] .我们旨在评估植物化学还原的镍金属氧化物 NPs 对 MDR（金黄色葡萄球菌 )，牛乳腺炎的分离株，这将是巴基斯坦兽医研究领域对上述病原体的首次报道。

方法

目前的研究旨在研究植物化学还原的 NiO-NPs 对 MDR（金黄色葡萄球菌 )，牛乳腺炎的分离株。

材料

分析纯硝酸镍[Ni(NO3)2]、氢氧化钠(NaOH)、亚甲蓝(MB)和硼氢化钠(NaBH4)购自Sigma-Aldrich®，新鲜生姜和大蒜根从当地采集市场。根在阴凉处干燥以达到恒重以供进一步加工。抗生素盘购自 Bioanalysis® (土耳其)。使用的细菌生长培养基是 TM Media (Titan Biotech Ltd, India) 的分析级。

水性提取物的制备

用电动研磨机将生姜和大蒜根粉碎成细粉，并保存在塑料容器中。将磨碎的根粉末与受控量的蒸馏水-DIW (1:10) 混合，在 70 °C 下剧烈搅拌 30 分钟。提取物冷却，用Whatman No.1滤纸过滤，4℃保存（图1）备用。

姜蒜提取物及植物化学还原NiO-NPs的合成方案

NiO-NPs 的绿色合成

在连续搅拌下，将不同比例（1.2、1.8、2.4、3.0、3.6 和 4.2 ml）的姜和大蒜水提取物加入硝酸镍 (0.1 M) 中。使用 NaOH (2 M) 在 90°C 下将搅拌后的溶液 pH 12 保持 2 小时。形成的沉淀物以 10,000 rpm 离心 10 分钟，用去离子水洗涤，然后在 90°C 的热风烘箱中干燥过夜，如图 1 所示。

特征化

吸收最大值 (ƛ 用紫外-可见分光光度计（Genesys 10 S）从 200-800 nm 波长扫描合成 NPs 的最大）。通过 X 射线衍射 (XRD) 分析相组成和结构信息 2θ 范围为 (10–80°) 的 BUNKER D2 移相器配备了 λ 的 Cu Kα1 辐射 =1.540 埃。使用傅里叶变换红外光谱 (ATR-FTIR) 记录绿色合成的 NiO-NP 官能团。通过场发射电子显微镜 (FESEM) 和透射电子显微镜 Hitachi H7100FA (TEM) 分析 NPs 的尺寸、形状和元素分析。通过X射线光电子能谱(XPS)研究了具有相应带隙的样品组成。

MDR S 的隔离和识别。金黄色葡萄球菌

S 的隔离。金黄色葡萄球菌

从巴基斯坦旁遮普省的私营和公共部门兽医医院和农场收集的临床阳性牛奶样本在 5% 羊血琼脂上培养，并在 37°C 下培养 24-48 h。获得的特征菌落在甘露醇盐琼脂(MSA) TM 培养基(Titan Biotech Ltd，印度)上以三联体进一步划线以分离纯化的S。金黄色葡萄球菌 .

MDR S 的识别。金黄色葡萄球菌

菌落的鉴定通过形态学特征、革兰氏染色和生化程序（凝固酶和过氧化氢酶试验）按照Burgey's 确定性细菌学手册的描述进行。

根据国家临床实验室标准委员会 (NCCLS) 分离 MDR S 的指南，通过磁盘扩散试验评估特征菌落的抗生素敏感性。金黄色葡萄球菌 .含有土霉素 (30 μg)、泰乐菌素 (30 μg)、庆大霉素 (10 μg)、环丙沙星 (5 μg) 和甲氧苄啶 + 磺胺甲恶唑 (1.25 μg + 23.75 μg) 的抗生素药片 (1.25 μg + 23.75 μg) (Titan Biotech Ltd, India)1 × 10 ⁸ CFU/ml 在 37°C 下保持 24 小时 [7]。对至少三种抗生素耐药的细菌被宣布为耐多药[28]。

