基于PEG-b-PLA聚合物囊的新生猪胰岛样细胞团高效纳米包裹

摘要

本研究证实了利用聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物（PEG-b-PLA）形成的聚合物囊（PSomes）对新生猪胰岛样细胞团（NPCCs）进行纳米包裹的方法。我们建立了一种高效的纳米包裹流程，将NPCCs的损伤和损失降至最低。通过在聚合物囊N端引入N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），诱导其与NPCCs周围细胞外基质（ECM）上的氨基结合；采用含牛血清白蛋白（BSA）的F-10培养基作为反应缓冲液，进一步减少包裹过程中的细胞损伤与损失；最后利用双功能聚合物囊（NHS-/NH₂-PSomes）之间的交联反应，实现高效包裹。结果显示，pH 7.3、含0.25% BSA的F-10培养基较碱性HBSS缓冲液（pH 8.0）显著降低了纳米包裹后NPCCs的损伤与损失；双功能聚合物囊的共轭交联进一步提升了包裹效率与稳定性。

引言

同种异体胰岛移植治疗1型糖尿病受限于合适供体短缺，异种胰岛移植逐渐增加，猪成为最佳供体来源。新生猪胰岛样细胞团（NPCCs）因获取成本低、分离容易、移植后可增殖延长功能，优于成年猪胰岛（APIs）。但异种移植易引发即时血液介导炎症反应（IBMIR）或超急性排斥，导致早期移植物丢失。胰岛包裹技术可抑制免疫反应，分为宏包裹、微包裹和纳米包裹。前两者虽能保护胰岛，但存在膜塌陷、血栓形成及扩散距离增加阻碍营养氧气交换等副作用。纳米包裹通过细胞表面修饰，引入聚乙二醇（PEG）等外源蛋白，具有免疫原性低、抗原屏蔽、抗污染等生物相容性优势。

基于PEG-b-PLA的聚合物囊（PSomes）因结构稳定、易修饰、且能同时负载亲水疏水物质，成为NPCCs纳米包裹的理想纳米载体。以往研究常用碱性HBSS（pH 8.0）作为反应缓冲液以促进NHS-NH₂结合，但该环境易损伤细胞。本研究采用生理pH（7.3）的F-10培养基模拟NPCCs培养环境，并添加0.25% BSA包被培养皿底部减少细胞吸附损失。此外，针对单一功能基团结合亲和力随时间下降的问题，引入双功能基团聚合物囊（NHS-/NH₂-PSomes），通过聚合物囊间的共价及静电交联，增强包裹稳定性与效率。

材料与方法

动物实验

所有动物实验经MGENPLUS公司机构动物护理使用委员会批准（编号#2019–1），按指南操作，全麻下进行，尽量减轻疼痛，胰腺切取前实施安乐死。

新生猪胰岛样细胞团（NPCCs）分离

从3-5日龄仔猪分离NPCCs。仔猪经肌注 ketamine（10 mg/kg）和 xylazine（1 mg/kg）麻醉后，注射氯化钾致死。胰腺经腹部切口暴露、取出，置于含碳酸氢钠、HEPES、抗生素的HBSS中。胰腺切碎为1-2 mm³小块，用I型胶原酶（1 mg/ml）消化10分钟，加含10% FBS的冷HBSS终止消化。经HBSS洗涤、500 μm筛网过滤后，悬浮于含0.25% BSA、烟酰胺、葡萄糖、谷氨酰胺、氯化钙、IBMX、环丙沙星、抗生素的F-10培养基中，37℃、5% CO₂培养5天，每日添加10 nM exendin-4。

NPCCs及纳米包裹NPCCs的体外评价

培养5天后，用目镜测微尺计数IEQ数。采用荧光素（AO，0.67 μM）和碘化丙啶（PI，75 μM）染色评估活性。葡萄糖刺激胰岛素分泌（GSIS）实验：20-30个NPCCs预培养于低葡萄糖（2.8 mM）Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液（KRBB）1小时，依次经低、高葡萄糖（28.0 mM）KRBB孵育各1小时，收集上清液测胰岛素（人/犬/猪胰岛素ELISA试剂盒），刺激指数（SI）=高糖/低糖胰岛素分泌量比值。

聚合物囊（PSome）制备

将NHS-PEG-b-PLA或NH₂-PEG-b-PLA（10 mg/ml）溶于DMSO（1 ml），制备双功能PSome时按比例混合两种聚合物。加蒸馏水稀释至终浓度1 mg/ml，超声5分钟，期间加入DiD荧光探针便于观察，最后透析3天。

纳米包裹操作

PSome稀释于不同反应缓冲液：HBSS（pH 7.3或8.0）、无添加剂F-10（pH 7.3或8.0），含或不含0.25% BSA。6孔板播种10,000 IEQ NPCCs，加入稀释PSome，37℃、5% CO₂孵育1小时。阴性对照（NC）组不加PSome，同条件孵育。收获后置于F-10培养基继续培养。

纳米包裹效率评估

荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察DiD标记PSome包裹NPCCs，用ImageJ软件计算平均荧光强度（MFI）量化包裹效率。细胞核用DAPI对比染色。

