SPIO 纳米粒子的合成及其在帕金森病干细胞标记中的后续应用

介绍

帕金森病是一种神经退行性疾病，其特征是中脑多巴胺能神经元的进行性丧失。相对局灶性的损伤使其成为基于细胞的疗法的良好候选者。几种细胞类型，从胎儿中脑组织 [1] 到源自胚胎干细胞 (ESC) 或诱导多能干细胞 (iPSC) [2] 的诱导神经元，都与 PD 的治疗有关；然而，在应用过程中无法避免伦理问题和潜在的致瘤风险 [3]。间充质干细胞 (MSC) 是多能干细胞群，在过去十年中被报道为一种有前途的神经退行性疾病治疗工具，包括 PD [4, 5]。与其他细胞类型相比，MSC 显示出良好的增殖、在整个人体中的广泛可用性和免疫抑制能力。一些研究表明，MSCs 的颅内移植可促进神经保护、神经元分化和免疫调节 [6,7,8]。在这些研究中，跟踪移植细胞在体内的活力、迁移和整合对于了解干细胞功能和评估临床有效性至关重要。

为了更好地分析移植细胞的治疗效果，开发了各种示踪剂。示踪剂的安全性和有效性是影响应用的最关键因素。与使用荧光蛋白标记 [9] 相比，使用超顺磁性氧化铁 (SPIO) 粒子进行跟踪不会给移植细胞带来任何遗传修饰 [10,11,12]。几项研究已经使用 SPIO 作为一种有效的造影剂来可视化和跟踪移植的细胞 [6, 13, 14]。然而，据报道，一些市售的 SPIO 会影响 MSC 的正常功能 [15,16,17]；因此，已投入大量精力开发新型SPIO。在本研究中，我们用聚丙烯酸 (PAA) 和随后的甲氧基聚乙二醇胺 (PEG) 层合成了超小 SPIO 纳米粒子 (USPIO) 涂层。新型 USPIO-PAA/PEG 在体外和体内均显示出良好的细胞内化和长期 MRI 追踪能力。此外，USPIO-PAA/PEG标记的人脂肪组织来源间充质干细胞（HADSCs）保持了生物学特征，改善了PD动物模型黑质中的行为障碍并增加了TH免疫反应性。

材料和方法

材料

乙酰丙酮铁、TREG（三甘醇）、二甘醇和 PEG 购自阿拉丁工业公司（中国上海）。甲基噻唑基二苯基溴化四唑 (MTT) 购自 Sigma-Aldrich Corporation（中国上海）。 Dulbecco 改良的 eagle 培养基 (DMEM)、胰蛋白酶-EDTA (0.25%) 和胎牛血清 (FBS) 购自 Thermo Fisher Scientific。 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺购自Sigma-Aldrich（中国）。 N,N-二甲基甲酰胺、无水乙醇和乙酸乙酯购自国药集团化学试剂公司。超纯水由密理博纯​​水和超纯水净化系统生产。抗人CD90-FITC、抗人CD45-PE、抗人CD34-FITC和抗人CD105-PE购自Biolegend。

USPIO的合成

USPIO 是通过多元醇法合成的，如先前的研究 [18,19,20,21]。实验步骤如下：将乙酰丙酮铁1mmol和TREG 25mL在三颈烧瓶中混合，三颈烧瓶与氩气、球形冷凝管和温度计相连。在氩气流中孵育 15 分钟后，将混合物加热至 120℃（加热速率为 3℃/分钟）并保持 1 小时，然后将混合物以相同的加热速率进一步加热至 250℃并保持30 分钟。将反应混合物自然冷却至室温，用2mL无水乙醇稀释，然后用乙酸乙酯沉淀。通过以 8000 rpm 离心 20 分钟收集沉淀物，然后重悬于无水乙醇中。 USPIO 储存在 4°C 的无水乙醇中以备进一步使用。

