使用聚合物体优化新生猪胰岛样细胞簇的纳米封装

介绍

由于缺乏合适的供体，同种异体胰岛移植在治疗 1 型糖尿病中的应用受到限制。相反，动物胰岛在异种胰岛移植中的使用逐渐增加，猪成为最佳供体物种 [1]。当在移植过程中使用猪作为供体时，可以根据猪的年龄使用单独的胰岛。通常，新生猪胰岛样细胞簇 (NPCC) 比成年猪胰岛 (API) 更受青睐，因为它们价格合理且易于隔离。此外，NPCCs 可以在移植后逐渐增殖，延长其在体内的功能 [1, 2]。然而，当 NPCC 被移植到人类或非人类灵长类动物 (NHP) 的门静脉时，种间变异会引起免疫反应，如即时血液介导的炎症反应 (IBMIR) 或超急性排斥反应，导致早期移植物丢失 [3]。为了解决这个问题，需要封装可以抑制各种免疫反应的NPCCs。存在三种类型的封装：宏封装、微封装和纳米封装。宏观封装使用包含胰岛的装置，然后将胰岛植入血管周围以响应血糖水平通过半透膜释放胰岛素。微胶囊将少量胰岛装入多孔胶囊中。虽然这些封装可以保护胰岛免受免疫排斥，但在体内试验中已经报道了诸如膜塌陷或血栓生成等副作用。由于扩散距离的增加，胰岛还会干扰激素、营养物质或氧气的流动。纳米包封是细胞表面修饰诱导细胞与外源蛋白（主要是聚乙二醇（PEG））在输血中粘附的策略[4]。

使用 PEG 进行纳米封装已被广泛用作改进目标蛋白质或肽的功效和理化性质的修饰方法 [5]。特别是，胰岛的纳米封装可能对免疫细胞攻击和抗体识别具有抑制作用。 PEG 因其非免疫原性、抗原掩蔽和非污染效应等生物相容性特性而被广泛用于细胞包被[6]。在用于NPCCs纳米封装的纳米颗粒中，基于PEG-嵌段-聚丙交酯（PEG-b-PLA）的“聚合物囊泡”（PSomes）是最合适的，因为它们稳定且易于修饰；它们还可以在其组装中加入亲水性和疏水性试剂 [7, 8]。使用聚合物（含PEG）对胰岛进行表面修饰是通过胰岛细胞外基质（ECM）与官能团共轭聚合物之间的共价或非共价结合来实现的[9]。

在之前的研究中，碱性汉克平衡盐溶液（HBSS，pH 8.0）被用作胰岛纳米封装反应缓冲液，因为它能够促进 N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)-NH2 结合 [10,11,12]。然而，为了最大限度地减少纳米封装过程中对 NPCC 的细胞损伤，我们使用了具有生理 pH 值（pH 7.3）的 F-10 培养基（NPCCs 培养基）。此外，由于在纳米封装后保留 NPCC 的数量对于移植正确数量的细胞很重要，我们添加了牛血清白蛋白 (BSA)，它用长链聚合物覆盖细胞培养皿底部，以提高回收率率 [13]。在我们之前的研究中，NPCCs 与 PSomes 的纳米封装是通过单个官能团进行的，例如 NHS 或 NH2，分别用于诱导与 NPCCs 的 ECM 的共价结合或静电相互作用。然而，随着结合亲和力随着时间的推移而降低，需要提高结合效率的策略 [14]。具有双官能团的 PSome 可用作候选物，以提高涂层效率，因为它们具有聚集能力。因此，我们诱导了含有双官能团的 PSomes (NHS-/NH2-PSome) 之间的交联，它不仅可以与 NPCCs 的 ECM 结合，还可以通过共价相互作用或静电相互作用与每个 PSome 结合，从而提高纳米封装效率.

