优化Cs_0.33WO₃纳米颗粒近红外触发热疗治疗HepG2肝癌

摘要

热疗因其无创性、副作用和毒性小、实施简便而成为治疗癌症最亲民的方法之一，推动了光热触发给药系统等新型治疗方法的发展。本研究探讨了Cs_0.33WO₃纳米颗粒（NPs）光热效应的变量——照射时长、光功率密度和NP浓度——对HepG2肝癌细胞系的体外影响，从而建立近红外（NIR）照射热剂量。具体而言，通过一系列氧化还原（REDOX）反应、热退火和湿法研磨工艺合成了粒径120 nm的NPs，并利用动态光散射（DLS）、能量色散X射线谱（EDS）、扫描和透射电子显微镜（SEM和TEM）、X射线衍射（XRD）及可见-近红外（VIS-NIR）光谱表征其物理、成分、光学和光热性质。获得了NPs及其照射参数对HepG2细胞的细胞毒性。通过孵育细胞与NPs验证内吞状态，在将含细胞培养皿的培养基温度维持在人体温度约36.5°C的条件下，确定细胞存活率对光热剂量可变参数的依赖关系。

引言

全球仅2018年癌症就夺走约1000万生命，新增病例估计达1800万[1]。迄今虽化疗、放疗、手术切除或三者组合使治疗癌症患者5年生存率略超40%[2,3]，但化学药物和离子轰炸的毒性不可避免地导致脱发、心脏毒性、不育、染色体异常等诸多副作用[4,5]。这种危及生命的后果强烈推动了以NPs掺杂化合物为代表的亲民治疗药物发展。

基于独特材料体系、结构、形状和亚100 nm尺度原子化学计量的纳米技术，产生量子化现象增强的前所未有的化学、物理和生化性质，已在生物医学科学许多分支找到临床前和体外应用[6,7]。尽管化疗有缺点，但NPs作为药物载体提高了患病肿瘤药物释放选择性，促进肿瘤细胞药物摄取，大幅降低健康组织累积毒性[8,9]。此外，基于NP的各种成像模式产生的图像质量因灵敏度更高、空间分辨率更精细、穿透深度更好而大幅提升，可揭示生物分布、监测药物摄取、定位肿瘤和评估治疗疗效[10]。除诊断功能外，NPs利用固有物理特性（如射频消融或光热热疗）可进一步以增强效率在目标位置诱导损伤[11-13]，其中光热热疗因其部位特异性给药、疼痛度低、副作用小、组织烧伤风险大幅降低而更受青睐。

迄今能在光照射下诱导热疗的NP材料体系包括金（Au）、铯钨酸盐（CsWO₃）、氧化铁、硫化铜、石墨烯和碳管，均展示了通过原位升高细胞外或细胞内温度对癌细胞施加致死损伤的适用性[14-18]。同NP增强射频消融一样，光子源入射功率密度水平是临床安全和患者舒适度的关键问题[11]，根据国际非电离辐射防护委员会（ICNIRP）2013年发布标准[19]，400-980 nm可见光和近红外波长范围内人皮肤最大暴露限为0.2-0.726 W/cm²。然而以往体外癌细胞研究报道的光功率密度远超皮肤组织安全限，这在用低光照阈值脆弱的内部生物组织治疗时可能是严重问题。例如，证明能有效破坏癌细胞的金（Au）NPs近红外光功率密度范围为2-80 W/cm²，照射不超过10分钟[13,14,20-22]。类似地，石墨烯氧化物[18]、铁铂（FePt）[23]、NaYF₄:Yb,Er纳米晶[24]等材料体系也需要不低于150 mW/cm²的功率密度。

作为体外实验中相对较少探索的材料，有研究报道用至少0.72 W/cm²的NIR照射CsWO₃ NPs消灭宫颈癌细胞（Hela）[15,25,26]，这接近ICNIRP设定的皮肤组织NIR波长暴露限，长时间暴露可能对健康组织造成有害影响[19]。此外，以往研究中NP浓度、光照时长和光强度组合产生的培养基温度远超40°C，这对健康人体细胞不可耐受，且癌细胞死亡率未详细界定。

