氧化锆纳米粒子对成骨细胞样 3T3-E1 细胞的毒性作用

介绍

在过去的几十年中，工程纳米粒子 (NPs) 的应用已经扩展到各个领域，例如电子、生物医学应用和制药。氧化锆 (ZrO2) NPs 是用于合成耐火材料、铸造砂和陶瓷的主要纳米材料之一。由于具有较好的机械强度，该材料还用于生物医学领域，包括生物传感器、癌症治疗、植入物、关节假体和牙科[1, 2]。然而，颗粒物的广泛应用引起了人们对其潜在健康和环境风险的担忧，其中确保职业和消费者安全是一个重要问题。目前，ZrO2 NPs的毒理学研究有限，结果存在争议。

一些研究报告称，与氧化铁、二氧化钛 (TiO2) 和氧化锌 (ZnO) 等其他纳米材料相比，ZrO2 NPs 显示出更好的生物相容性 [3,4,5,6]。与这些结果一致，其他人报告称 ZrO2 NP 可诱导轻度 [3, 7] 或无细胞毒性作用 [8,9,10]，并且只有少数研究表明具有轻度细胞毒性潜力。然而，斯托科罗等人。 [11] 研究了 ZrO2 NPs 和 TiO2 NPs 包覆与未包覆的毒性作用，他们发现各种 NPs 都表现出不同程度的毒性作用。此外，在另一项研究中，在红细胞中浓度高达 1 mg/mL 的 ZrO2 NP 处理后，细胞形态发生变化，细胞表面出现裂纹 [12]。因此，在这项研究中，我们评估了 ZrO2 NPs 的细胞毒性作用，为其未来的体内应用提供了有用的见解。同时，我们以TiO2 NPs处理细胞作为对照组，其毒理学特征已得到很好的发展[13]。

以往的研究表明，NPs 已被广泛用作组织工程材料，并具有改善成骨细胞成骨分化的能力 [14,15,16,17]。一份报告表明，二氧化硅 (Si) NPs 可以逆转小鼠与年龄相关的骨质流失，这可能是由于 Si NP 诱导的骨形成 [16]。刘等人。 [14] 发现银（Ag）NPs/聚（DL-乳酸-共-乙醇酸）涂层不锈钢合金具有很强的抗菌能力，可以促进MC3T3-E1细胞体外成骨细胞增殖和成熟。此外，据报道，碳纳米管可诱导骨钙化，这很可能是由于其纳米结构与细胞内细胞器的大小相似[18]。

ZrO2 NPs 已被用作生物陶瓷植入物的主要成分，因为它具有生物相容性和抗生物腐蚀[19]。尽管大多数研究都集中在 ZrO2 NPs 的有利特性上，但其不利的生物学效应也不容忽视。因此，在本研究中，我们使用 TiO2 作为对照组，这是一种具有相似物理化学性质的传统纳米材料。我们旨在研究TiO2和ZrO2 NPs对共培养后MC3T3-E1成骨细胞的细胞活力、氧化应激、细胞形态和成骨反应的影响，从而揭示TiO2和ZrO2 NP处理的骨诱导性。

材料和方法

材料制备和表征

TiO2 NPs (CAS Number 637262) 和 ZrO2 NPs (CAS Number 544760) 购自 Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 并通过透射电子显微镜 (TEM, MFP-3D-S, Asylum Research，Santa Barbara，CA，USA）、Zeta 电位和动态光散射 (DLS) 粒度分析测量（Zetasizer Nano ZS，Malvern，UK）。将纳米颗粒分散在酒精中进行 TEM 检测，可以更清楚地显示纳米颗粒的形貌和粒径。此外，通过 DLS 检测颗粒的聚集尺寸，其中使用完全培养基来与细胞培养中应用的颗粒特征相一致。细胞处理前，将原液用超声波细胞破碎系统（宁波新智生物科技有限公司，中国）分散30分钟，同时冰冷却，细胞实验前用完全培养基稀释成不同浓度。

3T3-E1 细胞培养

3T3-E1细胞系（中国医学科学院上海公共研发基础设施细胞库，中国上海）在最低必需培养基α（α-MEM，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）中培养，美国）含有 10% 胎牛血清（FBS，Thermo Fisher Scientific，美国）和 1% 抗生素/抗真菌剂（Thermo Fisher Scientific，美国）。细胞在 37°C 和 5% CO2 的 95% 加湿环境中培养，每隔一天更换培养基。