在本研究中，我们通过优化方法研究了纳米封装在NPCCs上的可能应用在猪胰岛异种移植领域。

材料和方法

动物

所有动物实验均经 MGENPLUS 研究所动物护理和使用机构委员会批准。有限公司（#2019-1），所有程序均按照委员会制定的指导方针进行。手术在全身麻醉下进行，并努力确保动物经历最小的疼痛。胰腺切除术前宰杀猪。

新生猪胰岛样细胞簇 (NPCC) 的分离

从 3 至 5 日龄的仔猪中分离出 NPCC。简而言之，使用氯胺酮（10 mg/kg，Yuhan，Seoul，Korea）和盐酸甲苯噻嗪（1mg/kg，Rompun；Bayer Korea，Seoul，Korea）麻醉仔猪，然后注射氯化钾将其杀死（ Sigma-Aldrich, MO, USA) 进入心脏。胰腺通过腹部切口暴露、收获并浸入含有 8.3 mM 碳酸氢钠、10 mM N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-( 2-乙磺酸）（HEPES）（Sigma-Aldrich，MO，USA）和 0.5% 抗生素抗真菌剂（Biowest，MO，USA）。胰腺被切成1-2毫米 ³ 片段并在 HBSS 中在 V 型胶原酶（1 mg/ml，Sigma-Aldrich，MO，USA）中消化 10 分钟。将含有 10% 胎牛血清 (FBS) (Biowest, MO, USA) 的冷 HBSS 添加到消化的胰腺组织中以停止酶活性。消化的胰腺组织在 HBSS 中洗涤，重悬后，组织通过 pluriStrainer 500 μm（pluriSelect，Leipzig，Germany）过滤并在 HBSS 中洗涤。最后，将 NPCC 在 37°C 的 5% CO2 中接种并培养在 F-10 培养基（Gibco，CA，USA）中，该培养基补充有 0.25% 牛血清白蛋白（BSA）（genDepot，TX，USA）、10 mM 烟酰胺、10 mM D-葡萄糖、2 mM L-谷氨酰胺、2 mM 二水氯化钙、50 μM 异丁基甲基黄嘌呤 (IBMX)、20 μg/ml 环丙沙星（Sigma-Aldrich，MO，美国）和 1% 抗生素抗真菌剂。 NPCC 培养 5 天 [15]，每天向培养基中添加 10 nM exendin-4（Prospec，Ness-Ziona，Israel）。

NPCC 和纳米封装 NPCC 的体外评估

培养后，NPCCs 的数量被计算为胰岛当量 (IEQ)，使用目镜标线在眼中。使用吖啶橙（AO，0.67 μM，Sigma-Aldrich，MO，USA）和碘化丙啶（PI，75 μM，Sigma-Aldrich，MO，USA）染色评估活力。为了进行葡萄糖刺激的胰岛素分泌 (GSIS) 测定，挑选 20-30 个 NPCC 并在 Krebs-Ringer 碳酸氢盐缓冲液 (KRBB) 中与低 D-葡萄糖 (2.8 mM) 浓度预孵育 1 小时。然后将 NPCC 与 KRBB 缓冲液中的低 D-葡萄糖（2.8 mM）孵育 1 小时，然后与 KRBB 中的高 D-葡萄糖溶液（28.0 mM）孵育 1 小时。收集上清液以测量低和高葡萄糖浓度下的胰岛素分泌 [11]。使用人/犬/猪胰岛素 Quantikine ELISA 试剂盒（R&D systems，MN，USA）测量每个样品分泌的胰岛素量。刺激指数 (SI) 的计算方法是将高葡萄糖 (28.0 mM) 下的胰岛素量除以低葡萄糖 (2.8 mM) 浓度下的胰岛素量。

聚合物体（PSome）的制备

为了制备 PSomes，N-羟基琥珀酰亚胺-聚（乙二醇）-嵌段-聚（丙交酯）共聚物（10 mg/ml，NHS-PEG-b-PLA）或胺-聚（乙二醇）-嵌段-聚（丙交酯）共聚物) 共聚物（10 毫克/毫升，NH2-PEG-b-PLA；Nanosoft 聚合物，北卡罗来纳州，美国）溶解在 1 毫升二甲基亚砜（DMSO，Sigma-Aldrich，MO，美国）中。除了制备双功能 PSome，溶解在 DMSO 中的每种共聚物（NHS 或 NH2-PEG-b-PLA）按比例混合。将蒸馏水 (DH2O) 加入聚合物溶液中，使终浓度为 1mg/ml。聚合物溶液在超声波发生器（Sea han Ultrasonic，Seoul，Korea）中超声处理 5 分钟。 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-四甲基吲哚二羰花青，4-氯苯磺酸盐（DiD；Biotium，CA，USA）在超声处理期间添加到聚合物溶液中以实现可视化。最后，将混合物在 DH2O 中透析 3 天。