PAA/PEG 涂层 USPIO 的制备

USPIO-PAA 是根据之前的报告 [22] 获得的。具体而言，将 1.5 克聚丙烯酸 (PAA) 溶解在 24 毫升二甘醇中。在氩气流动 5 分钟后，将混合物加热至 110°C 并保持直到溶液变透明。将上一步制备的含有28mg USPIO的乙醇分散液加入超声分散后的上述澄清溶液中。最后以 3°C/min 的速率将溶液加热至 210°C。回流2小时后停止反应并自然冷却至室温。冷却后，向反应溶液中加入乙酸乙酯以沉淀 USPIO NP，然后以 8000 rpm 离心 20 分钟以去除上清液。然后将沉淀物分散在乙醇中，接着用乙酸乙酯沉淀。洗涤3次后，将USPIO-PAA分散于超纯水中备用。为了提高生物相容性，我们通过 EDC 和 NHS 介导的酰胺化进一步将 PEG 连接到纳米颗粒的表面 [23]。将 0.45 克 PEG 溶解在 5 毫升超纯水中，并添加到补充有 20 毫克 EDC 和 12 毫克 NHS 的 15 毫升 USPIO-PAA 分散体（含有 35 毫克铁）中。将混合物在室温下机械搅拌2小时，然后加入10ml DMF溶剂，在旋转蒸发仪中在40℃下除去水。最后，将 40 毫克 DEC 和 24 毫克 NHS 添加到混合物中，在室温下混合 48 小时。将反应溶液转移到超纯水中的透析袋中持续 72 小时，在此期间每 12 小时更换一次超纯水。将混合物进一步转移到超滤管中，以通过以 4000 rpm 离心 10 分钟收集 Mr> 30 kD 的分子。将最终产品溶解在超纯水中并在 4°C 下储存。在某些情况下，通过用超滤离心管（> 30 KD孔径，Millipore）离心收集溶解在水中的SPIO-PAA / PEG，并将颗粒在真空烘箱中干燥以进行进一步实验。

NP 的特征

通过TEM分析样品的粒度、粒度分布和形貌。通过负染色测量涂层。超声分散后，将水溶液中的USPIO-PAA和USPIO-PAA/PEG加入到300目碳支撑膜的铜网络中，自然干燥后放入投影电子显微镜（Tecnai G2F20 s-twin，FEI）供观察。

红外光谱分析在Agilent Technologies Cary 600系列FTIR光谱仪上进行，干燥后的样品粉末直接加入样品罐进行检测。

USPIO-PAA/PEG 分散体中的 Fe 含量通过火焰原子吸收光谱法 (FAAS) 测定，其型号为 PerkinElmer Analyst 700。首先，配置 1、2、3、4 和 5 μg/mL 铁标准溶液以绘制用硝酸溶解100 μL USPIO-PAA或USPIO-PAA/PEG分散液，在50 mL容量瓶中测定铁含量。

纳米粒子的磁共振成像是在苏州大学第一附属医院影像科在3 T磁场的临床扫描仪上进行的。将纳米颗粒按相应浓度分散于1%琼脂糖凝胶溶液中。溶液凝固后，通过多回波序列测量样品的横向弛豫时间。将采集的MRI数据导出为DICOM格式，然后使用RadiAnt DICOM Viewer打开，读取灰度值，将不同回波时间的灰度值导入原点拟合，得到不同浓度USPIO分散体的横向弛豫时间值;最后，通过线性拟合得到USPIO-PAA和USPIO-PAA/PEG样品的横向弛豫率r2，横向弛豫率为1/T2，与样品的Fe浓度。 USPIO-PAA和USPIO-PAA/PEG的磁滞回线采用苏州科技大学Quantum Design DynaCool-9装置，按照前述方法获得[24]。

