通过激光辅助方法在玻璃上沉积抗体修饰的上转换纳米颗粒以提高细胞培养性能

介绍

上皮细胞存在于人体的内外表面，包括皮肤、肠道、呼吸道和生殖道。上皮细胞不仅提供了抵御污垢和微生物的安全外壳，而且还表现出重要的功能，例如拉伸、轨迹等 [1]。因此，上皮细胞已广泛用于组织工程和组织再生。上皮细胞与基质表面之间的相互作用对于维持细胞的功能和通讯至关重要。通常，应用基于蛋白质的涂层，例如鼠尾胶原蛋白，以使上皮细胞在培养皿或玻璃上生长，以进行进一步研究。最近，涂覆在基材上的纳米材料证明了通过利用纳米结构涂层的精细形态、特殊纹理/图案来控制细胞生长的潜力 [2,3,4]。此外，由于其高度稳定的光致发光特性，发光纳米材料在研究细胞-细胞和细胞-表面的相互作用方面显示出优于传统有机染料的显着优势。发现细胞与涂有蛋白质修饰的发光纳米结构的表面之间的相互作用很有趣。

上转换现象于 1959 年首次被研究，是连续吸收两个或多个光子以发射高能量光 [5, 6]。镧系元素掺杂的上转换纳米粒子 (UCNPs) 由三种不同的成分组成，包括活化剂、敏化剂和宿主基质。 Er ³⁺ 等镧系元素 , 何 ³⁺ , 和 Tm ³⁺ 由于它们具有独特的能级结构，因此可以起到活化剂的作用 [7,8,9,10,11]。 Yb ³⁺ 离子是最常见的敏化剂，可用于将能量从激发光转移到活化剂 [12,13,14]。氧化物材料和氟化物材料通常用作晶体主体 [15,16,17]。上转换纳米粒子在近红外 (NIR) 光的激发下发射可见光到近红外范围的光，可应用于深层组织生物成像，因为近红外光的散射系数较低，被称为“治疗窗口” ” [18]。最近，UCNP 的各种表面改性已被开发用于生物标记/传感 [19, 20]。例如，将抗生物素蛋白偶联到 UCNPs 表面修饰的己二酸 (HAD) 上，以证明与抗体的相互作用 [21]。 ssDNA 修饰的核壳 UCNPs 被开发用于检测特定的寡核苷酸 [24]。

另一方面，免疫球蛋白 G (IgG) 是一种在血液和细胞外液中发现的抗体，可控制组织的感染。研究了 IgG 与纳米粒子之间的相互作用，如 IgG 可作为模板制备金纳米粒子，IgG 修饰的磁性纳米粒子可用于标记细菌细胞 [22, 23]。然而，将IgG修饰到UCNPs上用于细胞培养或组织培养的报道很少。

溶胶-凝胶法、旋涂和溶剂蒸发等传统方法已应用于将生物分子修饰的纳米粒子沉积在用于生物医学检测的基材上 [27, 28]。然而，用于沉积蛋白质或基于蛋白质的纳米结构的溶液涂层方法很难将污染降至最低。激光沉积的厚度控制良好，避免了化学沉积中发生的操作污染。很少有激光沉积技术用于开发基于蛋白质的细胞培养表面。

与传统的物理沉积方法不同，基质辅助脉冲激光蒸发 (MAPLE) 技术不直接烧蚀目标材料；相反，大部分激光能量被冷冻溶剂（基质）吸收 [24, 25]。在 MAPLE 工艺中，分散在高挥发性溶剂（基质）中的目标材料被引入到用液氮冷却的目标支架中 [26,27,28,29,30]。在激光照射下，目标材料可以通过蒸发溶剂传输到基板上。 APLE 技术已应用于各种领域，包括传感器、有机电子设备、药物输送、植入物涂层等 [31,32,33,34,35]。然而，关于MAPLE沉积的生物分子/蛋白质纳米粒子的基质对细胞培养性能影响的报道很少。

在这项研究中，我们生产了 UCNPs (NaGdF4:Yb ³⁺ , 呃 ³⁺ ) 和免疫球蛋白 G (IgG) 修饰的 UCNPs (UCNPs-IgG) 通过水热法。之后，通过使用 MAPLE 工艺和 532 nm Nd:YAG 激光，将带有/不带有 IgG 修饰的 UCNP 直接沉积在细胞培养皿的玻璃底部。将人脐静脉内皮细胞 (HUVECs) 接种在 UCNPs 沉积的玻璃上，研究 UCNPs 涂层的细胞毒性和细胞在 UCNPs 处理表面的行为。