纳米封装

PSome 在纳米封装反应缓冲液（HBSS（pH 7.3 或 pH 8.0）或不含补充剂的普通 F-10 培养基（pH 7.3 或 pH 8.0）中稀释，含或不含 0.25% BSA）。通过将 PSome 添加到培养基中的 NPCC 中进行纳米封装。为此，将 10,000 个 IEQ 的 NPCC 接种在 6 孔细胞培养皿（SPL，京畿道，韩国）中，并将稀释的 PSome 添加到 NPCC 中，并在 5% CO2 中在 37°C 下孵育 1 小时。在与实验组相同的条件下孵育阴性对照 (NC) 组（无 PSomes 的未包被的 NPCC）。孵育后，收获纳米包裹的NPCCs并在F-10培养基中培养。

纳米封装 NPCC 的效率

使用荧光显微镜（Leica，Wetzlar，Germany）或共聚焦激光扫描显微镜（CLSM；Carl Zeiss，Oberkochen，Germany）对 DiD 结合的 PSome 纳米封装的 NPCC 进行可视化。通过使用 ImageJ 软件（NIH，Bethesda，USA）计算平均荧光强度（MFI）来量化 DiD 偶联的 PSome 结合的 NPCC 的强度。细胞核用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）复染。

聚合物渗透性测定

将 F-10 或 F-10（0.25% BSA）中 NHS-PSome 纳米封装的 NPCC 与不同分子量（10、20、70 和 250 kDa）的异硫氰酸荧光素 (FITC) 偶联的葡聚糖一起孵育 2 小时.通过共聚焦激光扫描显微镜确认了每个分子量的FITC-共轭葡聚糖对NHS-PSome纳米包封NPCCs的渗透。

聚合物细胞活力测定

RPMI 1640（Biowest，MO，USA）中的 NHS-PSome 纳米封装 THP-1（人单核细胞系）孵育 1 小时。根据MTT细胞增殖测定试剂盒（iNtRon Biotechnology，Seongnam-si，Korea）中提供的方案测量NHS-PSome纳米封装的THP-1的活力。

统计分析

未配对 t 检验在 GraphPad Prism 6.0 中进行。统计显着性用*、** ***和****表示，表示P 值 ≤ 0.05、 ≤ 0.01、 ≤ 0.001和 ≤ 0.0001。

结果

NPCC 的培养和功能评估

NPCC 培养了 5 天，并进行了质量控制，包括活力和 GSIS。 NPCC 的总数为 21,014.0 IEQ/g/胰腺。使用 AO/PI 染色的存活率为 89.9%。 GSIS 用于确认 NPCC 对葡萄糖浓度的反应性，其平均刺激指数 (SI) 为 2.3（表 1，附加文件 1：图 S1）。

NPCC 的高效纳米封装所需的 PSome 浓度

为了确定有效纳米封装所需的 PSome 浓度，我们向 NPCC 添加了不同浓度的 NHS-PSome。 NHS-PSome 在 DH2O 中以 1 mg/ml 的浓度储存，并以 1:5、1:10、1:20 和 1:40 稀释，最终浓度范围为 0.2 至 0.025 mg/ml。纳米封装效率通过负载 DiD 的 PSome 纳米封装 NPCC 的 MFI 测量。 0.1 mg/ml（1:10 稀释）终浓度在纳米封装后 2 天显示出最高的荧光强度（图 1a 和 b），随后在该浓度下对 NPCC 进行纳米封装。

