羟基磷灰石纳米颗粒通过内皮细胞相互作用促进MSC成骨分化

摘要

纳米羟基磷灰石（nano-HA）在再生医学领域备受关注。内皮细胞（EC）-间充质干细胞（MSC）相互作用对骨重建至关重要，但nano-HA在此过程中的作用机制尚不明确。本研究利用EC介导的间接共培养模型，探究HA纳米颗粒（HANPs）对MSC的细胞毒性及成骨诱导效应，并揭示潜在机制。结果显示：在亚细胞毒性剂量下，HANPs增加MSC活力、成骨基因表达、矿化结节形成及碱性磷酸酶（ALP）产生。这些现象依赖于EC分泌的缺氧诱导因子-1α（HIF-1α），触发ERK1/2信号级联。此外，建立双阶段细胞谱系数学模型定量分析HIF-1α对MSC成骨分化的影响，证实HIF-1α在1500 pg/mL以下对MSC成骨分化率呈剂量依赖性促进作用，与实验结果一致。数据提示HANPs、EC、MSC间协同相互作用可促进骨再生。双阶段细胞谱系模型为评估骨组织工程中效应分子潜在影响提供了有用的体外系统。

引言

创伤、先天畸形、手术切除导致的骨缺损重建是骨科手术巨大挑战。羟基磷灰石（HA）作为典型生物活性陶瓷曾用作骨替代材料，但其力学性能和成骨诱导性不佳限制临床应用。近年nano-HA因其独特仿生特性表现出更优生物活性和改善力学性能，在再生医学相关生物医学领域引起广泛关注。植入骨缺损时，多种骨修复相关细胞将暴露于nano-HA，故需评估其生物学行为。证据显示HANPs可被人脐带Wharton胶干细胞（hWJ-MSCs）和成骨细胞摄取，促进成骨分化。Dua等报道HANPs促进工程软骨整合为新生软骨；反之HANPs抑制人脐静脉内皮细胞（HUVECs）血管生成能力。为全面理解HANPs对骨再生影响，并应对工程纳米人工骨应用紧迫性，深入研究必要。

骨再生必伴随新生血管入侵。EC是血管系统内层细胞，除被动输送血液外，还诱导、指定、引导器官再生，维持稳态和代谢。MSC属于围内皮微环一部分，在特定生理生化微环境诱导下具备自我更新和多向分化能力。Tsai等发现EC分泌内皮素-1导向MSC向成骨/软骨谱系分化。Saleh等用微阵列分析鉴定HUVEC分泌蛋白及相关串扰信号通路，通过与MSC膜受体相互作用增强增殖和成骨分化。骨组织工程中HANPs可接触新生血管被EC内吞，改变其生理功能，进而影响周围成骨前体细胞，通过改变旁分泌信号影响骨修复。虽已探索HANPs对MSC直接影响，但HANPs能否通过EC间接诱导MSC成骨分化仍不清晰，这对理解HANPs骨修复效应至关重要。

本研究建立HUVECs和hWJ-MSCs间接共培养模型，深入探究HANPs对EC-MSC相互作用的生物学效应。评估HANPs通过HUVEC介导旁分泌信号对hWJ-MSCs的细胞毒性和成骨诱导效应。通过评估HANPs刺激HUVECs上清液可溶性因子，重点在基因和蛋白水平识别关键影响因子及相关机制。结果表明HIF-1α在这些相互作用中起关键作用。

为定量观察和预测HIF-1α对成骨过程影响，建立结合双阶段细胞谱系与HIF-1α的数学模型。通过分析实验数据，模型可基于定义的初始细胞播种密度和HIF-1α浓度预测任意时间点MSC数量和分化程度，进而为初始培养条件和孵育时间提供建议。研究结果有助于揭示纳米骨替代材料与生物系统相互作用，推动再生医学创新生物材料发展。

