原位电纺姜黄素纳米纤维：双重抗菌作用高效灭杀耐药细菌

摘要

细菌感染尤其是多重耐药菌感染严重威胁人类生命。光动力疗法（PDT）可高效杀菌，纳米纤维基PDT能有效减少对正常组织损伤。但传统方法将光敏剂涂覆于纤维表面易脱落至伤口引起副作用，且传统制备纳米纤维在创面粘附性差，因PDT短程效应严重降低疗效。本研究利用自制便携式电纺装置，通过原位电纺法制备核壳结构姜黄素复合纳米纤维。所得复合纳米纤维在不同生物表面表现出优于传统制法的粘附性。808 nm激光照射下，复合纳米纤维高效产生单线态氧（¹O₂）且姜黄素不脱落。接触耐药菌后，展现双重抗菌行为，高效杀灭耐药菌。这种具优异粘附性的双重抗菌纳米纤维膜有望作为抗菌敷料用于伤口感染治疗。

背景

细菌感染若不及时治疗将引发败血症，严重危及生命健康。抗生素长期使用导致耐药菌产生，如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA），是常见伤口感染菌。需寻找安全杀菌且不诱导耐药策略。PDT已证实为有效灭菌手段，但多数光敏剂需紫外或短波长激发，穿透深度浅且严重灼伤组织。近红外（NIR）光穿透深，开发NIR激发光敏剂是趋势。上转换纳米颗粒（UCNPs）可将NIR光转为短波长光，作为波长转换站激发光敏剂产生¹O₂。但前人多制备光敏剂包覆纳米颗粒结构，外层光敏剂易脱落，直接接触组织产生副作用（如抑制胶原生长）。实际上光敏剂靠产生¹O₂杀菌，无需直接接触细菌或组织，故可设计间隔层隔离光敏剂避免副作用。

电纺是制备有机/无机纳米纤维快速高效方法。纳米纤维制备中纳米颗粒易与纤维结合形成复合纤维，主要两法：掺杂入纤维内部或负载于纤维表面。考虑隔离光敏剂，掺入内部优于表面负载。但疏水纤维不利渗透，¹O₂难产生扩散至表面发挥抗菌；亲水纤维易被组织液溶解。因此需将NIR光敏剂与纳米纤维结合，确保光动力纳米纤维高效杀菌，尤其耐药菌。

本研究选姜黄素作光敏剂（生物提取来源广），核壳UCNPs作波长转换站（高转换效率产生¹O₂）。利用自制电纺装置通过原位电纺法制备UCNPs@姜黄素复合纳米纤维。该法制得纤维在不同生物表面粘附性优于传统电纺法。808 nm照射下高效产生¹O₂且姜黄素不脱落。污染MRSA后展现双重抗菌行为高效杀灭耐药菌。

方法

材料

氯化铥、氯化镱、氯化钕、氯化钇购自Sigma-Aldrich。甲醇、乙醇、环己烷、姜黄素、二氯甲烷、丙酮、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚己内酯（PCL）、聚乙烯亚胺（PEI）购自国药试剂。均无需纯化直接使用。

核壳NaYF₄:Yb/Tm@NaYF₄:Nd@姜黄素合成

共沉淀法合成UCNPs（NaYF₄:Yb/Tm@NaYF₄:Nd）。后取200 mg UCNPs、90 mg PEI、180 mg姜黄素溶于亚甲基二氯甲烷，室温搅拌20 h，离心纯化、乙醇洗涤两次。

原位电纺制备姜黄素复合纳米纤维

1 g PCL、0.16 g PVP、0.1 g NaYF₄:Yb/Tm@NaYF₄:Nd@姜黄素溶于5 mL丙酮，搅拌12 h得均匀前驱液。取3 mL装入5 mL注射器，用自制手持电纺设备电纺：0.4 mm金属针头、两节碱性电池、高压转换器将3 V转10 kV。收集距离约10 cm。

¹O₂生成检测

用单线态氧传感器绿（SOSG）检测。9×9 mm复合纤维膜放入石英比色皿，加3 mL含25 μM SOSG甲醇溶液。808 nm激光不同时间照射，荧光分光光度计（激发波长504 nm）测荧光强度反映¹O₂水平。

抗菌实验

用耐药菌MRSA和大肠杆菌评价抗菌能力。菌株胰蛋白大豆肉汤培养基37 °C培养15 h，浓度调至1×10⁶ CFU/mL。96孔板每孔加100 μL菌液，放入直径6 mm圆形纤维膜。808 nm激光照射20 min后，菌液用无菌水稀释10倍，取10 μL涂布营养琼脂平板，37 °C恒温培养18 h拍照。对照组同步骤但无激光照射。每组重复5孔。

表征

TEM/SEM（JEM-2010、SU-1510）；荧光光谱（Edinburgh FLS1000）；吸收光谱（Shimadzu UV2550）；FTIR（Nicolet iS50）；Zeta电位（WJL-608）；亲水性（PT-602A静滴法）。

结果与讨论

纳米颗粒与复合纳米纤维表征

图1a显示UCNPs TEM像，均匀尺寸分布，平均直径~45 nm。Zeta电位+19 mV（附件Fig.S1）。包覆姜黄素后呈核壳结构（图1b），姜黄素壳厚~5 nm。核壳颗粒嵌入PCL/PVP纤维，自制手持电纺装置制得连续无断裂纳米纤维（图1c），直径~400 nm，均匀度与传统装置相当（附件Fig.S2）。便携装置由两节1.5 V干电池供电（附件Fig.S3），重160 g、体积小，摆脱市电限制，利于户外使用。TEM（图1d）显示颗粒在纤维中分散良好。

