优化Fe3O4-Au核壳纳米颗粒摄取实现结直肠癌细胞靶向内吞

摘要

磁铁矿（Fe₃O₄）-金（Au）核壳纳米颗粒（NPs）具有独特磁性和光学性质。结合生物配体，这些NPs可为药物递送和癌症靶向等生物医学应用提供新策略。本文提出一种可控细胞摄取磁性核壳NP系统的有效方法，结合生物配体。结构蛋白波形蛋白经生化实证能强效影响吞噬作用，且在多种生物配体抑制下仍影响外源物质内化。研究展示了Fe₃O₄-Au核壳NPs经生物配体组合表面修饰后的细胞内化表现。波形蛋白标记NPs的光荧光在多重抑制测试中不受影响，表明NPs极少受尼斯汀、戴纳泊、细胞松弛素D甚至Muc1抗体（Ab）影响。结果表明Muc1 Ab可靶向特定分子并控制特定内吞作用。此外，展示了在结直肠癌细胞中控制特定内吞的可能性。

引言

纳米材料为临床诊断和治疗开辟新途径。纳米颗粒（NPs）是最重要工具之一，应用于生物传感器、诊断、靶向药物递送系统。生物医学应用中，NPs通常由核心材料外包有机材料组成。核心材料含磁性、半导体或其他材料，具有有用理化性质；外层有机表面提供化学稳定性和功能性。生物靶向系统中，不仅理化性质，而且生物功能化的外层有机表面是关键参数。功能化靶向配体如针对靶点的抗体或配体。NPs外表面生物功能化材料决定其内吞机制。NPs进入细胞的机制因纳米医学应用重要性而成为近年研究热点。

磁性NPs广泛用于特定部位靶向应用：细胞分选、MRI、DNA分离、药物递送、热疗、癌症靶向。各种磁性NPs中，磁铁矿纳米晶因生物相容性和化学稳定性最广泛用于生物医学。尽管大量研究致力于磁性NPs生物医学应用，仍存关键问题：水溶液中良好分散性、功能性、生物相容性。为解决这些问题，许多研究聚焦用各种官能团（如羧基、氨基）修饰NPs表面。但将官能团连接到磁铁矿NPs表面耗时费力。鉴于此，核壳型Au包覆磁性NPs因Au表面易连接生物分子和有机材料而具有吸引力。

磁性核-Au壳NPs的磁性可实现磁分离、提高MRI分辨率、用于热疗。Au优越化学结合性质有利于构建受体介导递送系统实现特异性癌症靶向。过去几十年，许多研究者报道用于癌症靶向的受体介导递送系统。受体介导癌细胞靶向属主动靶向。靶点选择是有效主动靶向关键，靶点必须在细胞外膜过表达。多数研究者用单克隆抗体治疗癌症，结合常规化疗可大幅提高疗效。但单克隆抗体在癌症靶向有局限：大尺寸（~150 kDa）阻碍肿瘤渗透；稳定性差、溶解度低限制广泛应用；连接在载体上取向不均导致非特异性结合。为改善肿瘤渗透，设计测试多种抗体格式。骆驼科动物天然存在重链抗体（HCAbs），其抗原结合片段由单个结域组成，即骆驼HCAb重链可变区（VHH）。克隆表达于细菌或真菌后获得的VHH称纳米抗体，分子量11-15 kDa，是所有单抗中最小。小尺寸使其潜在适合作隔离位置抗原靶向探针，易修饰末端利于癌症靶向。

NPs高效递送、合适靶向和细胞内化也是递送系统重要因素。报道波形蛋白在病原体附着和细胞内进入途径中起重要作用。沉默波形蛋白基因表达抑制吞噬作用，而裂解波形蛋白显著增加吞噬作用。因此中和细胞表面波形蛋白引起的吞噬阻力对高效纳米颗粒递送至关重要。