材料与方法

颗粒制备与表征

20 nm（np20）、20×80 nm（np80）HANPs及微米级HA颗粒（m-HAP，纯度≥99.0%）购自南京帝王纳米材料有限公司。TEM（FEI Tecnai G2 Spirit Bio-Twin）和SEM（LEO1530VP）观察颗粒尺寸形貌。Zetasizer Nano ZS90和Mastersizer 3000（Malvern）测定水动力学尺寸和Zeta电位。

细胞制备与培养

方案经南京医科大学伦理委员会批准。HUVECs和hWJ-MSCs从新鲜人脐带分离获取（经捐献者书面知情同意）。脐带和脐静脉用含1%青霉素链霉素（PS）PBS冲洗。脐静脉注入0.1%胶原酶I 37 °C孵育15 min收集HUVECs，用EC培养基（ECM，Sciencell）培养。去除血管后，Wharton胶切成1 mm²块置于25 cm²培养瓶，用含10%胎牛血清（GIBCO）和1% PS的L-DMEM（GIBCO）培养。hWJ-MSCs用单克隆抗体（CD13、CD29、CD34、CD44、CD45、CD51、CD105，BD Biosciences）确认表型；HUVECs用von Willebrand因子（vWF，上海长岛生物）确认。HUVECs第3–7代，hWJ-MSCs第3–5代用于实验。

1 mg/mL颗粒悬液用PBS配制后稀释于L-DMEM至终浓度。如图1所示，HUVECs经指定浓度HAPs孵育18 h。培养基15,000 rpm、4 °C离心15 min，上清加10% FBS作为条件培养基（CM）用于hWJ-MSCs后续实验。CM含成骨诱导液（10 mM β-甘油磷酸钠、50 μg/mL L-抗坏血酸-2-磷酸钠、0.1 μM地塞米松，Sigma-Aldrich）。2-甲氧基雌二醇（2-MeOE2，Selleck Chemicals）作HIF-1α特异性抑制剂：2-MeOE2(+)组中hWJ-MSCs用HUVECs预用5 μM 2-MeOE2处理40 min后的CM培养。PD98059作MEK特异性抑制剂：PD98059组中hWJ-MSCs用含5 μM PD98059的CM培养。

细胞活力与数量测定

MTS试剂盒（Bestbio，贝时生物）评估细胞活力。hWJ-MSCs贴壁24 h后用CM培养24、72 h。微孔板读数仪（SpectraMax M2，Molecular Devices）490 nm测甲臜吸光度，标准曲线换算细胞数。

定量实时PCR

TRIzol（Invitrogen）提取总RNA。PrimeScript First Strand cDNA Synthesis kit（TaKaRa）逆转录1.0 µg RNA。FastStart Universal SYBR Green Master（Roche）在7900HT Fast实时扩增系统（Applied Biosystems）上分析目标基因表达。相对mRNA表达以GAPDH归一化，2^(-ΔΔCt)法计算。引物序列见表1。

茜素红S（ARS）染色与定量

hWJ-MSCs在12孔板成骨培养基培养至14 d，绝对乙醇固定15 min，1%（w/v）ARS（pH 4.2）室温染色5 min，双蒸水洗两次拍照。定量分析：每孔加300 μL 10%（w/v）十六烷基吡啶氯化物一水合物（BOMEI）孵育30 min，取90 μL转96孔板，405 nm三复孔测吸光度。

碱性磷酸酶（ALP）染色与定量

成骨培养14 d后BCIP/NBT ALP显色试剂盒（贝时）染色：4%多聚甲醛固定，硝基蓝四氮唑与5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸混合染色4 h拍照。定量：冰上RIPA裂解液（贝时）裂解30 min，12,000 rpm、4 °C离心10 min，上清用ALP测定试剂盒（贝时）405 nm三复孔测吸光度，标准曲线换算ALP活性。