方法/实验

材料

六水合硝酸钆 (III)（Gd (NO3)3·6H2O，晶体和块状，99.9% 微量金属基础）、五水合硝酸镱 (III)（Yb (NO3)3·5H2O，99.9% 微量金属基础）、铒 ( III) 五水硝酸盐（Er (NO3)3·5H2O，99.9% 微量金属基础），氟化钠（NaF，BioReagent，适用于昆虫细胞培养，≥ 99%），支化聚乙烯亚胺（PEI，LS 平均 Mw ~ 800， GPC 平均 Mn ~ 600）、山羊中产生的抗人 IgG（Fab 特异性）-FITC 抗体（亲和分离抗体、缓冲水溶液）、4',6-二脒-2'-苯基吲哚二盐酸盐 (DAPI) 和鬼笔环肽– 四甲基罗丹明 B 异硫氰酸酯 (Phalloidin-TRITC) 购自 Sigma-Aldrich。乙二醇 (EG) 购自 Fisher 化学公司。异丙醇（2-丙醇）购自 Caledon 实验室化学品。

使用一锅法合成含和不含 IgG 的 UCNPs

UCNPs (NaGdF4:Yb ³⁺ , 呃 ³⁺ ) 是通过改进的一锅法合成的 [36]。简而言之，将 720 mg Gd (NO3)3·6H2O、170 mg Er (NO3)3·5H2O、160 mg Yb (NO3)3·5H2O 和 20 ml 乙二醇加入三颈烧瓶中。然后，将 0.7 g PEI 轻轻加入烧瓶中。然后，将溶解在10ml乙二醇中的336mg NaF滴加到烧瓶中。将混合物加热至 200°C 并在氮气保护下回流 6 小时。通过离心收集反应产物并用乙醇/蒸馏水洗涤数次。产物在60℃下干燥。

通过酰胺键在 UCNPs 表面修饰 IgG 抗体。如图 1 所示，将 15 mg UCNPs 粉末溶解在 15 ml 蒸馏水中。然后，将 5 ml 硼酸盐缓冲盐水（BBS，pH =8）和 20 μg IgG 加入溶液中。将溶液在室温搅拌2小时。产物经离心洗涤收集。

UCNPs和UCNPs-IgG的一锅法制备示意图

MAPLE 沉积含/不含 IgG 的 UCNP

激光沉积过程由 MAPLE 2000 设备（项目 206，PVD Products, Inc., USA）执行，该设备与 532 纳米 Nd:YAG 激光器相关联。沉积过程如图 2 所示。目标纳米颗粒溶解在异丙醇中，浓度为 1%。将混合物冷冻在由液氮冷却的靶架中。此过程未使用其他添加剂和表面活性剂。

MAPLE技术沉积UCNPs和UCNPs-IgG的示意图

此外，应用 532 nm Nd:YAG 激光，激光频率为 10 Hz，τfwhm ≅ 200 μs。激光光斑面积大小为 0.63 cm ² 和激光能量密度为 150 mJ/cm ² .玻璃基板用 2 wt% 的明胶溶液处理，明胶溶液固定在基板支架上，整个实验过程中基板的温度为 25°C。激光沉积工艺在1 × 10 ^-6 托。根据我们之前的研究 [42, 43]，沉积时间设置为 2 小时。基板到目标的距离为 4.5 厘米（垂直配置）。在激光照射期间，靶架和基板架旋转（靶：10 rpm，基板：25 rpm）。

材料特性

MAPLE 沉积之前的 UCNPs 和 UCNPs-IgG 通过透射电子显微镜（TEM，飞利浦 CM-10，在 80 kV 下运行）进行表征。 UCNPs 和 UCNPs-IgG 的傅里叶变换红外光谱 (FTIR) 由 Bruker Vector 22 FTIR 光谱仪获得（扫描范围 600 cm ^-1 ~4500 厘米 ⁻¹ , 分辨率 4 cm ⁻¹ , 64 次扫描）。通过使用 QuantaMaster™ 40 分光荧光计（Horiba Canada-Photon Technology International Inc.）研究了 UCNPs 的光致发光特性。通过共聚焦显微镜（Zeiss LSM 5 Duo Vario Microscope）研究了有/没有纳米颗粒沉积的玻璃表面上人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的生长。使用日立S-3400 N扫描电子显微镜，配备INCA PentaFET-x3 EDX系统（牛津仪器）进行能量色散X射线光谱（EDX）。