CsWO₃ NP在800 nm至2400 nm近红外波长范围内具有极强吸收性[27]，适合生物医学应用。尽管其在消灭癌细胞方面展现出色疗效，但细胞毒性仍 largely unknown，且缺乏低细胞毒性NP浓度、短照射时长、光功率密度在皮肤组织安全光暴露限内的给药公式。

本研究旨在体外评估利用无细胞毒性NP浓度和远低于皮肤组织光暴露安全限的光功率密度，在维持细胞培养基温度正常人体温度36.5°C条件下，消灭培养在直径5.2 cm培养皿中HepG2肝癌细胞的可行性。详细而言，利用氧化还原反应、热退火和湿法研磨工艺序列合成平均特征尺寸约120 nm的Cs_0.33WO₃ NPs，并表征其表面形貌、结晶度、光学和时间依赖光热性质。此外，考察中心波长980 nm NIR照射的可变剂量参数——照射时长、NPs浓度和光功率密度——对HepG2癌细胞存活率的光热效应，以制定安全治疗剂量组合。

方法

本研究采用源自人原发肿瘤的第102代HepG2肝癌细胞系作为实验模型，评估NIR照射自制Cs_0.33WO₃ NPs施加的细胞毒性，并评估在皮肤组织暴露安全限内且无毒NP浓度下各种热剂量的治疗功效。

Cs_0.33WO₃ NPs的合成

图1左侧面板展示了铯钨酸盐（Cs_0.33WO₃）NP材料合成工艺流程图。简而言之，前驱体化学品（(NH₄)₂WO₄）（Alfa Aesar，99.9%纯度）和CsCl（Alfa Aesar，99.9%纯度）分别溶于100 mL去离子水，于25°C下以250 rpm恒定磁力搅拌混合1小时。搅拌完成后，将含混合溶液的烧杯温度调至180°C烘烤至水分完全蒸发。所得干燥白色粉末为Cs_0.33WO₃材料最终前驱体。开启冷却器后，将含前驱体粉末的石英舟装入高温炉管中心，将炉管内压力降至0.08 torr。随后在500°C下引入H₂和N₂混合气体（流量比90:10 SCCM）促进氧化还原反应1小时。之后关闭H₂气入口，将N₂流量调至100 SCCM，将炉温升至800°C热退火1小时。工艺完成后关闭冷却器和温控炉，待石英舟冷却至室温后从炉管取出。从石英舟获得的深蓝色粉末为微米（μ）级Cs_0.33WO₃粉末。为进一步缩小粉末颗粒特征尺寸，制备150 g混合溶液（含15 g微米粉、3.8 g防聚集共聚物分散剂、10 μl消泡剂和去离子水），倒入含600 g氧化锆珠的样品碗，安装在纳米研磨设备（Justnanotech Co.，台湾）腔室中。转速和温度设为2400 RPM和15°C，用0.1 mm ZrO₂珠研磨微米粉4小时，再用0.05 mm ZrO₂珠研磨4小时。每次研磨不超过4小时以避免流体粘度过大和材料物理尺寸异常变化。研磨后最终溶液经0.22 μm孔径滤膜过滤供后续表征和实验使用。荧光版Cs_0.33WO₃ NPs（fNPs）制备方案：制备2 ml浓度28 mg/ml荧光素溶液和2 ml浓度1.5 mg/ml Cs_0.33WO₃ NP溶液混合，在超声振荡器中振荡15分钟。随后将NP溶液与分散剂按1:1.25比例混合再超声振荡15分钟。所得溶液用去离子水洗涤，10,000 rpm离心15分钟，重复两次后方可使用。