优化 PSome 浓度以在 0 天和 2 天进行有效的纳米封装。优化 PSome 浓度以实现有效的纳米封装。 一 加载了 DiD 的 NHS-PSome 在 NPCC 中以不同浓度（BF；明场）进行处理。比例尺代表 200 μm。 b 负载 DiD 的 PSome 纳米封装 NPCC (n =3) 和 NC 控制 (n =1)

提高了具有生理 pH 值的 F-10 介质中纳米封装的效率

胰岛（含有 NPCC）的纳米封装通常在碱性 HBSS 缓冲液（pH 8.0 或更高）中进行，以增强胰岛 ECM 中的 NH2 与聚合物中结合的 NHS 之间的结合亲和力。然而，基本 HBSS 缓冲区中的纳米封装可能会损坏 NPCC。因此，为了尽量减少 NPCCs 的损伤并确定 pH 值对 NHS-NH2 结合的影响，NPCCs 通过 NHS-PSome 纳米封装在 HBSS 缓冲液或普通 F-10 培养基（本研究中用于培养 NPCCs）具有 pH 值分别为 7.3（生理）或 pH 8.0（基本）。当NPCCs在F-10中进行纳米封装时，NPCCs的正常形态得以保持（图2a），并且与HBSS组相比，无论第0天的pH值如何，基于MFI的纳米封装效率均显着提高和 6（图 2b）。尽管 HBSS 组在第 6 天的 pH 值 7.3 和 8.0 之间显示出显着差异，但与 F-10 组相比，纳米包封强度显着降低。因此，我们在后续实验中使用生理性F-10培养基（pH 7.3）作为纳米包封反应缓冲液，以尽量减少NPCCs的潜在损伤。

不同反应缓冲液中纳米封装在第 1 天和第 6 天的涂层效率比较。纳米封装在各种反应缓冲液中的包覆效率比较。 一 HBSS（pH 7.3 和 pH 8.0）或 F-10（pH 7.3 和 pH 8.0）中的纳米封装 NPCC，使用 DiD 偶联的 NHS-PSome（BF；明场）。比例尺代表 200 um； b HBSS（pH 7.3 和 pH 8.0）或 F-10（pH 7.3 和 pH 8.0）中使用 DiD 偶联的 NHS-PSome（所有组；n =3)。数据代表平均值 ± 标准偏差。 *p <0.05, ***p <0.001 和 ****p <0.0001 对比其他组

纳米封装后NPCCs的回收率提高

尽管 F-10 中 NPCCs 的细胞损伤最小化，但纳米封装后收集的 NPCCs 数量显着减少。为了解决这个问题，我们在使用 NHS-PSome 的 NPCCs 培养和纳米封装过程中向 F-10 培养基中添加了 0.25% BSA。我们初步确认了在 F-10 培养基中加入 0.25% BSA 是否会影响包被效率和选择性渗透性，允许小分子（10 和 20 kDa FITC 偶联的葡聚糖）通过，同时阻止大分子（70 和 250 kDa FITC 偶联的葡聚糖） dextran)，作为 PSome 的基本功能。结果，在 CLSM 的图像中显示了保形涂层（图 3a，中），并且选择性渗透性在 NHS-PSome 纳米封装的 NPCC 中保持正常（图 3b，FITC 共轭葡聚糖），其中 F-10 含有 0.25 % BSA 与 F-10 相比，尽管 MFI 略有降低（图 3b）。纳米封装后收集的 NPCC 量在含有 0.25% BSA 的 F-10 中显示出显着更高的回收率（71.9%），而不是在不含 BSA 的 F-10（42.3%）中（图 3c）。纳米封装后，F-10 中含有 0.25% BSA 的 NPCCs 的活力（NC：89.5%，NHS-PSome：90.3%）和葡萄糖刺激的胰岛素分泌（NC：2.1，NHS-PSome：1.6）也保持不变（图） . 4a、b，附加文件 1：图 S2)。结果表明，0.25% BSA的加入可显着提高NPCCs纳米包封后的回收率，且不影响PSome的包覆效率或功能。