本研究调查纳米抗体标记的Fe₃O₄-Au核壳NPs经不同长度PEG（聚乙二醇）间隔臂修饰后的内吞途径。波形蛋白经生化实验证实强效影响吞噬作用，作为对照确认其有效作用于NPs细胞内化。此外，Muc1作为细胞表面糖蛋白，在胰腺、乳腺、肺、胃等多种癌症中过表达，作为癌症靶向生物标志物。确认了Fe₃O₄-Au核壳NPs高效内化及通过Muc1受体介导内吞途径在结肠细胞中可控靶向癌细胞的方法。

材料与方法

材料

醋酸金(III)（Au(OOCCH₃)₃，99.9%）购自Alfa Aesar。其他化学品包括乙酰丙酸铁(III)（Fe(acac)₃，99.9%）、1,2-十六烷二醇（C14H29CH(OH)CH2(OH)，90%）、聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)（PEG-PPG-PEG）、辛基醚（C8H17OC8H17，99%）购自Sigma-Aldrich现用。α-吡啶基-2-二硫代-ω-羧基琥珀酰亚胺酯聚(乙二醇)（OPSS-PEG-NHS）（2K、5K、10K）购自Nanocs。碳酸氢钠、WST-1、氯丙嗪、尼斯汀、细胞松弛素D、戴纳泊、反折霉素A（BFA）、莫能菌素、台盼蓝购自Sigma-Aldrich。Cy3和Cy7.5购自Lumiprobe。抗Muc1 Ab购自Abcam Inc.（剑桥，MA）。磷酸盐缓冲液（PBS）、Dulbecco改良Eagle培养基、胎牛血清购自Invitrogen Corp.

Fe₃O₄-Au核壳NPs合成

采用纳米乳液法合成Fe₃O₄-Au核壳NPs。合成分两步：(1) 形成Fe₃O₄核NPs；(2) 在磁性NPs表面包覆Au壳。第一步：Fe(acac)₃（0.1766 g或0.5 mmol）、1,2-十六烷二醇（0.6468 g或2.5 mmol）、嵌段共聚物（聚(乙烯氧化物)-聚(丙烯氧化物)-聚(乙烯氧化物)；PEO-PPO-PEO）（0.4~1.2 g）在辛基醚中混合。混合溶液加热至300 °C还原Fe前驱体。冷却完成Fe₃O₄核NPs形成。第二步连续进行无需纯化：加入Au前驱体（0.2338 g或0.62 mmol）和1,2-十六烷二醇（0.88 g，3.4 mmol）至含Fe₃O₄ NPs乳液中，加热至230 °C。冷却至室温后离心沉淀，分离核壳NPs。

重组抗Muc1-VHH 5-24 K10表达载体构建

聚合酶链式反应（PCR）使用正向引物5'-CCGAATTCGCCGATGTGCAGCTGACCGAG-3'和反向引物5'-CGG CTCGAGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTGCCTGAGGAGACGGTGACCTG-3'。PCR产物经EcoRI和XhoI酶切，QIAquick胶回收试剂盒（QIAGEN，Valencia，CA，USA）胶回收纯化。纯化产物克隆入EcoRI/XhoI酶切pET-23a（Novagen，Darmstadt，Germany）。大肠杆菌（E. coli）DH5α（RBC Bioscience，Xindian，Taiwan）热休克转化，LB琼脂平板含100 μg/ml氨苄青霉素（Duchefa Biochemie，Haarlem，Netherlands）筛选。

重组蛋白表达纯化

表达纯化重组抗Muc1-VHH 5-24 K10蛋白：E. coli BL21菌株（RBC Bioscience，Xindian，Taiwan）转化pET-23a-anti-Muc1-VHH 5-24 K10。细菌在含氨苄青霉素（100 μg/ml）LB液体培养基生长。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）（Duchefa Biochemie，Haarlem，Netherlands）终浓度0.4 mM诱导表达，37 °C，5 h。菌体沉淀重悬裂解缓冲液（50 mM NaH₂PO₄，pH 8.0；300 mM NaCl），冰上超声10 min。超声裂解液20,000×g，4 °C离心20 min，上清液经Ni-NTA His·Bind Resin（Peptron，Daejeon，Korea）纯化。His标签蛋白用洗脱缓冲液（50 mM NaH₂PO₄，pH 8.0；300 mM NaCl；150 mM咪唑）洗脱。纯化蛋白15% SDS-PAGE胶分离。