细胞行为研究

应用人脐静脉内皮细胞（HUVEC，美国典型培养物保藏中心）研究激光沉积处理后有/无 IgG 修饰的 UCNPs 的生物相容性。将 HUVEC 接种在沉积有 UCNPs 和 UCNPs-IgG 的玻璃表面上。在 MAPLE 沉积处理后，使用 2 wt.% 明胶溶液（不含 UCNP）处理的玻璃基板作为对照。将沉积的样品浸泡在 MCDB 培养基（10% 胎牛血清、1% 青霉素和两性霉素 B）中，用于接种 HUVEC。 HUVECs 在 37°C 下培养 24 小时。 HUVEC 用 4% 福尔马林固定在基底表面 2 小时以获得共聚焦成像（蔡司 LSM 510 Duo）。细胞用鬼笔环肽-TRITC 和 DAPI 染色。样品用PBS（pH 7.4）洗涤，并用抗褪色剂处理。

细胞毒性研究

HUVEC 在沉积样品表面的 MCDB 培养基（10% 胎牛血清、1% 青霉素和两性霉素 B）中培养。转移至培养皿后，将细胞在样品表面培养 24 小时（37 °C，5% CO2）。大约 100,000 个细胞接种在每个样品的表面（有/没有 UNCP 沉积）。所有样品，包括对照、带有 UCNPs 和 UCNPs-IgG 沉积的玻璃基板，均一式三份进行测量。然后将 MTT 试剂（3-(4, 5-二甲基噻唑基-2)-2, 5-二苯基溴化四唑）加入细胞培养基中，并将细胞孵育 3 小时。去除细胞培养基并用PBS冲洗孔两次。然后在每个孔中加入 DMSO 以溶解甲臜。将液体转移到96孔板中，用生物动力学读数仪490 nm（Bio-Tek Instruments EL340I Microplate Reader）分析。

结果与讨论

MAPLE 沉积前 UCNPs/UCNPs-IgG 的表征

IgG 抗体通过酰胺键偶联到胺修饰的 UCNPs 上。含有/不含 IgG 的 UCNPs 通过 TEM 进行表征。图 3a 是立方 UCNPs 的 TEM 显微照片。 UCNP 的平均尺寸估计为 50 ± 8 nm。图 3a 的小插图是高分辨率 TEM (HRTEM) 的显微照片。 UCNPs 具有高度结晶的结构。测得的两个相邻晶面之间的晶面距离为 0.312 nm，对应于立方相 NaGdF4 (JCPDS 27-0697) 的 (1 1 1) 面。图 3b 是 UCNPs 与 IgG (UCNPs-IgG) 结合的 TEM 显微照片。经抗体修饰的UCNPs保持立方体形状，平均粒径约为54 ± 8 nm。可以通过 TEM 直接观察到生物偶联到 UCNP 上的 IgG 抗体，如图 3b 所示，用红色圆圈标记。 IgG抗体的大小约为10 ± 5 nm，与理论计算和实验测量相似[44, 45]。

a 的 TEM 显微照片 UCNP 和 b MAPLE沉积前的UCNPs-IgG

UCNPs的晶体结构（NaGdF4：Yb ³⁺ , 呃 ³⁺ ) 由 X 射线粉末衍射 (XRD) 图案显示，如图 4 所示。 XRD 图中 32°、37°、54°和 65° 的四个峰归因于 (111)、(200)、( 220) 和 (311) 晶面，这与立方相 NaGdF4 (JCPDS 27-0697) 和参考文献 [36, 37] 的标准 XRD 图谱相同。 HRTEM 和 XRD 测量均证实了 UCNPs 的晶体结构。

NaGdF4的XRD谱：Er ³⁺ , Yb ³⁺ 上转换纳米粒子

为了进一步研究 IgG 在 UCNP 上的生物偶联，采用了傅里叶变换红外光谱 (FTIR)。如图5所示，在1515 cm ^-1 处观察到胺基的弯曲振动带 和 1511 cm ⁻¹ 在 UCNPs 和 UCNPs-IgG 的光谱中，因为 PEI 和 IgG 抗体都具有氨基。 2987 cm ⁻¹ 处的峰 , 2900 厘米 ⁻¹ , 和 1400 cm ⁻¹ 可分别归因于 -CH2- 和 C-C 键的伸缩振动。在3673 cm ^-1 处观察到羟基(-OH)的伸缩振动带 由于 IgG 的羧基，在 UCNPs-IgG 的光谱中。 1249 cm ⁻¹ 处的峰 和 1650 厘米 ⁻¹ 分别归因于 IgG 修饰的 UCNP 光谱中碳氧键和酰胺键的伸缩振动带。这些峰表明UCNPs-IgG表面存在IgG抗体。