聚合物囊通透性检测

F-10或F-10+0.25% BSA中NHS-PSome包裹的NPCCs，与不同分子量（10, 20, 70, 250 kDa）FITC-葡聚糖孵育2小时，CLSM观察穿透情况。

聚合物囊细胞活性检测

RPMI 1640中NHS-PSome包裹THP-1细胞（人单核细胞系）1小时，用MTT法检测活性。

统计分析

GraphPad Prism 6.0行配对t检验，*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001，****P≤0.0001。

结果

NPCCs培养与功能评价

NPCCs培养5天，总产量21,014.0 IEQ/g胰腺，AO/PI染色活性89.9%，GSIS刺激指数（SI）平均2.3（表1，附件Fig.S1）。

高效纳米包裹所需PSome浓度优化

测试不同浓度NHS-PSome（0.2-0.025 mg/ml）包裹NPCCs，以DiD荧光MFI评价。0.1 mg/ml（1:10稀释）在第2天显示最高荧光强度（Fig.1a,b），后续实验采用该浓度。

生理pH F-10培养基提升包裹效率并减少细胞损伤

对比HBSS（pH 7.3/8.0）与F-10（pH 7.3/8.0）作为反应缓冲液。F-10组NPCCs形态正常（Fig.2a），MFI显著高于HBSS组（第0、6天），无论pH（Fig.2b）。HBSS组pH 7.3与8.0在第6天差异显著，但整体包裹强度低于F-10组。确立生理pH F-10（pH 7.3）为最佳反应缓冲液。

添加0.25% BSA显著提高NPCCs回收率

F-10中虽减少损伤，但收获NPCCs量大幅下降。加入0.25% BSA（同培养浓度）后，CLSM显示包裹依然均匀（Fig.3a Mid），选择性通透性维持正常（10/20 kDa FITC-葡聚糖通过，70/250 kDa阻挡，Fig.3b），MFI略降但无显著差异。回收率从42.3%（无BSA）跃升至71.9%（有BSA）（Fig.3c）。活性（NC 89.5% vs 包裹 90.3%）和GSIS（NC SI 2.1 vs 包裹 1.6）均维持良好（Fig.4a,b，附件Fig.S2）。证明0.25% BSA能大幅提升回收率，不影响包裹效率与功能。

双功能聚合物囊交联增强纳米包裹稳定性

同时加入不同比例NHS-/NH₂-PSome（9:1, 5:5, 1:9）包裹NPCCs（Scheme 1）。荧光显微镜MFI三组第0、1天无显著差异（Fig.5a），但CLSM显示5:5组过度包裹、1:9组包裹不足，9:1组形成均一贴合包裹层（Fig.5b 第1天）。确定最佳比例9:1。功能检测：9:1组活性（87.8%）虽显著低于NC（92.1%）但处于正常范围，SI（3.0）接近NC（3.7）（Fig.5c,d）。

讨论

1型糖尿病源于胰岛β细胞分泌胰岛素不足。异种胰岛移植中，猪因生理相似、易规模化繁育、无病原设施成熟成首选。NPCCs虽成熟度低于APIs，但分离简便廉价、耐缺氧、移植后增殖，优势明显。异种移植面临IBMIR（猪胰岛组织因子激活外源凝血通路）及超急性排斥（α-gal/非gal抗原激活补体）导致移植物缺血坏死。包裹技术应运而生：宏包裹用半透膜装置；微包裹多用海藻酸盐，但难贴合胰岛大小、易致纤维化；纳米包裹利用PEG“隐身效应”屏蔽免疫识别。本研究用PEG-b-PLA聚合物囊，兼具亲疏水性，可负载免疫抑制剂或生长因子。

传统纳米包裹用碱性HBSS（pH≥8.0）促进NHS-ECM氨基结合，但非生理环境损伤细胞。本研究用无添加剂F-10（pH 7.3）模拟培养环境，包裹效率相当且形态正常（Fig.3讨论中引用Fig.2），建立低损伤包裹平台。但培养皿中包裹后NPCCs残留量低，需更多细胞移植。文献显BSA可提高分离产量、包被培养皿减少细胞吸附。本研究在F-10中加0.25% BSA，回收率显著提升（Fig.4），实现包裹后细胞量精准预测移植。总结：F-10+0.25% BSA（i）维持形态，（ii）不干扰NHS-ECM结合，（iii）提高回收率。

进一步通过双功能PSome交联增强稳定性：NHS/NH₂-PEG-b-PLA按比例混合形成双功能PSome，同时结合ECM与PSome间交联。假设单囊双功能基比双囊单功能基交联更高效（避免同性基团自聚干扰）。9:1比例达成贴合包裹，活性功能维持（Fig.5）。后续需量化PSome键合强度，证实双功能优于单功能稳定性。建议该模拟培养环境的高效纳米包裹条件适用于含NPCCs胰岛的异种移植策略。

结论

本研究确立基于PEG聚合物囊的胰岛（NPCCs）最优纳米包裹方法：1）生理pH（7.3）F-10培养基较碱性HBSS（pH 8.0）维持NPCCs正常形态，最小化包裹损伤；2）添加0.25% BSA使包裹后NPCCs产量提升约1.7倍；3）双功能PSome（NHS-/NH₂-PSomes）交联实现更稳定包裹。该方法可推广至PEG基纳米颗粒的胰岛纳米包裹应用。