材料表征

随后利用Zeta电位分析（ZS90，Malvern，英国）、XRD（D2 Phaser，Bruker AXS GmbH，德国）、SEM（SU-5000，日立，日本）配合内置能量色散谱（EDS）、TEM（JEM-2100F，JEOL，日本）、动态光散射（DLS）（Delsa Nano C，Beckman Coulter，美国）、UV-VIS-NIR分光光度计（V-750，Jasco，日本）表征Cs_0.33WO₃ NPs的统计特征尺寸、晶体结构、结构形貌、轮廓形状、VIS-NIR光吸收。XRD谱通过以4°/min扫描速率在20°-80°角度范围扫描X射线获得。将样品扫描角度依赖衍射信号与联合粉末衍射标准委员会（JCPDS）卡片No. 83-1334中Cs_0.32WO₃标准XRD谱比对。为确认NP光热性质的时间依赖性，搭建由980 nm NIR激光和温度测量探针组成的简单实验装置探测NIR照射溶液产生的温度状态。检测溶液包括去离子水稀释NP溶液和细胞培养基中NP溶液混合物。样品培养皿光束直径扩展至覆盖整个培养皿表面，产生估计0.05 W/cm²光功率密度，否则保持2 W/cm²不变。图1右侧面板所示光学装置用于NIR照射。光学系统核心是导向双凹透镜的NIR激光束，将光束直径从4 mm扩展至5.2 cm（相当于培养皿表面直径），培养皿置于设定为36.8°C热板上（细胞生长生理温度）；培养皿周围有塑料圆柱外壳帮助平衡环境温度和培养基温度。附件1：图S1展示了NIR激光束在光束孔径出口处的光强映射（图1中激光束旁红箭头指示位置）。光束剖面呈现光强三维分布，验证了整个培养皿开口处光场均匀性。

细胞毒性和光热实验

开始细胞培养循环，制备500 ml培养基溶液：440 ml汉氏营养混合物F-12和杜尔贝科改良鹰必需培养基（HDMEM）、50 ml胎牛血清（FBS）、5 ml L-谷氨酰胺和5 ml P/S（青霉素-链霉素），经0.22 μm孔径网滤器灭菌。装有细胞的培养皿，直径10 cm或5.2 cm，分别加入8 ml和2 ml培养基用于原代和传代培养，在5% CO₂、37°C培养箱中培养。每两天观察细胞生长并更换培养基一次。

为获得四种情况的细胞存活率：（1）无外部输入对照，（2）单独NIR照射，（3）NPs孵育，（4）NPs孵育后NIR照射，操作如下：吸出培养皿培养基，加入0.4 ml胰蛋白酶放入培养箱约10分钟。确认细胞从皿壁脱离后，从培养皿吸取10 μl含细胞培养基加入离心管中10 μl台盼蓝溶液，通过多次磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤去除残留悬浮NPs。随后用计数板计数：将10 μl染色细胞溶液通过注射孔加入计数板，在体视显微镜焦平面观察并用手动计数器计数；所有图表中细胞存活率数据点均为三次实验试验（N=3）平均值加标准差。

为评估NP细胞毒性及其对细胞存活率的光热效应，吸出5.2 cm培养皿培养基，重新加入适量新培养基中的NP溶液制成测试浓度阵列：2、1.5、1、0.5 mg/ml，孵育一天后实验。

光热实验前先评估细胞毒性，检查细胞对NP浓度阵列的反应：将含细胞和NPs培养基从培养箱取出吸出。用1 ml预热PBS洗涤癌细胞并吸出未发生内吞的残留悬浮CsWO₃ NPs，重复数次确保新培养基中NP诱导温度升高不导致潜在细胞死亡。光热处理后对细胞实施计数程序进行细胞毒性和光热实验。