HADSCs 隔离和识别

所有研究均按照《人类胚胎干细胞研究伦理指导原则》（中华人民共和国科技部和卫生部，2003 年）和赫尔辛基宣言进行。脂肪样本是在苏州大学第一附属医院知情同意和伦理批准的情况下获得的。在解剖显微镜下去除血管和结缔组织后，将脂肪组织洗涤并切成小块。将块用 I 型胶原酶 (0.3 pzu/mL) 在 37°C 下消化 30 分钟，然后以 500g 离心 10 分钟。将细胞沉淀悬浮于DMEM + 10% FBS中，以8 × 10 ⁴ 的密度接种 /cm ² . 48 h 后弃去含有漂浮细胞的旧培养基，更换为新鲜培养基。

HADSCs 通过流式细胞术表征特异性标记间充质（CD90 和 CD105）和造血（CD34 和 CD45）干细胞的表面标志物。收获总共 1 × 105 个细胞，并与针对 CD34、CD45、CD90 和 CD105 小鼠抗人单克隆抗体的 PE、FITC、APC/cy7 或 PerCP 偶联抗体和适当的同种型对照一起温育。使用流式细胞仪（LSRFortessa，BD，USA）分析染色的细胞，并使用 FlowJo 软件分析数据。选择 CD90+、CD105+、CD34- 和 CD45- 四种表型作为 HADSC 的表面标志物。流式细胞术（BD LSRFortessa）检测细胞表面标志物的表达水平。

分别通过油红 O 和茜素红染色评估 HADSCs 的成脂和成骨分化。 HADSC 用 MesenCultTM 成脂分化培养基（干细胞技术，05412）或 OriCellTM 成骨分化试剂盒（Cyagen，HUXMA-90021）培养。对于 HADSC 的脂肪形成分化，在第 14 天通过定性油红 O 染色对充满脂质的成熟脂肪细胞（VivaCell Biosciences，C37A00150）进行评估。对于 HADSC 的成骨分化，在第 21 天通过茜素红染色评估成熟骨细胞中钙结节的细胞（VivaCell Biosciences，C37C00150）。图像采用倒置 Nexcope 显微镜获取。

USPIO-PAA/PEG 的体外细胞摄取和生物相容性评价

HADSCs接种于6孔板中，密度为1 × 10 ⁶ 每口井。细胞与含有 USPIO-PAA/PEG（Fe 10 μg/mL 和 0.1 μg/mL）的培养基孵育 2 h，并用普鲁士蓝 (PB) 染色进行细胞内 Fe 鉴定。

USPIO-PAA/PEG 的生物相容性通过 MTT 比色法和 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷 (EdU) 掺入试验（EdU 增殖试剂盒，Thermo）确定。对于MTT，HADSCs以5 × 10 ³ 的密度接种于96孔板中 每孔并与不同浓度（0、10、20、40、80、160 Fe μg/mL）的 USPIO-PAA/PEG 孵育 24 小时、48 小时或 72 小时。将 20 微升 MTT 溶液 (5 毫克/毫升) 加入每个孔中 4 小时，然后加入 150 微升二甲基亚砜以溶解晶体。使用酶标仪（BioTek Synergy HT）在 OD 570 nm 处测量每个孔的吸光度值。对于 EdU 测定，HADSC 与 160 Fe μg/mL 的 SPIO-PAA/PEG 孵育 72 小时，然后与 10 μM EdU 孵育 24 小时。收集细胞，用 4% 多聚甲醛固定并用 2 mg/mL 甘氨酸中和。将渗透细胞与染料溶液（叠氮化物 647 复合物）一起孵育后，通过流式细胞术评估 EdU 掺入率。