ELISA

HUVECs接种2×10⁵ cells/well。收集HAPs孵育18 h后的CM（附件1），人HIF-1α ELISA试剂盒（安徽乔依生物）按说明书检测。

免疫荧光

HUVECs接种于12孔板载玻片（7.6×10⁴ cells/well）。CM处理18 h后，4%多聚甲醛固定，0.1% Triton X-100渗透，4 °C过夜孵育1%抗HIF-1α抗体[EPR16897]（ab179483，Abcam）。暗处孵育1% CoraLite594标记羊抗兔IgG（H+L）（Proteintech）1 h。DAPI（贝时）染核30 s。激光共聚焦显微镜（奥林巴斯）观察，ImageJ v1.4定量荧光强度。

Western Blot

hWJ-MSCs用CM孵育24 h（ERK1/2、p-ERK1/2）或成骨培养基7 d（RUNX-2、COL I）。RIPA裂解30 min，离心上清-20 °C保存。12% SDS-PAGE后转PVDF膜。一抗：抗p-ERK1/2、抗ERK1/2、抗RUNX-2、抗COL I、抗GAPDH（1:1000，兔多克隆，Cell Signaling Technology）。二抗孵育1 h，化学发光成像系统（LAS4000M，GE Healthcare）检测信号。ImageJ v1.4定量p-ERK/ERK、RUNX-2/COL I/GAPDH比值。

细胞凋亡评估

hWJ-MSCs接种10⁵ cells/well于6孔板。指定浓度HIF-1α处理指定时间。FITC-Annexin V和PI（Fcmacs，南京）标记15 min暗处。FACScan流式细胞仪（BD Bioscience）检测，FlowJo v10分析。

双阶段细胞谱系模型

考虑HAPs巨大潜力及共培养系统分析难度，建立结合双阶段细胞谱系与HIF-1α的数学模型定量分析和预测HIF-1α在hWJ-MSCs成骨分化中的作用。hWJ-MSCs用0、300、500、1000、1500、2000、3000、4000 pg/mL HIF-1α及成骨诱导液处理。拟合这些浓度数据后，用对照组、m-HAP、np80、np20组HUVECs产生的HIF-1α浓度（分别为240、300、325、375 pg/mL）验证拟合方程（MATLAB）。简化模型假设不同HIF-1α浓度下生长模式相似，用平均分化程度拟合分化程度-时间方程。在不同时间点检测各组hWJ-MSCs增殖率、凋亡率、成骨分化程度。

简化双阶段细胞谱系模型（类似多阶段模型）依实验数据建立。C₀、C₁分别代表hWJ-MSCs和终末细胞数量，受控方程：dC₀/dt=[(K-C₀-C₁)/K·p-(p-1)]·υ₀C₀；dC₁/dt=[(2-(K-C₀-C₁)/K·p-p]·υ₀C₀-AC₁。p受HIF-1α和时间影响，代表hWJ-MSCs复制概率；d=1-p为分化率，由拟合估算与实验细胞数数据得出。υ₀量化各谱系阶段细胞分裂速率（υ=ln2/c，c为细胞周期时长）。A为终末细胞凋亡率（简化为常数4.5%）。K为环境容纳量（细胞不能无限增殖）。HIF-1α增加hWJ-MSCs分化率，分化率模型：d=d₀/[1+(rH)ᵐ]，p=1-d。H为HIF-1α浓度；d₀为0 pg/mL HIF-1α时分化率；r代表调控强度（HIF-1α对MSCs调控强度）；m为Hill系数，即MSC分化率与HIF-1α浓度关系。

统计分析

符合正态性和方差齐性数据以均值±标准差（SD）表示（≥3次独立实验）。SPSS 24.0单因素ANOVA或双因素ANONA分析。P<0.05为统计学显著。GraphPad Prism 5作图展示统计分析。

结果

HAPs表征

图2显示HAPs特定尺寸形貌。np20近球形平均直径20 nm；np80棒状平均长80 nm、宽20 nm；m-HAP近球形约12 μm。所有颗粒在L-DMEM中带负电荷，负Zeta电位有利于骨细胞贴附增殖、直接骨结合和新骨形成。颗粒在L-DMEM中倾向聚集，水动力学尺寸可能影响生物行为。