结果

Cs_0.33WO₃纳米材料的光学吸收和光热性质高度依赖晶体结构、退火后温度、原子化学计量和颗粒特征尺寸[28,29]。

为表征Cs_0.33WO₃微米粉表面形貌，获取10,000倍放大SEM图像，图2a红箭头指示标志性柱状六方结构。此外，TEM图像展示微米粉颗粒轮廓形状和特征尺寸（图2b），特征尺寸约1 μm或更小。NPs棒状几何形状和DLS纳米级特征尺寸分布直方图（中心约120 nm）也得到验证，见图2c及对应插图TEM图像。微米粉和NPs晶体表征XRD结果见图2d。从顶部微米粉XRD谱可见，沿(002)、(102)、(200)、(112)、(202)、(212)、(004)、(220)、(222)、(204)、(400)、(224)标志性结晶面与JCPDS卡片No. 83-1334中Cs_0.32WO₃标准谱吻合良好。当微米粉特征尺寸缩小至120 nm时，所有衍射峰强度单调降低，一些指示强NIR吸收的特征峰如(102)和(220)晶面在谱中变得不可见。同样，图2e原子成分铯（Cs）、钨（W）、氧（O）的鉴定不仅确认其原子存在，还验证Cs与W原子百分比比率0.315，接近最初设计化学计量比。

在材料表征基础上，测量了NPs光学吸收光谱和时间过程光热调温，见图3。图3a、b描绘了NIR吸收率及NIR照射NP溶液温升剖面对NP浓度的依赖关系，例如1 mg/ml时间-温度曲线峰值超40°C并稳定维持至少1小时，确认材料光热稳定性和耐久性。同样，图3c时间-温度剖面展示190分钟内5个重复循环，验证NP材料光热响应性。图3d中，从培养箱取出的培养基和NP掺杂培养基置于热板上经NIR照射，温度在10分钟内稳定在约37°C；NIR照射纯NP溶液温度从24.6°C升至33.6°C（10分钟后）。因此考虑NP光热功能，后续实验NIR照射时长设为10、30、60分钟，保持实验期间NPs鲁棒性并潜在适用于临床前研究。

随后通过在50 mW/cm²下照射细胞1小时和2小时，以及直接与0.5、1、1.5、2 mg/ml浓度NPs相互作用，确定无毒实验参数剂量（照射时长和NP浓度），见图4a、b。细胞存活率在2小时NIR照射过程中保持95%以上，确认细胞对980 nm光子长期暴露无毒性；也确定了1.5 mg/ml以下无毒NP浓度。

以1.5 mg/ml或更低浓度给药（对HepG2细胞几乎无损伤）旨在不包含NP固有毒性暗示下考察光热剂量对癌细胞影响。为考察NIR照射NPs能否成为消灭癌细胞的可行方案，细胞用1.5 mg/ml NPs孵育一天，随后施加NIR辐射1小时。从图5d-f明场（BF）光学图像可见，暴露时间持续1小时（e）或2小时（f）时细胞数量明显减少。定量上，存活率随照射时长从10分钟增加到1小时单调从84.2%下降至58.4%，线性趋势线很好拟合离散数据点，预测照射2小时存活率20%。此外，图5h显示1小时照射下，光功率密度从12.5增加到50 mW/cm²时存活率从73%下降至58%，确定NIR照射NPs作为光热触发器破坏癌细胞的功能性。

此外，通过制备fNPs、进行相同洗涤孵育程序、观察fNPs细胞内存在情况，解决了光热作用是胞内还是胞外方式的不确定性。图6展示了带/不带fNPs孵育细胞的共聚焦BF（b、e）和荧光（a、d）图像及其叠加合成图（c、f）。显然，未孵育fNPs的对照组细胞呈现可忽略绿色荧光，主要归因于细胞自发荧光，与实验组所有细胞质中绿色荧光无处不在形成鲜明对比。对照组和实验组图像平均荧光强度也量化呈现在图6g直方图中，内吞fNPs荧光强度至少是对照组九倍。

讨论

利用电磁波热疗治疗癌症概念可追溯至1900年代初，曾成功治愈某些恶性肿瘤，但因诱热抗菌剂有用性和缺乏精确接触局部肿瘤而衰退[30]。直到1980年代，随着发现热疗后代谢变化、肿瘤微循环改变和酸解产生对癌细胞致死效应的体外研究，兴趣复苏[31]。机制上，除直接细胞毒性（施加温度>42°C时癌细胞坏死、凋亡减少）外，血流速率降低伴随冷却能力下降和低pH（<6.8）使癌细胞更易受热，从而导致更高杀细胞率[32,33]。然而临床上，因世纪老问题的非特异性定位不精确，热疗仅在与化疗或放疗联用时才显示增强治疗功效[34,35]。