核壳Fe₃O₄-Au NPs修饰

不同长度（2、5、10 K）OPSS-PEG-NHS溶于0.1 M碳酸氢钠激活巯基。激活OPSS-PEG-NHS加入合成核壳Fe₃O₄-Au NPs溶液，4 °C振荡12 h。激活OPSS-PEG-NHS巯基与核壳NPs Au表面共价连接。随后加入纳米抗体溶液（0.25 mg/ml），4 °C孵育12 h。纳米抗体末端十个赖氨酸（K）尾氨基与OPSS-PEG-NHS琥珀酰亚胺基在pH 8.3共价连接。Cy3和Cy7.5标记纳米抗体残余氨基。

内化曲线测定

CT26细胞接种密度5×10³孔于透明底96孔板，250 μl培养基中37 °C、5% CO₂黑暗培养24 h。吸除培养基，加入含50 μg/ml Cy3标记Fe₃O₄-Au NPs、PEG-Cy3或PEG-纳米抗体-Cy3标记NPs的250 μl新鲜培养基。进一步孵育不同时间（0、10、20、30、60、120、360 min）。用PBS洗涤三次去除游离NPs，用台盼蓝作为膜不透性荧光猝灭剂，用SpectraMAX GEMINI（Molecular Devices，CA，USA）测量各孔荧光。每实验NPs量相等（50 μg/ml），重复三次。

抑制实验

CT26细胞同前接种培养24 h。吸除培养基，加入含20 μg/ml氯丙嗪（CPZ）、50 μg/ml尼斯汀、20 μg/ml细胞松弛素D、25 μg/ml戴纳泊、20 μg/ml BFA、140 μg/ml莫能菌素或5 μM抗Muc1 Ab的250 μl新鲜培养基，孵育1 h。再吸除培养基，加入含50 μg/ml Cy3标记Fe₃O₄-Au NPs、PEG-Cy3标记NPs、PEG-纳米抗体-Cy3标记NPs或波形蛋白-Cy3标记NPs的250 μl培养基。37 °C、5% CO₂孵育1 h后，PBS洗涤三次去除游离NPs，用台盼蓝猝灭剂测量荧光。每实验NPs量相等（50 μg/ml），重复四次。

结果与讨论

核壳NPs按文献法合成[16,17]。透射电镜（TEM）观察（图1a,b）显示Fe₃O₄-Au核壳NPs球形，平均直径13.5 nm，尺寸分布窄。核NP（Fe₃O₄）~8.5 nm增加到~13.5 nm源于核表面包覆~2.5 nm厚Au壳。高分辨TEM配合快速傅里叶变换（FFT）分析见补充图S1。有机溶剂中产物经磁分离纯化转入水中。核壳NPs因残留嵌段共聚物在水中分散稳定无需表面修饰。图1c、d显示水溶液中NPs施加外磁场前后：外磁场下核壳NPs从均匀分散（图1c）快速变为清澈透明溶液（图1d）。UV-Vis光谱测定吸收带：图1e显示~530 nm处吸收峰，表明NPs表面存在Au（补充图S2含Fe₃O₄-Au核壳NPs EDX数据）。纯化后光学结果证实核壳结构形成。振动样品磁强计测磁滞回线考察Fe₃O₄核和核壳NPs磁性：两者室温均呈超顺磁行为，矫顽力近0 Oe（图1f）。前人报道核壳NPs磁化率高于磁铁矿NPs，部分归因于邻近效应和独特空间构型[41,42]。核NPs和核壳NPs饱和磁化分别约37 emu/g和21 emu/g（10 kOe），差异源于核壳NPs中非磁性Au成分。