HAPs对hWJ-MSCs间接细胞毒性

MTS法评估间接细胞毒性。50 µg/mL HANPs的CM在24 h和72 h显著促进hWJ-MSCs活力，尤以24 h最明显。100 µg/mL HANPs的CM在72 h使活力比对照降低15–20%。25 µg/mL np20（非np80）在24 h促进活力。确认50 µg/mL HANPs为亚细胞毒性浓度，后续实验均用此浓度（图3）。

HAPs对hWJ-MSCs间接成骨诱导效应

定量RT-PCR评估成骨基因表达。HANPs组（特别是np20）RUNX-2转录水平从第7天到第21天显著升高（图4a）。np20组Col I基因表达第7–21天增强，np80组第7–14天持续增加（图4b）。第14天HANPs组OCN mRNA明显上调，提示成骨加速（图4c）。HANPs组ALP mRNA水平明显增加，指示成骨分化（图4d）。m-HAP组这三成骨基因较对照变化有限（图4）。此外，HANPs组多能性标志物NANOG、OCT3/4、SOX2表达下降（图4e–g），暗示hWJ-MSCs分化，尤以np20组明显。Western blot结果一致（图5c、d），np20组间接增强hWJ-MSCs RUNX-2和COL I表达。

ARS和ALP染色直观观察间接成骨效应。14 d成骨培养后，HANPs组矿化结节数增加、ALP活性升高（图5a、b），m-HAP类似对照效应有限。

HAPs间接共培养激活hWJ-MSCs ERK1/2信号

免疫荧光和ELISA鉴定HUVECs旁分泌功能受HAPs影响后促进hWJ-MSCs成骨分化的可能蛋白。图6a–c显示HANPs（特别是np20）显著促进HUVECs胞内外HIF-1α产生，m-HAP效应有限。Western blot检测ERK1/2通路关键激酶：总ERK1/2蛋白水平不变，但HANPs组（尤np20）hWJ-MSCs p-ERK1/2水平显著升高（图6d、e），m-HAP效应微弱。关键发现：2-MeOE2（HIF-1α特异性抑制剂）阻断HANPs激活的hWJ-MSCs p-ERK1/2升高，表明HIF-1α在hWJ-MSCs中位于ERK1/2信号上游。

HIF-1α通过ERK1/2通路促进hWJ-MSCs成骨分化

应用特异性HIF-1α抑制剂2-MeOE2验证必要性。图7显示：2-MeOE2(+)组hWJ-MSCs矿化基质沉积和ALP活性减弱，证实HIF-1α对成骨分化不可或缺。进一步用MEK特异性抑制剂PD98059探究ERK1/2通路作用：抑制ERK1/2信号后矿化基质沉积和ALP活性受抑，确认ERK1/2通路在HIF-1α激活成骨分化中的关键作用。

双阶段细胞谱系模型

为定量揭示HIF浓度与hWJ-MSCs成骨分化内在联系，用0–4000 pg/mL HIF-1α处理八组hWJ-MSCs。双阶段细胞谱系模型分析不同HIF-1α浓度下增殖、凋亡、成骨分化率。图8a拟合数据得模拟公式（d/d₀=1/[0.14H²-0.43H+1]）和曲线（蓝曲线），显示分化率随HIF浓度先增后降，在1500 pg/mL HIF-1α达峰值。实验中HUVECs产生的HIF-1α浓度（对照240、m-HAP 300、np80 325、np20 375 pg/mL，黑方块）与模拟曲线吻合良好。不同HIF-1α浓度处理hWJ-MSCs分化程度（相对ALP活性）随时间相似增加，简化模型视其生长模式相同/相似。ALP活性第0–7天增幅与成骨细胞数成比例，成骨细胞数达平台期峰值。拟合ALP活性与相对成骨细胞数曲线（成骨细胞数/最大成骨细胞数）得最大ALP活性预测值及相对ALP活性（ALP活性/最大ALP活性）代表分化程度（图8b）。结合两研究得分化程度随时间和HIF-1α演化的三维曲面（图8c）。