在纳米封装反应缓冲液中添加 0.25% BSA 以提高回收率后的涂层效率比较。在纳米封装反应缓冲液中添加 0.25% BSA 以提高回收率后的涂层效率比较。 一 在 F-10 或 F-10 中使用 NHS-PSome 的纳米封装 NPCCs 的涂层效率和选择性渗透率和 0.25% BSA（BF；明场，中；使用 DiD 共轭 NHS-PSome 纳米封装 NPCC 的 CLSM 的中间图像， FITC 共轭葡聚糖；中间图像使用 FITC 共轭葡聚糖在 NHS-PSome 纳米封装的 NPCC 中的 CLSM。 Mid中的蓝色代表通过DAPI染色的细胞。比例尺为 200（BF 和 DiD）和 100（Mid 和 FITC 共轭葡聚糖）μm； b 使用 DiD 共轭 NHS-PSome 的纳米封装 NPCC 的 MFI； c F-10纳米封装后NPCC的回收率（n =12) 或 F-10 与 0.25% BSA (n =12)。数据代表平均值 ± 标准偏差。 *p <0.05 对比 F-10

使用 F-10 和 0.25% BSA 的 NHS-PSome 纳米封装 NPCC 的可行性和功能。使用 F-10 和 0.25% BSA 的 NHS-PSome 纳米封装 NPCC 的可行性和功能。 一 NHS-PSome 纳米封装 NPCCs (n =6) 和 NC 控制 (n =6); b NHS-PSome 纳米封装 NPCC 的 SI (n =5) 和 NC 控制 (n =5)。数据代表平均值 ± S.D

通过交联 PSomes 增强纳米封装的稳定性

为了诱导更稳定的 NPCC 纳米封装，我们尝试结合具有两个不同官能团的 PSome。首先，我们通过在一个 PSome 中同时添加不同比例的含有 NHS 和 NH2 双官能团的 PSome（NHS-/NH2-PSome）对 NPCC 进行纳米封装（方案 1）。纳米封装的效率通过在 PSome 纳米封装的 NPCC 中共轭的 DiD 的 MFI 得到证实。在第 0 天，来自荧光显微镜的图像显示，在 9:1、5:5 和 1:9 组的 NHS-/NH2-PSome 纳米封装 NPCC（9:1、5:5、1:9）之间没有显着差异和天（图 5a）。然而，在 CLSM 结果中，第 1 天，5:5 组似乎有涂层，1:9 显示涂层不足，而 9:1 组形成了保形涂层（图 5b）。因此，我们确定 PSome 中 NHS-/NH2 的最佳比例为 9:1。当对 9:1 组进行功能测定时，我们的结果表明，与 NC 对照 (92.1%) 相比，9:1 组的存活率显着降低，但存活率保持在正常水平 (87.8 %）。 9:1组SI功能正常（3.0），与NC对照组（3.7）相比（图5c，d）。

PSomes交联提高纳米包封稳定性的说明

NHS-/NH2-PSome 纳米封装 NPCC 的涂层效率和功能。 NHS-/NH2-PSome 纳米封装 NPCC 的涂层效率和功能。 一 DiD 共轭 9:1、5:5、1:9 的 NHS-/NH2-PSome 纳米封装的 NPCC（9:1、5:5、1:9）（NC；未涂覆的 NPCC）。 MFI 显示了 DiD 共轭 PSome 纳米封装的 NPCCs (n =3) 和 NC 控制 (n =3)。比例尺代表 200 um； b DiD 共轭 NHS-/NH2-PSome 纳米封装 NPCC 的 CLSM（中；中间图像使用 DiD 共轭 NHS-/NH2-PSome 纳米封装 NPCC 的 CLSM）。 Mid中的蓝色代表通过DAPI染色的细胞。比例尺代表 100 um； C. 9:1 (n =9) 和 NC 控制 (n =3)。数据代表平均值 ± 标准偏差。 **p <0.01 与 NC 相比； D. 9:1 的 SI (n =9) 和 NC 控制 (n =3)。数据代表平均值 ± S.D