6-OHDA 诱导的 PD 模型

使用 15-20 只雄性 Wistar 大鼠（SPF 级，体重 220 ± 20 克）对 PD 动物身上的 USPIO-PAA/PEG 标记的 HADSC 进行体内追踪。所有程序均按照中国条例（实验动物事务管理条例，2017年）进行，并经中国科学院动物护理和使用机构委员会批准。在整个过程中，动物被关在受控照明下（12/12 小时光/暗循环，早上 7 点“开启”），可随意获取食物和水。大鼠单侧纹状体2点注射6-羟基多巴胺(6-OHDA, Sigma, St. Louis, MO, USA)制备PD模型。如前所述 [25, 26]，在 2 个坐标处（AP：1.2 毫米，ML：2.2 毫米，DV：- 4.0 至 6.0 毫米）向大鼠立体注射 3 μL 6-OHDA 溶液（5 μg/μL）；和AP：- 1.0 毫米，ML：4.4 毫米，DV：- 4.5 至 6.5 毫米）。阿扑吗啡诱导的旋转（0.5 毫克/千克，皮下）测试用于测试 PD 模型的有效性。在 6-OHDA 治疗后的第 1、2 和 3 周，给大鼠皮下注射阿扑吗啡 (0.5 mg/kg)，并在开放场中评估旋转评分 30 分钟。阿扑吗啡诱导PD模型每分钟旋转7次以上，认为成功。

细胞移植和体内 MRI 成像

当 HADC 达到 80% 汇合时，将它们与 USPIO-PAA/PEG（铁浓度为 10 μg/mL）一起孵育 2 小时。 PD模型制备后3周，3 × 10 ⁶ 在以下坐标（AP：1.2mm，ML：2.2mm，DV：- 4.0 至 6.0mm）处将 100 毫升 USPIO-PAA/PEG 标记的 HADC 或盐水注射到 PD 大鼠模型的左侧纹状体中。接受移植的动物在手术后立即给予丁丙诺啡 (0.5 mg/kg)，并持续 2 天。这些动物在移植手术后1、2或3周进行阿扑吗啡诱导的轮换试验。

对于体内 MRI，在注射生理盐水或 HADSCs 后的第 3、9、15 和 21 天，使用体内成像系统（IVIS）小动物成像系统（PerkinElmer，W​​altham，MA，USA）对动物进行成像。

组织学分析

在干细胞移植后 3 周，收获其余大鼠模型的大脑并将其切成 30 毫米厚的切片用于分析 (n =5 每组）。切片与抗酪氨酸羟化酶（TH，abcam，England）一起孵育，并用 Alexa-594 偶联的驴抗兔抗体（Abcam）进行观察。 DAPI 用于核复染。图像采用 Leica TCS SP5 共聚焦显微镜拍摄。

统计分析

数值数据表示为平均值 ± SD。使用 GraphPad Prism 7.0（GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA）对数据进行 2 尾学生 t 检验或单向方差分析以评估差异。 * 表示 p <0.05与NS表示无显着差异。

结果

纳米粒子的合成与表征

实验设计如图 1 所示。疏水性 USPIO NPs 采用热分解法制备。如图 2a-c 所示，原始 USPIO NP 的直径为 4.07 ± 0.57 nm；通过涂覆 PAA，USPIO-PAA NPs 的直径增加到 6.34 ± 0.54 nm；用 PEG 进一步修饰 NPs 使 USPIO-PAA/PEG NPs 的直径达到 10.07 ± 0.55 nm。所有三种纳米粒子都是球形并均匀分散。统计分析表明存在显着差异(F =10, **p <0.01, ##p <0.01) 在 USPIO、USPIO-PAA 和 USPIO-PAA/PEG NPs 的直径中，表明 PAA 和 PEG 成功修饰（图 2d）。

实验设计示意图

纳米粒子的表征。 a–c USPIO NPs 的代表性 TEM 图像 (a ), USPIO-PAA NPs (b ) 和 USPIO-PAA/PEG NPs (c ）。 d 统计分析表明，USPIO、USPIO-PAA和USPIO-PAA/PEG的粒径存在显着差异（n =20 每组）。 e USPIO、USPIO-PAA 和 USPIO-PAA/PEG NPs 纳米颗粒的傅里叶变换红外光谱。箭头表示 1728 cm ^-1 处的比吸收峰 由于 PAA 修改，1595 cm ⁻¹ 和 3440 厘米 ⁻¹ 由于 PEG 修饰。数值数据表示为平均值 ± SD, **p <0.01 与 USPIO NP，##p <0.01 与 USPIO-PAA/PEG NPs 相比。条形代表 20 纳米