为估算最佳培养时间模拟细胞数。阐明不同HIF-1α浓度下分化率后模拟各群体规模。初始播种密度1500 cells/well（96孔板）用不同HIF-1α浓度模拟。图8d–f实验数据（黑方块）与模拟总细胞数（蓝曲线，hWJ-MSCs+成骨细胞数之和）吻合良好，支持模型预测任意时间点hWJ-MSCs和成骨细胞数能力。此外，0、375、1500 pg/mL HIF-1α下成骨细胞数分别在第21、18、15天达平台期。模型为组织工程提供最佳培养时间指导，直接证实HIF-1α加速hWJ-MSCs成骨分化。

讨论

纳米生物材料进展使纳米人工骨替代物成研究热点。证据表明细胞与纳米生物材料因穿透细胞膜、增加内滞留时间存在复杂相互作用。前研究显示胶原/海藻酸钠纳米膜吸附MSC膜激活细胞内信号级联促进成骨分化。Wu等证实TiO₂纳米管通过促进旁分泌效应和EC-MSC细胞连接改善血管化和成骨分化。为开发优秀骨组织工程候选材料，需阐明纳米骨替代物与骨修复相关细胞的直接串扰及间接相互作用，但目前理解仍有限。本研究利用间接共培养模型进一步阐明HANPs通过EC介导对MSC的生物学效应。

细胞毒性是评估纳米生物材料生物相容性首要问题。虽前研究发现HANPs不直接影响hWJ-MSCs活力和凋亡，但可能通过其他细胞介导产生不同影响。故需评估HUVECs介导的HANPs对hWJ-MSCs细胞毒性。有趣的是，CM孵育24 h和72 h后，0–50 µg/mL HANPs组（尤np20）hWJ-MSCs活力维持甚至升高，提示CM存在效应分子。100 µg/mL HANPs对hWJ-MSCs呈细胞毒性。0–100 µg/mL m-HAP无影响（图3）。Jiang等表明特定尺寸工程纳米颗粒有独特内吞途径和动力学，改变下游调控靶细胞功能信号。前研究显示np20和np80被HUVECs内吞，随之形态改变出现大空泡，提示HUVECs激活。np20因摄取速度快、积累多可能导致HUVECs更强激活，经旁分泌信号增加hWJ-MSCs活力。反之少量m-HAP被HUVECs内吞，解释其对hWJ-MSCs代谢影响有限。

为探究激活HUVECs潜在成骨诱导效应，后续研究用亚细胞毒性剂量50 µg/mL HAPs。激活HUVECs的CM促进hWJ-MSCs胞外钙沉积、ALP活性、成骨蛋白表达及成骨基因mRNA表达（图4、5）。Runx2（指定成骨谱系关键转录因子）在np20组显著增强，表明对hWJ-MSCs强成骨诱导效应（图4a、5c、d）。np20组第7天COLI表达提高1.5倍，第14天翻倍，暗示HANPs处理组存在更多分化成骨细胞（图4b）。OCN（成熟期骨标志物）第14天HANPs组显著增加，指示np20和np80比m-HAP加速骨成熟（图4c）。ALP（成骨细胞早期分化标志物）随培养时间各组明显增加，尤np20组，揭示更多MSC向成骨细胞转化（图4d）。多能性标志物NANOG、OCT3/4、SOX2暗示分化能力，HANPs组基因表达下降（图4e–g）暗示大多数hWJ-MSCs在HAP组转化为成骨细胞。