NaYF₄:Nd壳层包覆NaYF₄:Yb/Tm核可增强光致发光（图2a）。UCNPs荧光谱与姜黄素UV-Vis吸收谱重叠良好（图2b），更强光致发光可向姜黄素转移更多能量，利于光敏剂激发。且NIR 808 nm比980 nm穿透组织更深，引入NaYF₄:Nd壳层将激发波长从980 nm调节至808 nm（附件Fig.S4），减少正常组织灼伤。FTIR（图2c）显示复合颗粒（橙线）在1628 cm⁻¹（C=O）、1282 cm⁻¹（C–O）、1028 cm⁻¹（C–O–C）有伸缩振动，源自姜黄素（绿线）；1125 cm⁻¹（C–N）源自PEI（蓝线）。分子结构图见附件Fig.S5。~1660 cm⁻¹弱C=C对应合成UCNPs时油酸。证实UCNPs@姜黄素复合纳米纤维成分。

图2d显示包覆姜黄素前后UCNPs荧光衰减曲线。荧光寿命从700 μs降至390 μs。按γ = 1 – τ₂/τ₁（τ₁、τ₂为包覆前后寿命）计算能量转移效率γ = 44.3%。高效率归因于：①姜黄素吸收谱与UCNPs发光谱重叠好，发生非辐射能量转移；②NaYF₄:Nd壳层增强发光强度，增加光谱重叠积分面积；③姜黄素与UCNPs距离为包覆厚度（<5 nm），有利高效荧光共振能量转移（FRET）。44.3%能量转移效率有利后续高效产生¹O₂。

复合纳米纤维产生¹O₂

SOSG法评价产生¹O₂能力。固定掺杂浓度下观察不同时间¹O₂生成（图3a）：如0.20 wt%，照射时间越长产生越多，但速率逐渐减缓，20 min后趋于平稳，曲线间隔密集。可能因持续NIR照射产生¹O₂快速消耗局部氧气，局部氧浓度降低导致生成速率下降。固定照射时间（如20 min）考察掺杂浓度影响（图3b）：浓度增加¹O₂增多，但>0.20 wt%时上升放缓。实验表明无需无限增加照射时间和浓度，最优选择0.20 wt%、20 min，后续实验采用此条件。

原位电纺纳米纤维膜润湿性与粘附性

考虑产生¹O₂需UCNPs@姜黄素与体液氧气相互作用，测试接触角（图4a）：水滴滴于复合纤维膜表面20 s润湿性优于纯PCL膜（图4b）。浸泡磷酸缓冲液（PBS）后吸收光谱未检测到UCNPs@姜黄素，说明姜黄素未从纤维脱落。原因可能是姜黄素包覆于UCNPs，尺寸~50 nm过大无法穿透纤维。相比光敏剂直接包覆颗粒/纤维，先增大姜黄素尺寸再掺入亲水纤维可有效避免脱落，增强¹O₂生成扩散。此外，PDT短程效应及传统电纺纤维膜创面粘附差（图4c，附件Fig.S6）会因间隙影响光动力效应。幸而原位电纺法制得形貌良好（图1c）且在不同物体表面粘附性好（图4d）。说明原位电纺沉积法制备光动力纤维膜优于传统法（收集于箔上再压覆创面）。

姜黄素复合纳米纤维双重抗菌效应

MTT实验证实纳米复合纤维无毒（附件Fig.S7）。计数法评价抗菌性能（图5）。纯纤维无论是否照射808 nm光均无抗菌性（图5a,b），证实808 nm光本身无杀菌效果。掺杂UCNPs纤维菌数不减（图5a′,b′），证实UCNPs无杀菌效果。掺杂姜黄素纤维菌数下降（图5c,c′），证明姜黄素本身有抗菌活性。掺杂UCNPs@姜黄素纤维在NIR照射下显现明显杀菌效果（图5d′,e′）。结合图3结果，杀菌源于808 nm照射下UCNPs@姜黄素产生的¹O₂。姜黄素抗菌活性有无光照下相同，因其吸收在可见光区（图2b），808 nm光无效，这也是设计姜黄素包覆UCNPs表面的原因。图5d,e分别为0.15 wt%和0.20 wt% UCNPs@姜黄素组，对比发现0.20 wt%组20 min照射杀菌效果更好，抗菌率达95%。¹O₂可杀灭耐药菌。数据进一步表明：UCNPs@姜黄素纤维因双重抗菌活性（纤维本身抗菌+PDT）杀灭MRSA，PDT效果优于纤维本身抗菌。大肠杆菌实验也证实双重抗菌效应（附件Fig.S8）。H&E染色验证抗炎效果（附件Fig.S9）：无纳米纤维组大量中性粒细胞聚集（紫蓝细胞簇），提示组织损伤化脓感染；纳米纤维组出现少量肉芽组织和红细胞，间接反映抗菌性能，对伤口感染炎症有阻断作用。

结论

利用自制便携电纺装置通过原位电纺法制备核壳姜黄素复合纳米纤维。所得纤维在不同生物表面粘附性优于传统法。先增大姜黄素尺寸再掺入亲水纤维的方法有效避免光敏剂脱落，增强¹O₂产生扩散，为设计其他光动力纳米材料提供启示。污染耐药菌后展现双重抗菌行为高效杀灭耐药菌。这种具优异粘附性的双重抗菌纳米纤维膜可结合止血用作抗菌敷料，实现户外止血。