抗菌活性

通过琼脂井扩散法对十个代表性 MDR S 分离株进行了植物化学还原的 NiO-NPs 的体外抗菌作用潜力评估。金黄色葡萄球菌 从乳汁中收集。培养皿用 1.5 × 10 ⁸ 擦拭 CFU/ml (0.5 McFarland 标准) MDR S。金黄色葡萄球菌 在 MSA 上。使用无菌软木钻孔器形成直径为 6 mm 的孔。应用了各种浓度的生姜、大蒜和绿色合成（植物化学还原）NiO-NPs 的各种水提取物。使用浓度为 (10 mg/100 μl) 和 (50 mg/100 μl) 和 NiO (0.5 mg/50 μl) 和 (1.0 mg/50 μl) 的水提取物。环丙沙星（0.005 mg/50 μl）为阳性对照，DIW为阴性对照（50 μl）。

统计分析

抑菌效果以抑菌圈（mm）大小计算，抑菌圈直径采用SPSS 20进行单因素方差分析（ANOVA）进行统计分析。

催化

对于合成提取物 NiO 的催化评价，将新鲜制备的硼氢化钠水溶液 (300 μl) 与 3 ml 亚甲蓝 (0. 03 × 10 ⁻³ M) 解决方案。随后，将 300 μl 所需浓度的胶体样品加入到溶液中。亚甲蓝染料 (MB) 的淡蓝色消失，代表染料降解为无色亚甲蓝，如图 2 所示。使用 UV-Vis 分光光度计在 200-800 nm 之间观察到吸收。

绿色合成纳米颗粒催化还原MB制备LMB示意图

结果与讨论

姜和大蒜水提取物在 200-600 nm 之间植物化学还原 NiO 的光学特性如图 3a、b 所示。最大吸光度 (λ 在 NiO-NPs 中的 max) 在 350 nm (1:3.6 ml) 附近观察到，随着提取物浓度的增加，伴随着蓝移。姜和大蒜提取物的吸收峰分别出现在 275 和 280 nm 附近。加入根提取物后，反应混合物的颜色突然变化，从酒红色变为浅绿色。峰宽表明粒子团聚和电子从价带到导带的转变，如强吸收带所揭示的那样，NiO 中的提取物浓度 [20]。因此，在图 3a、b 中，结果显示合成 NPs 的吸收随着提取物体积的增加或减少超过优化值 (1:3.6 ml) 而减少。带隙是使用 Tauc 的图（方程 1）计算的。

一 –d 生姜绿色合成 NiO-NPs 的吸收光谱 (a ) 和大蒜提取物 (b ）。生姜植物化学还原 NiO 的带隙 (c ) 和大蒜 (d ) 分别

其中 α 是吸收系数，h 是普朗克常数，B 是一个常数，υ 称为光子频率，E g 是能带隙。从 (αhʋ ) ^1/2 对抗光子能量 (hʋ ）。 x 切线的截距 -轴被记录下来，它提供了样品的带隙能量，如图 3c、d 所示。带隙能量的变化是在生姜掺杂到 NiO 时分别从 4.15 到 3.1 eV 和大蒜从 3.5 到 3.0 eV 掺杂（图 3c、d）确定的。

NiO-NPs 的结晶度、尺寸和相组成由 XRD 确认，如图 4a、b 所示。 2θ 值 37.10°、43.32°、62.81° 和 76.51° 处的峰值对应于 (111)、(200)、(220) 和 (311)（JCPDS 卡号：00-047-1049）（图 4a） , b) 由 [30] 引用。峰强度表示六方和面心立方 (fcc) NiO，平均尺寸为 32.9 nm，由 D 计算 =0.9λ/βcosθ 生姜和 29.92 nm 大蒜植物化学还原的 NiO-NPs。宽峰表明样品中存在氧空间和局部晶格无序 [38]。生姜的各种植物化学物质（类黄酮、生物碱、单宁和皂苷）和大蒜水提取物（大蒜素、烯丙基硫化物、蒜氨酸、脂肪酸、糖脂、酚类物质、氨基酸和类黄酮）作为封端剂是造成平均微晶大小的原因金属氧化物纳米颗粒 [14, 46].

