用于帕金森病干细胞追踪的超小超顺磁性氧化铁纳米颗粒

摘要

帕金森病（PD）以中脑多巴胺能神经元进行性丧失为特征，干细胞移植提供了极具前景的治疗策略。在这些研究中，体内追踪移植细胞的生物学行为对于基本理解干细胞功能和评估临床疗效至关重要。本研究采用热分解法和两步修饰，开发了一种新型包覆聚丙烯酸（PAA）和甲氧基聚乙二醇胺（PEG）的超小超顺磁性氧化铁纳米颗粒（USPIO-PAA/PEG NPs）。USPIO-PAA/PEG NPs直径均一为10.07±0.55 nm，TEM和FTIR显示具有配体相应吸收峰。MTT显示与USPIO-PAA/PEG NPs孵育细胞存活率保持96%以上。合成的USPIO-PAA/PEG具有84.65 s⁻¹ Mm⁻¹的良好弛豫率，表明可被MRI高效摄取和追踪。此外，原代人脂肪源性干细胞（HADSCs）经表征、USPIO-PAA/PEG标记后移植到6-羟基多巴胺（6-OHDA）诱导的PD大鼠模型纹状体。标记细胞移植手术后可通过MRI追踪长达3周；而且标记HADSCs移植显著减轻PD模型阿扑吗啡诱导旋转行为，增加黑质多巴胺能神经元数量。总体而言，USPIO-PAA/PEG NPs的开发为细胞疗法体内追踪技术提供了有前景工具，并确立了追踪具有治疗潜力干细胞的新策略。

引言

帕金森病是一种神经退行性疾病，以中脑多巴胺能神经元进行性丧失为特征。这种相对局限的损伤使其成为细胞疗法的良好候选者。多种细胞类型从胎儿中脑组织[1]到胚胎干细胞（ESC）或诱导多能干细胞（iPSC）衍生的诱导神经元[2]都被用于PD治疗；然而应用过程中无法避免伦理顾虑和潜在致瘤风险[3]。间充质干细胞（MSC）是过去十年报道的神经退行性疾病（包括PD）极具前景治疗工具的多潜能干细胞群[4,5]。与其他细胞类型相比，MSC表现出良好增殖能力、在人体广泛分布和免疫抑制能力。一些研究表明颅内移植MSC促进神经保护、神经元分化和免疫调节[6-8]。在这些研究中，体内追踪移植细胞的活力、迁移和整合对于基本理解干细胞功能和评估临床疗效至关重要。

为更好分析移植细胞治疗效果，开发了各种示踪剂。示踪剂的安全性和有效性是影响应用的最关键因素。与荧光蛋白标记[9]相比，使用超顺磁性氧化铁（SPIO）颗粒追踪不会给移植细胞带来任何基因改造[10-12]。多项研究已使用SPIO作为有效对比剂可视化和追踪移植细胞[6,13,14]。然而一些市售SPIO被报道影响MSC正常功能[15-17]；因此投入大量精力开发新型SPIO。本研究合成了一种包覆聚丙烯酸（PAA）和后续甲氧基聚乙二醇胺（PEG）层的超小SPIO纳米颗粒（USPIO）。新型USPIO-PAA/PEG在体外和体内显示良好细胞内化和长期MRI追踪能力。此外，USPIO-PAA/PEG标记的源自人脂肪组织MSC（HADSCs）保持生物学特征，改善PD动物模型行为损伤并增加黑质TH免疫反应性。

材料与方法

材料

乙酰丙酮铁、TREG（三乙二醇）、二乙二醇和PEG购自阿拉丁工业公司（上海）。甲基噻唑基二苯基四氮唑溴化物（MTT）购自Sigma-Aldrich（上海）。杜尔贝科改良鹰培养基（DMEM）、胰蛋白酶-EDTA（0.25%）和胎牛血清（FBS）购自Thermo Fisher Scientific。1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺购自Sigma-Aldrich（中国）。N,N-二甲基甲酰胺、无水乙醇和乙酸乙酯购自国药集团化学试剂公司。超纯水由Millipore纯水和超纯水制备系统制备。抗人CD90-FITC、抗人CD45-PE、抗人CD34-FITC和抗人CD105-PE购自Biolegend。

USPIO合成

USPIO采用多元醇法合成，参考前人研究[18-21]。实验步骤：乙酰丙酮铁1 mmol和TREG 25 mL在三颈烧瓶中混合，连接氩气、球形冷凝管和温度计。氩气流保护15分钟后，以3°C/分钟升温至120°C维持1小时，再以相同升温速率升至250°C维持30分钟。反应混合物自然冷却至室温，加入2 mL无水乙醇稀释，随后乙酸乙酯沉淀。8000 rpm离心20分钟收集沉淀，重悬于无水乙醇。USPIO在4°C无水乙醇中保存备用。