讨论

糖尿病，俗称糖尿病，是一种以高血糖为特征的代谢性疾病。 1 型糖尿病是由于胰腺中的 β 细胞无法产生足够的胰岛素所致 [16]。含有产生胰岛素的 β 细胞的胰岛移植最近已被用于治疗 1 型糖尿病。然而，由于供体短缺，同种异体胰岛移植受到限制；相反，使用来自非人类动物的胰岛进行异种移植已成为供体组织的替代来源。由于它们与人类的生理相似性、易于大规模繁殖以及可在无病原体设施中繁殖，猪被认为是异种胰岛移植的最佳动物模型 [1]。尤其是，NPCC 的使用价值与 API 一样好。尽管 NPCCs 的成熟度低于 APIs，但 NPCCs 与 APIs 相比具有一些优势，包括具有相对简单和廉价的胰岛分离程序，能够在移植后对缺氧环境产生抗性和体内增殖 [1,2,3] .由于这些原因，我们在本研究中使用3-5天龄的新生猪作为胰岛来源。

不幸的是，一旦将猪胰岛植入人类或非人类灵长类动物的血管中，就会经常发生严重的免疫反应，例如 IBMIR 或超急性排斥反应。 IBMIR 通常由猪胰岛中表达的几种组织因子 (TF) 引起，这些组织因子通过激活外在途径介导人血管中的凝血。在猪细胞表面表达的 α-半乳糖或非 gal 抗原也可以成为天然人类抗体的靶标，然后是称为超急性排斥反应的互补级联激活。因此，在缺氧后，凝血途径形成凝块，宿主体内补体激活导致细胞死亡，导致移植物丢失 [3]。为了解决这些问题，已经尝试了封装，一种用生物相容性材料涂覆胰岛的方法，以保护它们免受抗体或补体反应的攻击。首先，宏观封装使用一种带有包含胰岛的半透膜的装置，并植入血管旁边，在那里它会根据血糖水平将胰岛素释放到血流中 [4]。其次，微囊化，主要使用海藻酸盐，具有选择性渗透性，可以让氧气和营养物质通过其多孔表面，同时阻断多种细胞因子和免疫细胞浸润。然而，因为无论胰岛的大小如何，它们都使用相同大小的胶囊，所以很难对胰岛进行保形包衣。此外，可能会发生纤维化，在移植后包围移植物 [17]。最后，胰岛的表面改性（纳米封装）主要使用聚乙二醇（PEG），它具有“隐形”特性，可以阻断涂有“隐形”聚合物（PEG）的材料与血液中的成分（免疫细胞）相互作用。体内 [11, 18]。我们的 NPCCs 纳米封装策略使用改性 PEG 共聚物（PEG-b-PLA、Polymersome、PSome）。此外，Psome 具有亲水性和疏水性，可以结合免疫抑制剂或参与细胞分化或生长的因子[8]。

已在碱性 HBSS 缓冲液（pH 8.0 或更高）中使用 PEG 对胰岛进行纳米封装，以增强 PEG 上的 NHS 与胰岛 ECM 上的 NH2 之间的结合亲和力 [10,11,12]。然而，由于这些条件不能提供合适的细胞培养环境，我们尝试在模拟 NPCC 培养条件的环境中进行纳米封装。为了解决上述问题，我们测试了普通 F-10 培养基、NPCCs 培养基，生理 pH 值（无任何补充剂）用作纳米封装反应缓冲液。与使用碱性 HBSS 缓冲液的培养条件相比，在具有生理 pH 值的 F-10 中进行纳米封装显示出相似的包被效率并保持了 NPCC 的正常形态（图 3）。因此，我们可以提出一个平台，在模拟NPCC培养环境中最大限度地减少纳米封装过程中NPCC的损伤。