通过红外吸收法，我们发现USPIO-PAA在1728 cm ^-1 有明显的羰基吸收峰 由于PAA分子中的羰基伸缩振动峰； USPIO-PAA/PEG 在 1595 cm ^-1 处具有碳氮键面内弯曲振动峰 和羟基在3440 cm处的伸缩振动峰 ^-1 （图 2e）。所有这些数据进一步证实了PAA或PEG分子已成功修饰到纳米颗粒表面。

USPIO-PAA/PEG 显示出良好的体外磁响应和 HADSC 的生物相容性

USPIO-PAA和USPIO-PAA/PEG的体外成像能力通过MRI图像在不同浓度（相当于Fe浓度）的灰度值进行评估。拟合后，得到不同浓度分散体的横向弛豫时间值。以1/T2的横向弛豫率为纵坐标，Fe浓度为横坐标，计算出USPIO-PAA的横向弛豫率为107.94 s ^-1 mm ^-1 （图 3a）和 84.65 s ⁻¹ mm ^-1 用于 USPIO-PAA/PEG（图 3b）。两种颗粒都显示出良好的 MRI 成像特性。 SPIO-PAA 和 SPIO-PAA/PEG 的磁滞回线表明，SPIO-PAA 的饱和磁化强度值在 10,000 Oe 以上为 57 emu/g（图 3c），SPIO-PAA/PEG 的饱和磁化值为 40 emu/g 高于 10,000 Oe（图 3d）。矫顽力和剩磁接近于零（图3c、d），进一步说明SPIO-PAA和SPIO-PAA/PEG均具有超顺磁性。

合成的 USPIO-PAA 和 USPIO-PAA/PEG NPs 的体外磁响应。 一 , b USPIO-PAA NPs 的 MRI 和横向弛豫率 (a ) 和 USPIO-PAA/PEG NPs (b ）。 r 2代表松弛率。 USPIO-PAA 和 USPIO-PAA/PEG NPs 的弛豫率为 107.94 s ^-1 mM ⁻¹ 和 84.65 s ⁻¹ mM ⁻¹ . c , d USPIO-PAA NPs 的磁滞回线 (c ) 和 USPIO-PAA/PEG NPs (d ）。磁滞在 295 k (21.85 °C) 下测量，最大磁场强度为 50,000 Oe (5 Telsa)。 SPIO-PAA 的饱和磁化强度值接近 57emu/g，SPIO-PAA/PEG 的饱和磁化强度值接近 40emu/g。两条曲线的磁滞均接近于零

通过将 USPIO-PAA/PEG NPs 与 HADSCs 孵育不同时间，我们发现 USPIO-PAA/PEG NPs 对细胞存活没有显着影响（p> 0.05)。当等效 Fe 浓度范围为 0 至 160 μg/mL 时，HADSCs 的细胞活力保持在 96% 以上。此外，孵育时间的增加（从 24 小时到 72 小时）不会在每个 Fe 浓度下引起显着的细胞损失（图 4a）。当 USPIO-PAA/PEG NPs 与不同浓度的 iPSCs 孵育时，获得了类似的观察结果（图 4b）。尽管 HADSC 用 160 μg Fe/mL USPIO-PAA/PEG 处理 72 小时，但如 EdU 掺入率所示，增殖能力并未因 USPIO-PAA/PEG 的存在而受损（图 4c）。这些数据均表明合成的USPIO-PAA/PEG NPs具有生物安全性。