细胞增殖分析

使用 CCK-8 测定法（Dojindo Molecular Technologies，Kumamoto 市，日本）检测细胞活力。将细胞以每孔 5000 个细胞接种在 96 孔板中。然后将 TiO2 NPs 和 ZrO2 NPs 以 0、10、20、40、60、80、100 和 150 μg/mL 的系列浓度添加到 96 孔板中，然后在 37°C 下孵育 24 和 48 小时。 5% CO2，伴随N -乙酰-l-半胱氨酸 (NAC) 与否，用于抑制 ROS 的产生。对照组不做任何处理。然后，通过向每个孔中添加 110 μL 检测试剂来进行 CCK-8 测试，然后将 96 孔板在 37°C 下再孵育 2 小时。为防止 NP 干扰该分析测定，在 2 小时反应时间后将 96 孔板中待测试的试剂转移到新的 96 孔板中；沉积的纳米颗粒和细胞留在原板上。使用酶标仪（SpectraMax M5, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA）在 450 nm 的单一波长下测量每个孔的光密度 (OD)。每个处理设 6 个重复。

通过流式细胞术分析膜联蛋白 V 细胞凋亡

细胞在 12 孔板中以 30,000 个细胞/孔的密度培养以达到汇合。在 TiO2 NP 和 ZrO2 NP 处理 48 小时后，用 PBS 洗涤细胞并使用 EDTA 游离胰蛋白酶缓冲液收集细胞。用浓度为 25,000 个细胞/mL 的 PBS 缓冲液重悬细胞，并以 1000×g 离心 .然后，细胞在室温下用 FITC Annexin V 和 PI（Invitrogen™，美国）染色，无需光照。最后，将细胞与 400 μL 结合缓冲液混合，并立即通过流式细胞术（BD FACSAria III，BD，Franklin Lakes，NJ，USA）进行分析。

ROS 生成分析

使用活性氧物种测定试剂盒（Beyotime，上海，中国）测定细胞内 ROS 的形成。简而言之，在用 PBS 洗涤后，将细胞以 20,000 个细胞/孔的速度接种在 2 mL 培养基中，并用浓度为 0、10、50 和 100 μg/mL 的 TiO2 NPs 和 ZrO2 NPs 处理48 小时，是否伴随 NAC。用 TiO2 NPs 和 ZrO2 NPs 处理后，收集细胞并与 10 μM DCFH-DA 在 37°C 和 5% CO2 下孵育 30 分钟。在BD FACSAria III（BD，Franklin Lakes，NJ，USA）上分析荧光强度。

共聚焦显微镜

由于大部分细胞已经进入凋亡状态，我们选择24 h作为时间点来观察我们研究中细胞骨架结构的变化。将 3T3-E1 细胞接种在玻璃盖玻片上，并在 TiO2 NP 和 ZrO2 NP 存在下培养 24 小时。细胞用PBS缓冲液处理3次后立即洗涤，4%多聚甲醛固定，0.1% Triton X-100透化，含5% BSA的PBS封闭。然后，将细胞与 α-微管蛋白（Sigma-Aldrich，St. Louis，MO，USA，1:4000）在 4°C 下孵育过夜，并在 37°C 下加载 FITC 结合的二抗，次日后PBS 洗涤 3 次。因此，细胞骨架用罗丹明-鬼笔环肽（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA，1:1000）在黑暗中染色 1 小时，细胞核用 Hoechst 33342（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）染色 20 分钟。使用 FV10i 共聚焦显微镜（Olympus，Tokyo，Japan）检查盖玻片。

矿化感应检测

3T3-E1 细胞以 15,000 个细胞/孔的密度接种在 6 孔板中。用浓度为 10 和 100 μg/mL 的 TiO2 NPs 和 ZrO2 NPs 处理细胞，每隔一天更换含有纳米材料的培养基；在每次更换培养基之前，通过 PBS 轻轻洗涤细胞以去除残留的纳米材料。在 TiO2 NPs 和 ZrO2 NPs 存在下培养 7、14 和 21 天后，细胞被茜素红 S 染色。简而言之，细胞在 4°C 下用 4% 多聚甲醛固定 30 分钟，然后用茜素红染色S 溶液（40 mM，pH 4.1）在环境温度下再放置 20 分钟。蒸馏水洗涤3次后，光学显微镜（日本Olympus）观察到矿化结节。