数据显示HANPs被HUVECs内吞与hWJ-MSCs成骨分化改善相关，但原因不明。针对HUVECs旁分泌功能，重点关注激活HUVECs上清分化诱导可溶性蛋白。HIF-1α信号在骨再生中耦合成骨和血管生成至关重要。Heikal等报道受损EC甚至在常氧条件下分泌更多HIF-1α。HANPs暴露抑制HUVECs血管生成能力。测定CM中HIF-1α浓度，结果显示HANPs处理组HIF-1α含量高于m-HAP和对照组（图6a）。用特异性HIF-1α抑制剂2-MeOE2，HIF-1α浓度下降伴随hWJ-MSCs矿化基质沉积和ALP活性受损，表明HANPs促进HUVECs产生HIF-1α进而促进hWJ-MSCs成骨（图7）。

为合理应用HANPs于骨组织工程，需深入理解HANPs通过HUVECs促进hWJ-MSCs成骨分化机制。ERK1/2通路位于HIF-1α下游，是MSC分化基础。本研究CM中HIF-1α浓度与hWJ-MSCs p-ERK1/2水平吻合良好（图6b、c）。应用2-MeOE2后hWJ-MSCs p-ERK1/2表达激活受阻，证实HIF-1α位于ERK1/2信号上游。用MEK特异性抑制剂PD98059直接验证ERK1/2信号作用：抑制ERK1/2信号导致hWJ-MSCs成骨分化最低。可能原因：ERK1/2通路在HIF-1α信号、凋亡和增殖信号通路均起关键作用，导致观察到的成骨分化变化。也可能与血管内皮生长因子（VEGF）相关。VEGF是HIF-1α下游效应因子之一，也可通过激活ERK1/2通路促进MSC成骨分化。前研究发现np20诱导HUVECs产生VEGF；故抑制ERK1/2可能抑制VEGF，导致hWJ-MSCs成骨分化下降。综上：HANPs比m-HAPs具有更优直接和间接成骨诱导效应。与自体骨移植和异体骨移植相比，HANPs来源广泛、无二次损伤和潜在免疫原性。但HANPs抑制HUVECs血管生成能力，且呈时间和剂量依赖性轻微细胞毒性。

近年证据显示HIF-1α在骨再生中重要性，但鲜有研究能定量预测特定初始条件（如HIF-1α浓度）下MSC分化率。考虑细胞增殖、凋亡、成骨分化，我们提出结合双阶段细胞谱系与HIF-1α的数学模型，与实验数据高度相关。拟合0–4000 pg/mL HIF-1α下hWJ-MSCs分化率，得描述分化率、HIF-1α浓度、时间的方程。图8d显示模型可描绘不同HIF-1α浓度下细胞数图谱，可探究双阶段系统内在动力学。模型数学验证HIF-1α对hWJ-MSCs成骨分化影响。基于多阶段细胞谱系模型和Logistic模型，模型稳定性足以长期预测而不陷入种群无限爆炸陷阱。

利用现有实验数据，给定初始细胞播种密度和HIF-1α浓度可预测细胞数和分化率，从而获得最佳孵育时间。可预测最佳HIF-1α浓度和成骨最佳时间，对高效组织工程重要。双阶段细胞谱系模型适用于预测具有两个细胞谱系的干细胞增殖分化。基于初始条件和实验数据建立的模型可识别体外最佳培养条件，辅助优化体内骨修复。

结论

本研究探究HANPs通过HUVECs介导对hWJ-MSCs特定生物学效应。与m-HAPs相比，np20和np80均呈时间和剂量依赖性轻微细胞毒性，HANPs尺寸对细胞毒性无显著影响。重要的是，HANPs（尤np20）促进HUVECs分泌增加HIF-1α，直接关联通过激活ERK1/2通路增强hWJ-MSCs成骨分化（图9）。更值得注意的是，双阶段细胞谱系模型结果提示HIF-1α对hWJ-MSCs成骨分化率呈剂量依赖性促进作用。基于初始条件用体外模型估算最佳HIF-1α浓度和孵育时间，对未来组织工程应用极具价值。综上，这些观察提供证据：HANPs可通过调节细胞-细胞相互作用改善骨再生。