UCNPs-IgG和UCNPs的一锅法FTIR光谱图

MAPLE 沉积后含/不含 IgG 的 UCNP 表征

UCNPs 和 UCNPs-IgG 通过 MAPLE 工艺沉积在玻璃底的细胞培养皿上。分别通过能量色散 X 射线光谱 (EDX) 表征 UCNPs 和 UCNPs-IgG 沉积前后的玻璃表面。图 6 显示了涂有 UCNPs（图 6a）和 UCNPs-IgG（图 6b）的玻璃样品中钆 (Gd)、铒 (Er)、镱 (Yb) 和氟 (F) 元素的存在，分别。此外，测量了 MAPLE 沉积后 UCNPs 和 UCNPs-IgG 的光致发光，辐照时间更长。在 980 nm 的激发下可以观察到绿色 (540 nm) 和红色 (650 nm) 发射，如附加文件 1：支持文件中的图 S1 所示。值得注意的是，含有和不含 IgG 的 UCNPs 样品的发射强度略有不同，这可能是由表面缺陷或测量误差引起的。将进行进一步研究。因此，MAPLE沉积可以保持有/无IgG的UCNPs的结构和性质。

a 的 EDX 光谱 MAPLE处理后的样品和b 未经MAPLE处理的样品（裸玻璃）

FTIR 用于研究由 MAPLE 技术制成的 UCNPS 和 UCNPs-IgG 涂层，并与裸玻璃样品进行比较。用 UCNPs 沉积的样品、MAPLE 沉积的 UCNPs-IgG 和空白样品（裸玻璃基板）的 FTIR 光谱如图 7 所示。–OH 基团的伸缩振动带在 3648 cm ^-1 归因于 IgG 的羧基，仅在光谱 1 中观察到，即 UCNPs-IgG 涂层。该结果表明底物表面存在 UCNP-IgG。在光谱 2（UCNPs 涂层）中，1575 cm ^-1 处的弯曲振动带 归因于UCNPs上修饰的胺基团，而由于成功的生物共轭，在光谱1（UCNPs-IgG）中几乎观察不到胺基团的弯曲振动带。因此，MAPLE技术能够保持经抗体修饰的UCNPs的性质和微观结构。

裸玻璃和分别涂有UCNPs-IgG和UCNPs的玻璃的FTIR光谱

与裸玻璃的光谱（光谱-3）相比，亚甲基的伸缩振动带约为2985 cm ^-1 和 2900 厘米 ⁻¹ 由于 UCNPs 表面的碳基官能团，因此在光谱 1 和光谱 2 中。值得注意的是，图 7 中涂层的峰明显弱于图 5 中的峰，这是由于基底表面沉积的纳米粒子数量少，以及 1250 cm ^{-1 处的光谱变化引起的} 图7与图5的对比源于玻璃基板的影响。

不同涂层上的细胞行为

HUVEC 细胞的传统方法需要包被一个蛋白质层，作为我们在细胞培养性能研究中的对照。因此，本研究中的三种不同涂层是（1）对照（涂有明胶的玻璃），（2）涂有 UCNPs 的玻璃，以及（3）涂有 UCNPs-IgG 的玻璃。图 8 显示了在不同表面培养 24 小时的细胞的共聚焦显微镜显微照片。在分别包被 UCNPs 和 UCNPs-IgG 的表面上生长的 HUVECs 的数量与对照相似。然而，在 UCNPs-IgG 修饰的表面上生长的 HUVEC 细胞的行为在第一个 24 小时培养期间得到了显着改善。对培养期间细胞的生长行为包括细胞面积、连接长度、细胞长度和样品表面细胞总数进行了调查和分析。