VHH 5-24 K10基因经PCR扩增克隆入框产生pET-23a-anti-Muc1-VHH 5-24 K10（图2a）。重组蛋白在转化pET-23a-anti-Muc1-VHH 5-24 K10的E. coli BL21中经IPTG诱导表达，Ni-NTA His·Bind Resin纯化。重组抗Muc1-VHH 5-24 K10在E. coli中以可溶性18 kDa蛋白高表达。1 L培养得1±0.5 mg纯化重组抗Muc1-VHH 5-24 K10。纯化蛋白经15% SDS-PAGE胶验证，考马斯亮蓝染色显示纯度>95%（图2b）。合成Fe₃O₄-Au NPs经三步修饰：PEG化、抗体标记、荧光染料标记（图2c）。每步修饰后测zeta电位确认修饰成功。表1显示修饰步骤对zeta电位影响。裸核壳NPs zeta电位-19.8±6.68 mV。PEG化用OPSS-PEG-NHS，为制备不同尺寸纳米复合物用不同长度（2K、5K、10K）OPSS-PEG-NHS。PEG化后zeta电位降低（2K、5K、10K分别为-44.9±8.19、-40.7±7.88、-39.6±8.74 mV）。纳米抗体标记后zeta电位明显升高（2K、5K、10K分别为-38.5±5.61、-23.3±8.61、-31.8±7.37 mV）。荧光染料标记后zeta电位进一步升高（2、5、10K分别为-12.5±7.25、-17.7±3.94、-10.6±4.72 mV）。裸Fe₃O₄-Au核壳NPs zeta电位-19.8±6.68 mV，PEG化后降至近-40 mV，表明PEG分子通过共价键良好结合Au壳（PEG带负电琥珀酰亚胺基）。纳米抗体标记后zeta电位升高（NP-PEG2K-纳米抗体-38.5±5.61 mV；NP-PEG2K-纳米抗体-染料-12.5±7.25 mV），因重组纳米抗体末端有十个赖氨酸尾。各类纳米抗体经zeta电位测量分类，测量各纳米抗体荧光确定抗体结合情况。

图3显示无抑制剂限制时所有类型NPs和纳米抗体在CT26黏液细胞中均有良好细胞摄取内化。细胞内化曲线：细胞孵育含50 μg/ml Cy3标记Fe₃O₄-Au NPs、PEG-Cy3标记NPs、PEG-纳米抗体-Cy3标记NPs不同时间（0-360 min），除去培养基、洗去游离NPs，用台盼蓝测总荧光（图3）。荧光强度测定结果显示NPs在1 h内内化入细胞（图3a）。荧光强度1 h内达最大，达稳态后逐渐下降。虽有无抗体略有时差，但单位培养时间荧光强度与裸NPs无显著差异（图3b）。图3c证实异源Muc1抗体和波形蛋白抗体对NPs细胞摄取内化影响可忽略。

WST-1测定CT26黏液细胞活力随Fe₃O₄-Au核壳NPs浓度和表面修饰变化（图4a,b）。24 h和48 h暴露后，无论剂量变化或NPs表面修饰，CT26细胞活力无显著差异。裸Fe₃O₄-Au NPs（图4a）和表面修饰NPs（图4b）细胞活力均>90%。

图5表明NPs通过多种内吞途径进入CT26黏液细胞（网格蛋白介导、小窝介导、吞噬/大胞饮途径）。有趣的是，图5b显示抗Muc1 Ab主要影响PEG-纳米抗体-Cy3标记NPs内吞。为理解NPs内化途径，用特定化学抑制剂抑制内吞途径（图5）。内吞途径公知分三类：网格蛋白介导、小窝介导、大胞饮/吞噬。本研究用抑制剂作为首选方法探究纳米抗体标记NPs内化。CPZ（网格蛋白介导内吞抑制剂）、尼斯汀（小窝介导内吞抑制剂）、戴纳泊（动力蛋白抑制剂）、细胞松弛素D（吞噬/大胞饮抑制剂）、BFA（高尔基体破坏剂）、莫能菌素（溶酶体抑制剂）、抗Muc1 Ab（受体/转运体特异性竞争者）与细胞孵育1 h。CPZ、尼斯汀、戴纳泊、细胞松弛素D影响NPs内吞（图5a）。