虽然建立了最大限度地减少 NPCC 损伤的纳米封装方法, 但当在培养皿中进行纳米封装时, 纳米封装后收集的 NPCC 残留量减少。这意味着您需要更多的 NPCC 来进行纳米封装以进行移植。根据之前的报道，在分离过程中使用 BSA 提高了一些小鼠品系的胰岛产量 [19]。此外，通过在大鼠肝癌细胞培养物中预涂细胞培养皿的表面，将 BSA 用作悬浮培养物 [13]。因此，为了增加纳米封装后NPCCs的量，在F-10纳米封装反应缓冲液中加入0.25%的BSA，与用于培养NPCCs的BSA浓度相同。因此，纳米封装后 NPCC 的回收率显着增加（图 4）。这意味着可以通过最小化胰岛（包含 NPCC）的损失来预测和移植纳米封装后正确数量的胰岛（包含 NPCC）。总之，这项使用 F-10 和 0.25% BSA 进行纳米封装的研究表明，(i) NPCCs 的正常形态得以维持，(ii) NHS 偶联的 PSome 和 NH2 在 NPCCs 的 ECM 中的结合不受干扰，并且(iii)纳米封装后NPCCs的回收率增加。

最后，我们试图通过 (i) PSomes 之间的共轭和 (ii) PSomes 和 NPCCs 的 ECM 之间的结合来增强纳米封装的稳定性。首先，NHS- 和 NH2-PEG-b-PLA 聚合物按比例混合以形成双功能 PSome（NHS-/NH2-PSome），它可以与 NPCC 的 PSome 和 ECM 结合。我们假设，由于具有相同官能团（NHS-NHS 和 NH2-NH2）的 PSomes 之间的结合可能导致中断，因此可以通过一个 PSome 内的双官能团有效地实现缀合，而不是将两个具有单官能团的 PSomes 缀合。从结果可以看出，NPCCs 的保形涂层以 9:1 的 NHS-/NH2-PSome 纳米封装 NPCCs 的比例实现，并保持了活力和功能性（图 5）。然而，需要进一步的研究来量化 PSome 键的强度，以证明双功能 PSome 的纳米封装比单功能 PSome 的封装更稳定。因此，我们建议模拟NPCC培养环境的有效纳米封装条件可用于使用含有NPCCs的胰岛的纳米封装策略（附加文件1）。

结论

本研究旨在确定使用基于 PEG 的聚合物囊泡 (PSomes) 对胰岛 (NPCC) 进行纳米封装的最佳方法。首先，与使用碱性 HBSS 缓冲液（pH 8.0）相比，使用 pH 为 7.3 的 F-10 培养基可以在纳米封装后保持 NPCC 的正常形态，从而最大限度地减少封装过程中对 NPCC 的损伤。其次，在 F-10 培养基中添加 0.25% BSA 将纳米封装后 NPCC 的产量提高了大约 1.7 倍。最后，我们通过双功能 PSomes (NHS-/NH2-PSomes) 的共轭诱导了更稳定的纳米封装。本文提出的纳米包封方法可能适用于基于PEG的纳米颗粒对胰岛的纳米包封。

数据和材料的可用性

不适用。

缩写

DiD：

1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate salt

AO:

Acridine orange

APIs:

Adult porcine islets

BSA：

牛血清白蛋白

BF：

Bright field

CLSM：

共聚焦激光扫描显微镜

DAPI：

4′,6-Diamidino-2- phenylindole

DMSO：

二甲亚砜

DH2O:

Distilled water

ELISA：

酶联免疫吸附试验

FBS：

胎牛血清

FITC:

Fluorescein isothiocyanate

GSIS:

Glucose-stimulated insulin secretion

HBSS:

Hank’s balanced salt solution

IBMIR:

Instant blood-mediated inflammatory reaction

IEQ:

Islet equivalent

IBMX:

Isobutylmethylxanthine

KRBB:

Krebs–Ringer bicarbonate buffer

MFI：

Mean fluorescence intensity

HEPES:

N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid)

NC：

阴性对照

NPCCs:

Neonatal porcine islet like cell clusters

NHS：

N-羟基琥珀酰亚胺

NHP:

Non-human primate

PLA:

Poly lactide

PEG：

Polyethylene glycol

PSomes:

Polymersomes

PI：

碘化丙啶

SI：

Stimulation index

TF:

Tissue factor