a 表面 HUVECs 的共聚焦显微照片 控制，b UCNP 和 c IgG修饰的UCNPs

图 9 显示了在三种不同表面上培养 24 小时后细胞行为的统计分析。通过 ImageJ 软件研究细胞面积（图 9a）、连接长度（图 9b）、细胞长度（图 9c）和细胞数量（图 9d）。单元格的长度定义为该单元格的最大长度值。连接的长度定义为细胞尖端边缘与细胞核之间的距离。与对照样品上生长的细胞相比，UCNPs和UCNPs-IgG修饰表面的HUVEC细胞的细胞面积分别增加了11.2%和22.2%； UCNPs和UCNPs-IgG修饰表面HUVEC细胞的连接长度分别增加了12.5%和17.5%； UCNPs和UCNPs-IgG修饰表面的HUVEC细胞长度分别增加了8.2%和17.3%。此外，细胞数的分析结果表明，基于UCNPs的样品表面的细胞数量比对照高约8%。这些结果表明 UCNPs 样品和 UCNPs-IgG 样品都与 HUVECs 细胞具有生物相容性，这与之前的工作一致 [38]。在沉积有 UCNPs 和 UCNPs-IgG 的表面上培养的 HUVEC 细胞的生长在细胞面积、细胞长度和连接长度方面都得到了促进。以前的研究表明，纳米结构可以触发 HUVEC 细胞的内皮激活 [2,3,4,39]。据报道，当暴露于各种纳米粒子时，会观察到炎症介质的释放和 HUVEC 粘附分子的上调 [40]。基于先前的研究，炎症介质可以促进血管生成和促血管生成作用 [2, 41]。此外，最近的研究表明IgG可以促进HUVECs的血管生成样转化[3]。

在不同涂层上培养的 HUVECs，包括对照、UCNPs、UCNPs-IgG：a 单元格区域，b 单元连接长度，c 单元格长度和 d 细胞数

含/不含 IgG 的 UCNPs 涂层对细胞活力的影响

通过使用在不同表面上培养的 HUVEC 细胞研究细胞活力。图 10 显示了不同表面上的相对细胞活力：对照（涂有明胶的玻璃）、裸玻璃、沉积在玻璃基板上的 UCNPs 和沉积在玻璃基板上的 UCNPs-IgG。裸玻璃、涂有 UCNPs 的玻璃和涂有 UCNPs-IgG 的玻璃的相对细胞活力分别为 99.6%、105.44% 和 103.96%。一些研究表明，高浓度的 PEI 可能具有毒性作用，尤其是在高浓度应用时，但使用 PEI 作为配体是可以接受的，并且显示出可忽略的细胞毒性 [44,45,46,47]。由于MAPLE的作用机制，基板表面UCNPs/UCNPs-IgG的量远低于阈值（1mg/ml）。显然，MAPLE 在玻璃上沉积 UCNPs 和 UCNPs-IgG 不会对 HUVEC 细胞产生毒性作用。值得注意的是，生物相容性材料通常可以具有细胞的相对细胞活力 (> 85%)。 [8]

HUVEC细胞在裸玻璃、UCNPs和UCNPs-IgG分别包被和明胶包被的玻璃上生长的细胞活力

结论

总之，UCNPs和UCNPs-IgG通过一锅法成功合成，并已通过MAPLE技术沉积在玻璃底培养皿上。 TEM 和 FTIR 的结果揭示了 IgG 在 UCNPs 表面的成功生物偶联。 UCNPs 的平均粒径为 50 ± 8 nm。经抗体修饰的UCNPs保持立方体形状，平均粒径约为54 ± 8 nm。 IgG在UCNPs上的生物共轭可以通过TEM直接观察到，平均尺寸为10 ± 5nm。 FTIR 光谱还证实了在 UCNPs 表面修饰的抗体的羧基/肽键的存在。 MAPLE 沉积工艺用于在玻璃基板上沉积 UCNPs 和 UCNPs-IgG。 EDX、FTIR 和 PL 测量的结果表明在 MAPLE 沉积后 UCNP 和 UCNPS 的结构和性能得以保留。我们的研究表明，MAPLE 工艺可以在有/没有抗体修饰的情况下保留 UCNP 的特性和结构。此外，通过在分别用 MAPLE 工艺制成的 UCNPs 和 UCNPs-IgG 处理的不同表面上培养 HUVEC 细胞系，对细胞培养的性能进行了统计研究。细胞面积、细胞长度和连接长度对于支持理想的汇合和微血管结构的形成非常重要。通过 MAPLE 技术用 UCNPs 和 UCNPs-IgG 样品处理的玻璃表面对 HUVEC 细胞系没有毒性作用。预计UCNPs和UCNPs-IgG的MAPLE沉积可用于制备用于组织工程和组织再生的新型生物器件。

缩写

DAPI：

4',6-二脒-2'-苯基吲哚二盐酸盐

EG：

乙二醇

HUVEC：

人脐静脉内皮细胞

IgG：

免疫球蛋白G

枫叶：

基质辅助脉冲激光蒸发

PEI：

聚乙烯亚胺

鬼笔环肽-TRITC：

鬼笔环肽-四甲基罗丹明B异硫氰酸酯

UCNP：

上转换纳米粒子