RNA 提取和 RT-PCR

通过TRIzol试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）提取总RNA。然后，使用紫外分光光度计评估 RNA 浓度。使用RT试剂盒（TaKaRa Bio，大连，中国）将分离的RNA逆转录为cDNA。使用 SYBR green 试剂（TaKaRa Bio，大连，中国）进行实时 PCR。检测到成骨相关基因，包括runt相关转录因子2（RUNX2）、胶原蛋白1α1（Col1α1）、碱性磷酸酶（ALP）、骨桥蛋白（OPN）、骨钙素（OC）和骨唾液蛋白（BSP）。数据分析采用 2 ^−ΔΔ CT方法。所用引物列于表 1。

统计分析

结果表示为平均值 ± SEM。所有数据均通过ANOVA检验进行统计分析。进行方差齐性检验，当方差相等时和不存在同质性时，分别使用 Bonferroni 和 Dunnett's T3 检验。 p 小于 0.05 的值被认为具有统计学意义。

结果

TiO2 和 ZrO2 NPs 的表征

我们首先通过透射电子显微镜 (TEM) 和动态光散射 (DLS) 对 TiO2 NP 和 ZrO2 NP 粉末进行了表征（图 1a、b、表 2）。 TEM 和 SEM 图像显示了颗粒的形状和尺寸。 TiO2 NPs 是小的棒状球体，平均尺寸为 25.4 ± 2.8 nm。 ZrO2 NPs 是小的棒状球体，平均尺寸为 31.9 ± 1.9 nm。为了测量溶液中 TiO2 NPs 和 ZrO2 NPs 的尺寸，使用 DLS 并且 TiO2 NPs 和 ZrO2 NPs 的颗粒分别扩展到 81.2 nm 和 93.1 nm，这表明有团聚效应。 TiO2 NPs和ZrO2 NPs的zeta电位分别为32.9 ± 5.4 mV和42.4 ± 7.4 mV。

TiO2 和 ZrO2 NPs 的表征。 TiO2 (a ) 和 ZrO2 (b ) 使用 TEM 检测 NP 形态和尺寸。 (c ) 在 TiO2 和 ZrO2 NP 处理浓度为 10、50 和 100 μg/mL 后，观察到 3T3 细胞和纳米材料的共培养情况。 (d ) TEM 结果是在 TiO2 和 ZrO2 NP 处理 1 h 后获得的

然后，我们观察了在不同浓度的 TiO2 NP 和 ZrO2 NP 暴露后 3T3 细胞的照片。我们发现 NPs 均匀分布在细胞上或四处散布。由于观察到一小部分纳米级纳米粒子，纳米粒子在高浓度下表现出强大的聚集能力，而大量纳米级纳米粒子很小，可能会转移到难以看到的细胞中（图 1c）。此外，还获得了 TiO2 和 ZrO2 NP 处理 1 小时后细胞的 TEM 结果；我们的数据表明 NPs 可以转移到细胞囊泡中。同时，也观察到一些细胞器损伤，如线粒体肿胀和液泡发生。

TiO2 和 ZrO2 NP 诱导的 3T3-E1 细胞毒性作用

我们评估了 TiO2 NP 和 ZrO2 NP 以系列浓度（10、20、40、60、80、100、150 μg/mL）处理后的细胞活力。对于 TiO2 NPs（图 2a），孵育 24 小时后，我们发现 TiO2 NPs 在较低剂量（≤ 20 μg/mL）下是无毒的，而在较高浓度（> 20 μg/mL) (p <0.001)。在孵育 48 小时后观察到 20 μg/mL 处理组中细胞活力的更显着下降；浓度为 20 μg/mL 的 TiO2 NPs 诱导细胞活力降低 (p <0.01)。此外，更高剂量的 TiO2 NPs (> 20 μg/mL) 显示 48 小时细胞活力显着降低 (p <0.001)。然而，当用 10 μg/mL 的 TiO2 NPs 处理 48 小时时，细胞活力保持稳定。此外，对于 ZrO2 NPs（图 2b），与 TiO2 NPs 相比，观察到类似的结果；在 150 μg/mL 的浓度下 48 小时观察到更高的毒性作用，其中细胞活力降低至 50% 以下。这些结果表明 TiO2 和 ZrO2 NPs 在较低剂量下具有生物相容性。然而，这两种纳米材料在高毒性浓度下表现出轻微的细胞毒性。