不同浓度植物化学还原生姜 (a ) 和大蒜 (b ) 和标准 NiO (c )

从生姜和大蒜根生物合成的 NiO 的记录 FTIR 光谱如图 5a、b 所示。在 3380 cm ⁻¹ 处精心设计了广泛的吸收 对应于 OH，峰宽表示具有 (N-H) 胺伸缩频率的羰基 [50]。在 2313 cm ⁻¹ 处的锐吸收 表示空气中或 NP 颗粒内 CO2 的 CO2 伸缩振动。大气 CO2 的快速吸收表明材料具有更大的表面积 [18]。 1629 cm ⁻¹ 处的宽吸收 对应于 C=C 芳环拉伸和 1392 和 1064 cm ⁻¹ 的尖峰 对应于 C-N 脂肪胺的伸缩振动 [48]。 978 cm ⁻¹ 处的强峰 证实了 NiO 的金属氧伸缩频率 [44]。

生姜提取物对 NiO (a ) 和大蒜 (b )

NiO 生物还原后观察到的峰位移为 2535-2313、1828-1629 和 1585-1392 cm ^-1 表明植物化学物质、萜类化合物、黄酮类化合物、多元醇以及具有酮、醇、羧酸和胺官能团的蛋白质，这些官能团负责生物还原中的螯合和封端 [42]。

使用场发射扫描和透射电子显微镜确定植物化学还原的 NiO-NP 的表面形态和大小，如图 6a-f 所示。 NiO-NPs 表现出立方体和更多球形（<50 nm）的多形性，具有轻微的团聚[40]。纳米颗粒的团聚可以从聚合物粘附和颗粒之间的磁性相互作用中看出[49]。

一 –f 生姜植物化学还原 NiO 的 SEM 图像 (a ) 和大蒜 (b ）。生姜植物化学还原 NiO 的 TEM 图像 (c ) 和大蒜 (d ) 和生姜植物化学还原 NiO 的尺寸分布 (e ) 和大蒜 (f )

元素分析和合成的 NiO-NPs 的进一步特征通过能量色散 X 射线光谱 (EDS) 描述，证实了纯 NiO 相，如图 7a、b 所示。 EDS 光谱证实了三个与测试样品中存在的高纯度 Ni 直接相关的峰，在 1 到 10 kV 之间。通过光谱观察到的 Ni、O、C 和 Zn 的原子量百分比分别为 54.69、27.81、18.06 和 - 0.55。

一 , b 绿色合成NiO-NPs的EDS光谱

XPS 显示 C1s , O1s , 和 Ni2p 图 8a-d 中植物化学还原的 NiO-NP 的光谱表明合成样品的化学性质和键合状态。 284.8 和 286.2 eV 处的最强峰表明 C1s 光谱（图 8b）对应于 C-C 和 C-OH/C-O-C [21]。 O1s 530.8 eV 处的峰值（图 8c）可以归于氧原子的羟基、与镍空位相邻的氧原子或氧键合碳原子 C=O [1, 15, 37]。位于 532.2 eV 的贡献归因于吸收的水分子 (NiOH) 中的氧原子 [31, 41]。 Ni2p 包含 Ni2p 的光谱 3/2 和 Ni2p 使用 Gaussian-Lorentzian 函数可以将 1/2 峰分成五个分量（图 8d）。 872.72 和 855.82 eV 处最强的峰属于 Ni2p 1/2 和 Ni2p 3/2，相应的卫星峰分别为 879.36 和 861.57 eV [16]。 Ni (2p 1/2) 和 Ni (2p 3/2)，NiO-NP 核心能级为 17.28 eV，与之前的报道 [33, 34] 一致。

一 –d 植物化学还原颗粒的 XPS 调查 (a ), C1s 轨道 (b ), O1s NiO (c ), 和 Ni2p (d )

如图 9a-d 和表 1 所示，使用琼脂孔扩散测定法通过抑菌圈测量（mm）评估姜和大蒜根提取物和绿色/植物化学还原的 NiO-NPs 的抗菌/杀菌作用。结果表明强相关NP 浓度和抑菌圈之间的距离 (mm)。显着抑菌圈 (mm) (P <0.05) 对于样品 1 (1.2 ml:1)、2 (1.8 ml:1)、3 (2.4 ml:1)、4 (3 ml:1)、5 (3.6 ml:1) 和 6 ( 4.2 ml:1) 范围 (3-4.9 mm) 和 (3.05-5.2 mm) 在低浓度和高浓度下通过生姜植物化学还原 NiO-NPs (图 9c, d)，而 (3.15-5.3 mm) 和 (3.75- 5.9 mm) 植物化学还原 NPs 与大蒜对抗 MDR S。金黄色葡萄球菌 (图 9e, f). 姜根水提取物表现出零效力（图 9a），大蒜根在低浓度和高浓度下分别显示 2.65 和 5 mm 的抑制区（图 9b）。将所有结果与阴性对照 DIW (0 mm) 和阳性对照环丙沙星 (12.55 mm) 进行比较。总体而言，大蒜植物化学还原 NiO-NPs 显示出显着的 (P <0.05) 增强对 MDR S 的杀菌作用。金黄色葡萄球菌。