合成的 USPIO-PAA/PEG NPs 显示出良好的生物相容性和标记能力。 一 , b HADSCs 或 iPSCs 与不同浓度的 USPIO-PAA/PEG NPs（相当于 0、10、20、40、80 和 160 μg Fe/mL 的 Fe 浓度）孵育 24、48 和 72 小时，并观察细胞活力由MTT法测定并示于a , b ， 分别。不同NPs浓度(n =5) 或孵育时间 (n =5)。 c 流式细胞术分析表明，在存在或不存在 USPIO-PAA/PEG（160 μg Fe/mL，72 小时）的情况下孵育的 HADSC 中，EdU 掺入率相似。未用 EdU 处理的 HADSC 作为阴性对照。 d USPIO-PAA/PEG 为 10 μg Fe/mL，孵育时间为 2 小时，导致 HADSC 的标记效率几乎为 100%，正如普鲁士蓝染色所评估的那样。请注意，0.1 μg Fe/mL（2 小时孵育时间）的 USPIO-PAA/PEG 在 HADSC 中产生轻微但均匀的 PB 染色。数值数据表示为平均值 ± SD。条形代表 20 μm

为了确定细胞是否可以被 USPIO-PAA/PEG NPs 有效标记，我们将 HADSCs 与 USPIO-PAA/PEG NPs 以等效的 Fe 10 μg/mL 或 0.1 μg/mL 孵育 2 小时。如图 4d 所示，在 USPIO-PAA/PEG (Fe 10 μg/mL) 存在下，几乎 100% 的 HADSC 中观察到大量染成蓝色的 NP。即使 USPIO-PAA/PEG 的剂量降低到 0.1 μg Fe/ml，我们仍然在几乎所有 HADSC 中观察到相当均匀和分散的 PB 染色。与其他一些报道的 SPIO [14, 27, 28] 相比，USPIO-PAA/PEG 表现出较高的细胞摄取效率。

在 PD 大鼠模型中对 USPIO-PAA/PEG NPs 标记的 HADSC 进行长期跟踪

通过立体定向注射将USPIO-PAA/PEG NPs标记的HADSCs移植到PD大鼠模型左侧纹状体中。如图 5 所示，我们在 HADSC 移植后 3 天在左侧纹状体中观察到清晰的 MRI 信号，表明对移植细胞进行了适当的体内追踪。移植后D3、D9、D15、D21动态观察显示，移植后3周内NP标记的移植细胞可清晰追踪，过程中MRI信号未见明显减弱。这些结果表明合成的纳米粒子在移植细胞的体内示踪方面具有良好的潜力。

大脑在 3 天、9 天、15 天和 21 天后的代表性 MRI 图像，然后用 USPIO-PAA/PEG 标记的 HADSC 或盐水进行移植。相应对照的MRI图像，即正常大鼠或注射生理盐水的PD大鼠模型，分别显示在第一行和第二行。请注意，与对照中的阴性信号相比，移植了 USPIO-PAA/PEG 标记的 HADSC 的大鼠大脑在长达 21 天的时间内显示出恒定且清晰的 MRI 信号。条形代表 5 毫米

USPIO-PAA/PEG NPs 标记的 HADSCs 在 PD 模型中表现出治疗效果

为了评估 NPs 标记的 HADSCs 是否表现出治疗效果，我们首先对分离的 HADSCs 进行了表型表征。如图 6a 所示，培养的 HADSC 是纺锤形细胞。流式细胞术分析表明，HADSCs 是间充质细胞的高表达标志物，如 CD90 (> 99%) 和 CD105 (> 99%)，而很少表达造血标志物，如 CD34 和 CD45（图 6b-g）。 ）。 HADSCs 在某些条件下可以向成脂或成骨谱系分化，分化能力分别通过油红 O 或茜素红染色显示（图 5h）。注意分化的 HADSC 中的脂滴或钙化结节，而对照 HEK293 细胞中没有这种结构（图 6h）。均表明HADSCs符合间充质细胞标准。