在 3T3-E1 细胞中，TiO2 和 ZrO2 NP 诱导的细胞活力降低。 3T3-E1 细胞用 TiO2 (a ) 和 ZrO2 (b ) 浓度为 0、10、20、40、60、80、100 和 150 μg/mL 的 NPs 24 和 48 小时，然后通过 CCK-8 测定检测细胞活力。同时，在NAC处理后检测细胞活力的变化，可以消除细胞内的ROS。结果代表平均值 ± SEM。 *p <0.05； **p <0.01； ***p <0.001，与对照相比

NAC 对 TiO2 和 ZrO2 NPs 诱导的细胞毒性的抑制作用

然后我们检测了作为 ROS 清除剂的 NAC 的抑制作用。结果表明，NAC 可能抑制 TiO2（图 2a），而 ZrO2 NPs（图 2b）在处理 24 小时和 48 小时后诱导细胞活力。 NAC 抑制后，除最高浓度 (150 μg/mL) 外，在所有浓度的 TiO2 和 ZrO2 NP 处理下，细胞活力都保持了 24 小时。尽管在 48 小时的时间点，用高浓度 TiO2（100 和 150 μg/mL）和 ZrO2 NPs（80、100 和 150 μg/mL）处理的细胞的抑制作用略有降低，但未观察到显着的细胞活力变化。浓度低于 80 μg/mL，其中细胞活力显着高于无 NAC 的细胞。

TiO2 和 ZrO2 NPs 在 3T3-E1 细胞中诱导 ROS 生成

我们进一步检测了 3T3-E1 细胞中 TiO2 和 ZrO2 NPs 暴露后 ROS 的产生（图 3）。我们的结果表明 TiO2 和 ZrO2 NPs 会在 24 小时后诱导 ROS 的产生，这在 100 μg/mL 的浓度下最为显着。在 10 μg/mL 的浓度下，TiO2 NPs 没有显着的 ROS 生成，而 ZrO2 NPs 在相同浓度下诱导了有效的 ROS 生成。同时，NAC在所有浓度下均能显着抑制TiO2和ZrO2 NP诱导的3T3-E1细胞ROS生成。

TiO2 和 ZrO2 NP 诱导 3T3-E1 细胞中的 ROS 生成。 3T3-E1 细胞用不同浓度的 TiO2 和 ZrO2 NPs 处理 48 小时，同时培养 NAC（10 mM），然后检测 3T3-E1 细胞中的 ROS 水平。结果代表平均值 ± SEM。 *p <0.05； **p <0.01； ***p <0.001，与对照相比

TiO2 和 ZrO2 NPs 诱导 3T3-E1 细胞凋亡和坏死

在不同浓度的 TiO2 和 ZrO2 NP 暴露 48 小时后检测到细胞凋亡和坏死（图 4）。位于第三象限的红点代表正常细胞，位于第一象限和第四象限的红点分别代表早期凋亡细胞和晚期凋亡或坏死细胞。有趣的是，我们的结果表明，TiO2 和 ZrO2 NPs 可以以浓度和时间依赖性方式诱导细胞凋亡。在 TiO2 NP 暴露 48 小时后，在 10 μg/mL 的浓度下未检测到显着的细胞凋亡；然而，在 50 和 100 μg/mL 的浓度下，晚期凋亡或坏死细胞的百分比达到了高水平。在 ZrO2 NP 暴露 48 小时后，我们也没有发现浓度为 10 μg/mL 的细胞凋亡，但在 50 μg/mL 组中晚期凋亡或坏死细胞的百分比为 43.7%。最有趣的是，处理 48 小时后，在 100 μg/mL 的浓度下观察到显着的早期细胞凋亡 (34.1%)。我们发现TiO2 NPs的早期凋亡水平明显高于ZrO2 NPs；而晚期凋亡或坏死水平则相反。

TiO2 和 ZrO2 NP 诱导 3T3-E1 细胞凋亡。 一 将 3T3-E1 细胞用不同浓度的 TiO2 和 ZrO2 NPs 处理 48 小时后，检测细胞凋亡水平。 b 计算细胞凋亡水平，包括早期凋亡水平和晚期凋亡水平，然后对数据进行统计。结果代表平均值 ± SEM。 *p <0.05； **p <0.01； ***p <0.001，与对照相比