靶向配体是癌症靶向成败关键，在癌症治疗中极重要。有效表面修饰对提高治疗效率、限制副作用至关重要。纳米抗体标记Fe₃O₄-Au核壳NPs由合成NPs和重组纳米抗体成功制备。表1清楚显示每步修饰成功进行。细胞活力是纳米材料生物应用必要要素。裸核壳NPs和修饰NPs细胞活力均>90%（图4a,b），表明裸Fe₃O₄-Au NPs和修饰NPs无显著浓度和修饰依赖性细胞毒性，修饰NPs适合生物应用。

内化效率研究和抑制剂效应提供理解NPs进入细胞机制的重要信息。PEG化NPs内化较裸NPs慢，但纳米抗体标记NPs内化略快于裸NPs（图3a,b）。PEG化是防止NPs内化著名表面修饰法，PEG化NPs内化倾向易解释。纳米抗体诱导NPs内吞。为检验纳米抗体特异性，确认波形蛋白Ab标记NPs内化率。有趣的是，波形蛋白Ab标记NPs不促进细胞内化（图3c）。

结果表明纳米抗体能有效诱导纳米材料内化入CT26黏液细胞，暗示NPs外膜特异性修饰可控制内化倾向。此外，纳米抗体标记NPs内吞机制通过抑制实验和共聚焦显微成像清晰展示。纳米抗体标记NPs和非标记NPs荧光在CPZ、尼斯汀、戴纳泊培养下显示相似下降值（图5a,b）。CPZ、尼斯汀、戴纳泊分别抑制网格蛋白介导内吞、小窝介导内吞、动力蛋白（大GTP酶，参与新生囊泡从母膜出芽和切离）。因此两者荧光值急剧下降，因动力蛋白与网格蛋白和小窝介导内吞囊泡生成密切相关。图5a显示非标记（图5a）和纳米抗体标记NPs（图5b）荧光均快速下降。特别是纳米抗体标记NPs在CPZ、尼斯汀、戴纳泊中显示显著更低荧光值。此外，非标记NPs在细胞松弛素D（阻断肌动蛋白聚合用于吞噬的细胞渗透毒素[43]）作用下受影响更强。这意味着非标记NPs通过网格蛋白介导内吞、小窝介导内吞、吞噬等多种机制内化。因此，纳米抗体标记NPs细胞内化依赖网格蛋白介导和小窝介导内吞。此外，细胞与Muc1抗体共培养时纳米抗体标记NPs细胞摄取量显著减少（图5b）。这表明游离Muc1抗体作为纳米抗体竞争者结合CT26细胞膜，Muc1抗体在修饰NPs细胞内化中起重要作用。特别地，波形蛋白Ab标记NPs在抑制能力上与纳米抗体标记NPs显著不同。波形蛋白标记NPs荧光在多重抑制测试中不受影响，表明NPs极少受尼斯汀、戴纳泊、细胞松弛素D甚至Muc1 Ab影响。这可能是波形蛋白经生化实证强效影响吞噬作用[39]的证据。因此结果表明Muc1 Ab可靶向特定分子并控制特定内吞作用。

图6显示用Cy7.5标记裸核壳NPs和PEG-纳米抗体标记NPs处理细胞得类似结果，无戴纳泊抑制时两者细胞摄取相似。戴纳泊抑制导致PEG-纳米抗体标记NPs细胞内化显著低于裸NPs（图6b底行）。结果暗示存在两种内吞机制：裸NPs非特异性内吞和纳米抗体标记NPs经动力蛋白分子限制性内吞。一旦纳米抗体附着细胞外膜，纳米抗体标记NPs可通过同时激活网格蛋白和小窝介导机制轻松穿过细胞膜。因此推测纳米抗体标记NPs在CT26黏液细胞内化主要机制为网格蛋白介导和小窝介导内吞。

结论

用于癌症靶向和外源物质（药物、基因、肽）可控插入的纳米材料是生物医学应用关键进展。这些熟悉而创新的概念可为新治疗方法提供策略。本文展示了Fe₃O₄-Au核壳NPs经PEG化修饰Muc1抗体后增强细胞摄取。演示了纳米抗体标记NPs主要内吞机制，显示结直肠癌细胞中可控特异性内吞可能性。这些发现为纳米抗体标记NPs与结直肠癌细胞靶向提供洞见，助力设计高效靶向载体。