HADSCs 表征。 一 短语对比显微镜下的代表性图像显示 HADSCs 具有典型的纺锤体样表型。 b–g HADSCs 与结合不同染料的抗体一起孵育，以对抗 CD45、CD105、CD34 和 CD90 标记物，并进行流式细胞术分析。散点图显示在b, c , 直方图显示在 d–g .请注意，大多数细胞表达 CD90 和 CD105，但不表达 CD34 和 CD45。 h HADSCs 与 HEK293 细胞的成脂分化和成骨分化分别通过油红 O 或茜素红染色进行评估。条形代表 20 μm

注射6-OHDA后第1周、第2周和第3周阿扑吗啡诱导的旋转为17.1 ± 1.79、28.7 ± 1.77和31.86 ± 1.72/min，证实大鼠PD模型成功建立。如图 7 所示，在第 1、2 和 3 周，PD 大鼠模型的轮换次数减少到 32.59 ± 1.12、31.85 ± 1.98 和 31.54 ± 1.73，随后在损伤侧 DSC 中进行 NPs 标记移植。统计分析显示，从移植手术后第 2 周开始，生理盐水和 HADSC 给药组之间存在显着差异（p <0.01 在第 2 周，p <0.01 在第 3 周； n =每组5），表明NPs标记的HADSCs改善了PD模型中的行为障碍。

PD 大鼠模型在 6-OHDA 受损的同侧纹状体中使用生理盐水或 USPIO-PAA/PEG 标记的 HADSCs，并对每分钟旋转数进行评分和比较。与接受盐水的相应 PD 大鼠相比，接受 HADSCs 的 PD 大鼠在第 2、3 周的轮换次数显着减少。 ns 表示变化不大，**表示p <0.01。 n =每组5个

PD 的特征是黑质中表达酪氨酸羟化酶 (TH) 的神经元丢失。通过使用针对 TH 的免疫染色，我们发现 6-OHDA 减少了黑质中表达 TH 的神经元，在 PD 大鼠模型的纹状体中移植 HADSC 可以缓解这种减少（图 8）。 Combined with the observation that cell transplantation alleviates the behavioral impairments of PD rats, we concluded that USPIO-PAA/PEG NPs-labeled HADSCs exert therapeutic effects in PD rat models.

Immunostaining against TH in the substantia nigra of the rats receiving saline (a , d , g ), PD rats receiving saline (b , e , h ) or PD rats receiving USPIO-PAA/PEG NPs-labeled HADSCs (c , f , i ）。 The area in the dashed frame indicates the compact area of substantia nigra (SNc) and the ventral tegmental area (VTA). Images in the boxes of d , e , f are enlarged and shown in g , h , i ， 分别。 There are less TH-expressing cells in the SNc and VTA regions in the rats receiving 6-OHDA injection, as compared to the controls receiving saline. Following by HADSC transplantation, more of TH-expressing cells in the SNc of PD rats could be observed. The bar represents 100 μm

讨论

Cell therapy is a promising strategy for the treatment of neurodegenerative diseases and has been in the front edge of preclinical research over the last 20 years [29, 30]. Tracing the transplanted cells is an indispensable part for the clarification of underlying mechanisms as well as the evaluation of clinical effects; however, it is challenging and to some extent, hampered the application of cell therapy [31, 32]. Computed tomography (CT), near-infrared fluorescence imaging (NIFI) and MRI are the most commonly used methods for the in vivo tracking of transplanted cells [31, 32]. Compared to the rather high radiation of CT and low sensitivity of NIFI, MRI shows good imaging of deep tissue, high contrast and low ionizing radiation, making it a good candidate for the in vivo tracing [33,34,35,36]. The development of proper tracers for MRI therefore becomes an indispensable part of promoting the application of cell therapy.

SPIO is a simple and reliable labeling strategy for MRI visualization. To achieve long-term in vivo tracing of the transplanted cells, the SPIO particles is required to have a uniform and ultrasmall size, since large particles may lead to uneven distribution of the tracers and interfere with the normal blood circulation [33]. Moreover, the internalization efficiency and biocompatibility of nanoparticles are another important index to evaluate the tracers. Nanoparticles usually enter cells through liquid phase endocytosis [37], receptor-mediated endocytosis [38] and phagocytosis [39]. To achieve a better cellular uptake, the SPIO particles are usually modified with intermediate ligands [18, 40, 41].