TiO2 和 ZrO2 NP 诱导的 3T3-E1 细胞形态变化

为了研究暴露于 TiO2 和 ZrO2 NPs 后 3T3-E1 细胞的形态变化，我们进行了荧光染色，然后进行了共聚焦显微镜检查（图 5 和 6）。与未处理的对照细胞相比，10 μg/mL TiO2 和 ZrO2 NP 处理 24 小时后没有形态变化，而细胞在 100 μg/mL TiO2 和 ZrO2 NP 处理后变圆变小。最有趣的是，在 50 μg/mL 的 TiO2 和 ZrO2 NP 处理后观察到轻微的细胞面积减少，其中 TiO2 显示出更有效的细胞面积减少。一致地，定量结果证实在 100 μg/mL TiO2 和 ZrO2 NP 处理后细胞面积显着减少（图 5）。

TiO2 和 ZrO2 NP 诱导 3T3-E1 细胞的细胞面积变化。 3T3-E1 细胞用 TiO2 (a ) 和 ZrO2 (b ) NPs 浓度为 10 和 100 μg/mL 24 小时，细胞加载微管蛋白（绿色）、肌动蛋白（红色）和 Hoechst 33342（蓝色）。根据肌动蛋白（红色）和微管蛋白系统（绿色）的变化观察细胞形态，计算细胞面积分布变化

TiO2 和 ZrO2 NP 诱导 3T3 细胞的细胞骨架变化。 3T3-E1 细胞用 TiO2 (a ) 和 ZrO2 (b ) NPs 在 10 和 100 μg/mL 的浓度下 24 小时，细胞骨架的变化是基于肌动蛋白（红色）和微管蛋白系统（绿色）的变化来评估的

我们进一步研究了肌动蛋白丝和微管水平的细胞骨架变化（图 6）。同样，对照组与 10 μg/mL TiO2 和 ZrO2 NP 处理之间没有显着差异，并且两组中的细胞都显示出明确的肌动蛋白丝和微管系统结构。相比之下，100 μg/mL 的 ZrO2 NP 处理诱导 3T3-E1 细胞收缩，以及类似固缩的细胞核和浓缩的不清楚的肌动蛋白丝和微管结构。对于TiO2 NPs，观察到如此多的肌动蛋白点，位于细胞膜上的肌动蛋白丝模糊而粗糙。对于ZrO2 NPs，检测到更有效的细胞骨架破坏，肌动蛋白和微管结构粗糙且有缺陷。

TiO2 和 ZrO2 NP 诱导的 3T3 细胞矿化

接下来，我们通过茜素红染色检测 3T3 细胞的矿化状态，并在光学显微镜下观察矿化结节的形成（图 7）。在不同浓度的 TiO2 和 ZrO2 NP 存在下，成骨诱导 7、14 和 21 天后对细胞进行染色。我们发现在诱导 14 天和 21 天后，矿化结节变得可见。诱导 14 天和 21 天后，对照组与 10 μg/mL 的 TiO2 和 ZrO2 NP 处理之间的矿化没有显着差异。然而，在 100 μg/mL 的 TiO2 和 ZrO2 NP 处理后，可能观察到矿化减少，这是由于矿化结核变小和模糊。

TiO2 和 ZrO2 NP 诱导 3T3 细胞矿化作用。 3T3-E1细胞在矿化溶液中分化7 d、14 d和21 d后，加入TiO2(a ) 和 ZrO2 NPs (b ) 在不同的浓度。茜素红染色检测矿化结节（黑色箭头）

TiO2 和 ZrO2 NP 诱导 3T3 细胞中成骨相关基因的表达

为了研究 TiO2 和 ZrO2 NP 诱导 3T3 细胞成骨的机制，我们检测了 TiO2 和 ZrO2 NP 处理后 3T3 细胞中成骨相关基因的水平，包括在早期 (Runx2 , Col1α1 , 和 Alp ) 和迟到 (Opn , Ocn , 和 Bsp ) 成骨阶段（图 8）。我们发现 10 μg/mL 的 TiO2 和 ZrO2 NPs 诱导了 Runx2 的最高表达水平 治疗 3 天后，而在第 7 天，Runx 在 100 μg/mL 的 ZrO2 NP 处理后降至最低水平。 Col1α1 在第 3 天和第 7 天用 10 μg/mL TiO2 和 ZrO2 NP 处理后增加，而对于用 100 μg/mL TiO2 和 ZrO2 NP 处理的细胞，Col1α1 首先在第 3 天显着上调，但在 7 天后显着下降。我们还检测到 Alp 的显着减少 TiO2 和 ZrO2 NP 以 100 μg/mL 处理 3 天后的表达。