一 –f 生姜水提物的体外抑菌活性(a ), 大蒜 (b )，以及由姜提取物在低剂量和高剂量下植物化学合成的 NiO-NPs (c , d ) 和大蒜 (e , f )

氧化应激耐受性的差异取决于各种因素，如表面积、形态和合成纳米材料的粒径，在抗菌动作电位中发挥推论作用 [29, 36]。细菌菌株和纳米级材料之间的静电相互作用导致活性氧的产生，发现导致细菌细胞死亡 [2,3,4,5,22]。发现两种可能与细菌菌株发生纳米材料反应的反应，包括阳离子 Ni ²⁺ 的强相互作用 细菌细胞带负电的部分导致塌陷，而第二次反应导致在 NiO 表面用光照射时电子激发从价带到导带。与 O2 的进一步电子反应生成 O ⁻ 2 个自由基导致 H2O2 的产生。 h ⁺ 反应生成·OH 与水。因此，结果 O ⁻ 2·和·OH物质在分解存在于细菌细胞外表面的脂质或蛋白质分子中起重要作用[39]。

催化活动

图 10 a-e 展示了在室温下根提取物和绿色/植物化学还原的 NiO-NP 存在下 MB 催化还原。图 10a 显示了通过常规途径合成的 NiO-NPs 的催化潜力，而（图 10b，c）代表了姜和大蒜根水提物的催化潜力。植物化学还原的 NiO-NPs 的催化能力如图 10d 所示。很明显，NiO 和植物根提取物不是有效的纳米催化剂，因为它们消耗 15、21 和 38 分钟来还原亚甲蓝（图 10a-c）。用姜进行植物化学还原的 NPs 显示出快速降解 (λ max =8 min），MB 有效转化为无色亚甲蓝（图 10d）。大蒜介导的 NiO-NPs 在 5 min 内显示出类似的 100% 染料还原模式（图 10e）。

一 –e NiO (a ), 姜提取物 (b ), 大蒜提取物 (c ), 姜通过植物化学还原 NiO (d )，大蒜减少了 NPs (e )

绿色/植物化学还原的 NPs 通过将电子从供体物种 (BH4) 转移到受体 (MB) 并通过降低活化能来稳定系统，从而进行显着的催化染料降解 [27]。数据表明，与传统纳米颗粒和单独提取物相比，绿色纳米颗粒是一种高效的纳米催化剂。

结论

具有生姜和大蒜根提取物的 NiO-NPs 作为极好的杀菌剂和催化剂。具有植物化学基团的根提取物掺入导致成功的 NiO-NP 合成由 FTIR 显示。 XRD 峰证实了 NiO 六方和面心立方 (fcc) 晶格，SEM 证实了具有立方和更多球形形态的 NP 的多形性，其平均尺寸为 16-52（姜掺杂）和 11-59 nm（大蒜掺杂）。然而，元素分析揭示了 EDS 和 XPS 分析的化学性质和键合状态，并提供了镍和氧的实际百分比，而紫外线分析验证了 350 nm 范围内的吸收峰差异，并在掺杂剂含量较高时引入了蓝移。与姜减少的 NPs 相比，植物化学大蒜减少了高浓度的 NiO 对 MDR S 的作用更强。金黄色葡萄球菌 以及有效地减少MB。因此，大蒜根提取物中绿色/植物化学还原的NiO可用于先进医学作为抗生素耐药性的替代品，以及在纺织工业中作为无环境危害的催化剂。

数据和材料的可用性

所有数据完全可用，不受限制。

缩写

EDS：

能量色散X射线光谱

fcc：

面心立方

FTIR：

傅里叶变换红外光谱

G +ve:

革兰氏阳性

G –ve:

革兰氏阴性

JCPDS：

粉末衍射标准联合委员会

MB：

亚甲蓝

Ni：

镍

NiO：

氧化镍

纳米：

纳米

NP：

纳米粒子

SEM：

扫描电镜

TEM：

透射电子显微镜

紫外可见光：

紫外可见光谱

XPS：

X射线光电子能谱

XRD：

X射线衍射