允许精确靶向和监测、具有表面电荷、荧光、光热转化等广泛物理性质的NP基材料恰好填补了热疗应用中此类不精确的空白。然而尽管许多NIR照射NP材料在癌细胞研究中证明有用，光暴露安全限往往未被充分考察，如CsWO₃ NPs情况。CsWO₃ NPs虽在1.5 mg/ml时细胞毒性相对较低（图4b），比Ag、Au、石墨烯等少数流行NP材料（其阈值在1 μg/ml量级[18,36,37]）好，但尽管在800-2400 nm波长范围内有强NIR吸收[15,25,26]，仍需0.7 W/cm²有效破坏Hela细胞。

本研究旨在为体外HepG2癌细胞设计有效的NIR照射触发、Cs_0.33WO₃ NP基热给药公式，作为NP浓度、照射时长和光功率密度的函数，均远在皮肤组织NIR暴露安全限内。

实验从NPs合成开始，图1概述了包括氧化还原反应、退火工艺和湿法研磨方法的分步合成程序。氧化还原反应在适当物理环境下将大型三元元素（本例中Cs）掺入WO₆八面体环结构，允许形成特殊晶体结构并将自由电子掺入金属分子化合物，这是NIR吸收时强光热转化的内在原因[26,27]。后续退火和湿法研磨工艺有助于优化晶体形成并减小颗粒特征尺寸，进一步增强NIR光热转化。随后合成NP溶液进行一系列物理材料表征，验证平均特征尺寸120 nm（NIR吸收关键优化）并认证原子组成（图2）。此外，0.5、1、1.5 mg/ml对应Zeta电位分别为-53.2、-54.3、-60.1 mV。通常液相内吞是大多数NP类型主要进入途径，阳离子和离子NPs对非吞噬细胞摄取率高于中性实体，前者优于后者[38]。许多先前报告发现负电荷NPs对非吞噬细胞毒性较低[39,40]，这是考虑光热剂量伴随过量细胞内NP积累且低毒性时的有益优势。

为建立HepG2细胞光热实验基调，演示了NPs作为光热加热器的鲁棒性、在环境平衡下饱和温度长期稳定性（1小时以上）和3小时内5个连续循环重复性（图3b、c）。此外，为量化NP热疗本身对癌细胞给药效果（排除环境温度名义上25°C影响），通过将热板设为37°C（所有细胞实验在此进行）校准实验装置，纯培养基和NP掺杂培养基时间光热特性维持在37.1°C（图3d）。随后分别考察细胞毒性对照射时长和NP浓度依赖性，见图4，显示2小时以上NIR照射和1.5 mg/ml作为致死浓度关键点，细胞杀伤率<5%。固定NP浓度1.5 mg/ml（贯穿后续光热实验），将医学热疗热剂量定义为可变给药时长和光功率密度函数。图5展示了实施NIR照射0、1、2小时时低（a-c）和高（d-f）放大倍数下的杀细胞作用，细胞数量看似减少与图5g细胞存活率定量分析吻合，线性趋势线预测2小时照射80%细胞死亡。同样，图5h展示了增量光功率密度下细胞存活率下降。最后，如图6明场、荧光和叠加合成图像清晰显示（其中呈现荧光分析直方图），验证了fNPs内吞作用。

结论

总之，本研究展示了Cs_0.33WO₃ NPs材料合成表征，考察了直接NPs相互作用和NIR照射下的体外细胞毒性实验，证明了NPs内吞作用及NIR照射NPs破坏HepG2癌细胞的有效性。此外，研究建议HepG2癌细胞NIR照射Cs_0.33WO₃ NPs溶液组合剂量：1.5 mg/ml NP浓度、照射时长30分钟至1小时、NIR照射光功率密度50 mW/cm²以下（远低于皮肤组织NIR暴露安全限），允许癌细胞死亡率接近40%，潜在适用于亲民和个性化医学发展。临床应用将需要额外措施，如用识别特定癌细胞表面受体的分子进行表面修饰。