TiO2 和 ZrO2 NP 诱导 3T3 细胞成骨相关基因的变化。 3T3-E1 细胞在矿化溶液中分化 3、7、14 和 21 天后，伴随着不同浓度的 TiO2 和 ZrO2 NPs。使用RT-PCR检测成骨相关基因变化。结果代表三个独立实验的平均值 ± SEM。 *p <0.05； **p <0.01； ***p <0.001，与对照相比

对于在成骨诱导后期上调的基因，Opn的表达水平 , Ocn , 和 Bsp 在 10 μg/mL TiO2 和 ZrO2 NP 处理 14 天后显着增加，并且 Opn 在第 21 天持续上调至更高水平。这些结果表明与 Ocn 相比 和 Bsp , 打开 是 TiO2 和 ZrO2 NP 诱导成骨的后期标志物。有趣的是，100 μg/mL 的 TiO2 和 ZrO2 NPs 未能增强 Opn 的表达 , Ocn , 或 Bsp 在第 14 天；此外，这些基因在第21天显示出显着下调。

讨论

ZrO2 NPs 是耐火材料、陶瓷和生物医学器械（包括植入物、关节假体和牙科材料）中的重要成分。到目前为止，TiO2 NPs 作为其他具有相似理化性质的 NPs 之一，许多研究都集中在其毒理学数据上。他们发现 TiO2 NPs 可以转移到细胞中，并由于不同的理化特性而显示出潜在的细胞损伤 [20, 21]。同时，缺乏 ZrO2 NPs 的毒理学数据。在我们的研究中，我们将 TiO2 NPs 作为对照组，并探讨了 TiO2 和 ZrO2 NPs 对 3T3-E1 细胞的毒理作用。众所周知，纳米颗粒的物理化学特性，尤其是尺寸和形态，会有效地影响生物安全。一些研究表明，纳米级颗粒的毒性明显高于微米级颗粒 [22, 23]。在大多数情况下，据报道颗粒形态也会影响毒性 [24,25,26]。在我们的研究中，我们发现 TiO2 和 ZrO2 NPs 是棒状球体。与之前的报道 [5, 27, 28] 相比，我们的 TiO2 和 ZrO2 NPs 在水中的团聚作用相对较弱，颗粒尺寸扩大到 81.2 和 93.1 nm，同时我们也可以在 NP 后在培养基中观察到一些微尺度物质以浓度依赖的方式暴露，即使在使用超声波分散技术后，这也证实了本研究中的团聚效应。然而，由于在细胞内囊泡中检测到有效的 NPs，团聚效应不能抑制 NP 易位到细胞质中。细胞器，如线粒体，可能是一个主要目标。

我们已经检测到 3T3-E1 细胞在不同浓度的 TiO2 和 ZrO2 NP 处理下的活力。我们的结果表明，10 μg/mL 的 TiO2 和 ZrO2 NPs 是 3T3-E1 细胞的生物安全浓度。细胞活力以时间和浓度依赖性方式降低，这意味着与其他氧化物金属纳米粒子（如二氧化硅和 ZnO）相比，TiO2 和 ZrO2 NPs 长时间暴露于更高剂量后可能具有细胞毒性 [4, 28, 29]。此外，在我们的研究中，ZrO2 NPs 在高毒性浓度下表现出比 TiO2 NPs 更强的毒性作用。

氧化应激是 ROS 生成速度过快和抗氧化因子减少的副产品，被认为是纳米材料诱导细胞毒性的一个关键因素，据报道，它通过不同的机制触发细胞凋亡 [30, 31]。此外，Kozelskaya 等人。 [12] 观察到 ZrO2 NPs 诱导膜微粘度增加、细胞形态变化和由于氧化应激导致的红细胞表面裂纹。与这些研究一致，我们检测了 TiO2 和 ZrO2 NP 处理后 3T3-E1 细胞中的 ROS 水平，发现 TiO2 和 ZrO2 NPs 可以以浓度依赖性方式诱导显着的 ROS 生成，而 ZrO2 NPs 诱导更有效的氧化应激效应。此外，作为 ROS 清除剂的 NAC 可以消除升高的 ROS 水平。这些结果表明ROS在TiO2和ZrO2 NP诱导的细胞毒性中具有重要作用。