Besides cell tracking, SPIO has also been applied for drug delivery [42]. The tissue distribution and pharmacokinetic clearance are important index for both applications. Compared to the NPs-PAA, NPs-PAA/PEG showed longer retention time in blood and slower urinary clearance [43]. NPs densely coated with PEG provide much more uniform distribution over mucosal epithelial surfaces, including the gastrointestinal tract [44], respiratory system [45, 46] and brain tumor [42], etc. Moreover, PEG coating reduces the attachment of proteins and formation of corona, which in turn might promote uniform distribution of the NPs at the cost of reduced uptake [47]. As a potential good diagnostic and therapeutic tool, the labeling capacity of SPIO-PAA/PEG to MSCs and its further application in brain disorders such as PD have not been well studied, and the present study was designed to answer this question. In the present study, we synthesized a novel ultrasmall USPIO-PAA/PEG nanoparticles, modifying the SPIO cores with PAA and PEG ligands, respectively. The USPIO-PAA/PEG NPs have uniform ultrasmall diameter (10.07 ± 0.55 nm), good dispersion in aqueous solution, biocompatibility with various cell types as well as good magnetic response effect in vitro and in vivo. Importantly, the signals of labeled HADSCs could be clearly detected under MRI after brain transplantation for up to three weeks, indicating the good potential for clinical application.

PD is characterized by a progressively loss of dopaminergic neurons in the substania nigra, and by the deficiency of dopaminergic levels in the dopaminergic networks [1]; the most affected one is the nigrostriatal pathway including the striatum. In the present study, we transplanted USPIO-PAA/PEG-labeled HADSCs into the striatum of PD rat models, and found that such transplantation improved the behavioral impairments; moreover, it attenuated the loss of dopaminergic neurons in the substania nigra to some extent. Similarly, Ardeshir et al. reported that transplanting the MSCs derived from rat adipose tissues attenuated apomorphine-induced rotations in PD models [48]. Different from transplanting fetal midbrain tissues [49] or dopaminergic neural progenitors [50], HADSCs exert its therapeutic effects mainly through the paracrine effects [51, 52], rather than substituting for the impaired tissues. Studies have shown that MSCs act as promoters of immunomodulation, neuroprotection and neuronal differentiation, and these effects are essentially mediated by the secretome released by MSCs [6, 7, 51]. Our result is consistent with these observations; moreover, it indicates that the novel USPIO-PAA/PEG tracers did not interfere with the neuroprotection effects of HADSCs.

结论

We have developed a novel USPIO-PAA/PEG tracers showing high cell uptake efficiency, excellent biocompatibility and long-term MRI tracing capacities. The HADSCs labeled with USPIO-PAA/PEG could be traced with MRI for 3 weeks after cell transplantation. Moreover, the labeled HADSCs significantly attenuated the behavioral impairments of PD models, and increase the number of dopaminergic neurons in the substantia nigra. The development of USPIO-PAA/PEG tracer may provide a promising tool in stem cell research and application.

数据和材料的可用性

All data supporting the conclusions of this article are included within the article.

缩写

SPIO:

Small superparamagnetic iron oxide

USPIO:

Ultrasmall superparamagnetic iron oxide

PAA：

聚丙烯酸

PEG：

Methoxypolyethylene glycol amine

HADSCs:

Human adipose-derived stem cells

USPIO-PAA/PEG:

Ultrasmall superparamagnetic iron oxide nanoparticles coating with the polyacrylic acid and methoxypolyethylene glycol amine

6-OHDA:

6-Hydroxydopamine

CT:

计算机断层扫描

NIFI:

Near infrared fluorescence imaging

MRI：

磁共振成像

TH:

Tyrosine hydroxylase

TEM：

透射电子显微镜