细胞凋亡是一种细胞死亡，它清除衰老和异常细胞，以维持细胞生物学功能[32]。一些研究报道，细胞凋亡是用氧化物金属纳米材料（如 TiO2、ZnO、Si 和 Ag）处理后的主要毒性反应之一 [33,34,35,36]。在我们的研究中，我们发现 TiO2 和 ZrO2 NPs 可以以时间/浓度依赖性方式诱导 3T3-E1 细胞凋亡/坏死体形成，这与之前显示的细胞活力降低有关。此外，我们发现，当在 ZrO2 NP 处理后观察到大部分晚期凋亡或坏死细胞时，TiO2 NPs 的细胞状态主要是早期凋亡。这些现象表明 ZrO2 NPs 诱导了更快速和有效的细胞凋亡作用。 Similarly, other studies also showed that ZrO2 NPs induced significant apoptotic and necrotic processes in MSTO cells [4, 11].

The cytoskeleton metabolism is a dynamic biological process involving polymerization and depolymerization, which could sustain cell morphology and promote cell function. Some studies have shown that nanomaterials could affect the cell morphology and cytoskeleton system [37,38,39]. We found 3T3-E1 cells became smaller and rounded in the high-dose group of TiO2 and ZrO2 NPs (100 μg/mL), along with decreased cell area due to cytoskeleton disruptions. These findings were also supported by previous reports that ZrO2 NP treatment could induce cell morphology changes in MSTO cells at higher concentration [4]. Another study showed the disrupted blood cell morphology after ZrO2 NP treatment [12].

Alizarin red staining is a key indicator of osteogenic responses. In our study, no impact on osteogenic induction has been shown by TiO2 and ZrO2 NP treatment (10 μg/mL), except that cells treated with a cytotoxic dose of TiO2 and ZrO2 NPs (100 μg/mL) had a significant decrease of mineralized nodules due to the potential inhibition of osteoinductive properties. In addition, the expression level of osteogenesis-related genes was important biomarkers. Our results showed that lower concentration (10 μg/mL) of TiO2 and ZrO2 NPs promoted the expression of osteogenesis-related genes; however, TiO2 and ZrO2 NPs at high concentrations (100 μg/mL) could significantly inhibit gene expression for both early- and late phases of mineralization, indicating that TiO2 and ZrO2 NPs at high concentrations indeed inhibited osteoinductive properties. Other studies also obtained similar results; they claimed that TiO2 NPs inhibited the osteogenesis of osteoblasts in a size-dependent manner while potentially promoted osteoclastogenic process [33]. Sengstock et al. [40] found that sub-toxic concentrations of Ag NPs and Ag ions could significantly impair the osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. More ongoing or newly initiated researches are focused on developing nanoparticles with acceptable biosafety and osteogenic potential to promote osseointegration for in vivo application [18, 41].

结论

In conclusion, our data indicated that ZrO2 NPs were nanoparticles with good biocompatibility, just like TiO2 NPs, while they could induce toxic effects at high toxic concentrations on 3T3-E1 cells. ROS played a key role on TiO2 and ZrO2 NP-induced cytotoxicity, including cell viability, apoptosis and necrosis, and changes in cell morphology. Moreover, TiO2 and ZrO2 NPs at high concentrations showed inhibitory effects on osteogenic differentiation of 3T3-E1 cells. Our findings could provide deep insights into the biocompatibility and potential application of ZrO2 NPs.

缩写

Ag:

Silver

ALP:

碱性磷酸酶

Col1α1:

Collagen 1α1

DLS：

动态光散射

FBS：

胎牛血清

NAC:

N -acetyl-l-cysteine

NP：

纳米粒子

OC:

Osteocalcin

OD:

Optical density

OPN:

Osteopontin

PBS：

Phosphate-buffered saline solution

ROS：

活性氧

RUNX2:

Runt-related transcription factor 2

Si：

Silica

TEM：

透射电子显微镜

TiO2 :

Titanium dioxide

ZrO2 :

Zirconia

α-MEM:

Minimum essential medium-alpha