PAA/PEG包覆USPIO制备

根据前人报道[22]获得USPIO-PAA。详细：聚丙烯酸（PAA）1.5 g溶于24 mL二乙二醇。氩气保护5分钟后，升温至110°C维持至溶液澄清。将前步制备的含28 mg USPIO乙醇分散液经超声分散后加入上述澄清溶液。最终以3°C/分钟升温至210°C回流2小时，自然冷却至室温。加入乙酸乙酯沉淀USPIO NPs，8000 rpm离心20分钟除去上清。沉淀分散于乙醇，再用乙酸乙酯沉淀。洗涤三次后，USPIO-PAA分散于超纯水备用。为改善生物相容性，利用EDC和NHS介导酰胺化反应[23]进一步将PEG连接到纳米颗粒表面。0.45 g PEG溶于5 ml超纯水加入15 ml USPIO-PAA分散液（含35 mg Fe），补充20 mg EDC和12 mg NHS。室温机械搅拌2小时，加入10 ml DMF溶剂，在旋转蒸发仪40°C除水。最后加入40 mg EDC和24 mg NHS，室温混合48小时。反应液转入透析袋在超纯水中透析72小时，每12小时换水。混合液进一步转入超滤管，4000 rpm离心10分钟收集Mr>30 kD分子。最终产物溶于超纯水，4°C保存。某些情况下，水溶SPIO-PAA/PEG经超滤离心管（>30 KD孔径，Millipore）离心收集，沉淀在真空烘箱干燥供进一步实验。

NPs表征

样品粒径、粒径分布和形貌用TEM分析。包覆层用负染法测量。超声分散后，水溶液中USPIO-PAA和USPIO-PAA/PEG加入300目碳膜铜网，自然干燥后置于透射电子显微镜（Tecnai G2F20 s-twin，FEI）观察。

红外光谱分析在Agilent Technologies Cary 600系列FTIR光谱仪上进行，干燥样品粉末直接加入样品池检测。

USPIO-PAA/PEG分散液中Fe含量用火焰原子吸收光谱法（FAAS）测定，仪器为PerkinElmer Analyst 700。先配制1、2、3、4、5 μg/mL铁标准液绘制标准曲线，再将100 μL USPIO-PAA或USPIO-PAA/PEG分散液用硝酸溶解，在50 mL容量瓶中定容测定铁含量。

纳米颗粒磁共振成像在苏州大学第一附属医院影像科3 T临床扫描仪上进行。纳米颗粒按相应浓度分散于1%琼脂糖凝胶溶液，固化后用多重回波序列测量横向弛豫时间。以DICOM格式导出MRI采集数据，用RadiAnt DICOM Viewer读取灰度值，将不同时间回波灰度值导入Origin拟合，获得不同浓度USPIO分散液横向弛豫时间值；最后以横向弛豫率1/T2与样品Fe浓度线性拟合获得USPIO-PAA和USPIO-PAA/PEG样品横向弛豛率r2。USPIO-PAA和USPIO-PAA/PEG磁滞回线在苏州科技大学用Quantum Design DynaCool-9装置按前文方法[24]测得。

HADSCs分离与鉴定

所有研究遵循《人胚胎干细胞研究伦理指导原则》（科技部和卫生部，2003）和赫尔辛基宣言。脂肪组经苏州大学第一附属医院知情同意和伦理批准获取。脂肪组织在解剖显微镜下去除血管和结缔组织后洗净切碎。组织块用I型胶原酶（0.3 pzu/mL）37°C消化30分钟，500g离心10分钟。细胞沉淀用DMEM+10% FBS重悬，以8×10⁴/cm²密度接种。48小时后弃除含悬浮细胞旧培养基，换新鲜培养基。

用流式细胞术表征HADSCs表面标记，特异性标记间充质（CD90和CD105）和造血（CD34和CD45）干细胞。收集1×10⁵细胞，分别与PE、FITC、APC/cy7或PerCP偶联抗CD34、CD45、CD90、CD105小鼠抗人单克隆抗体及相应同型对照孵育。染色细胞用流式细胞仪（LSRFortessa，BD，美国）分析，数据用FlowJo软件分析。选择CD90+、CD105+、CD34−、CD45−四种表型作为HADSCs表面标记。用流式细胞术（BD LSRFortessa）鉴定细胞表面标记表达水平。

用油红O和茜素红染色分别评估HADSCs脂肪生成和成骨分化。HADSCs分别用MesenCultTM脂肪生成分化培养基（Stem cell Tech.，05412）或OriCellTM成骨分化试剂盒（Cyagen，HUXMA-90021）培养。脂肪生成分化第14天用油红O染色定性评估脂滴充满成熟脂肪细胞（VivaCell Biosciences，C37A00150）。成骨分化第21天用茜素红染色评估成熟骨细胞钙结节（VivaCell Biosciences，C37C00150）。倒置Nexcope显微镜获取图像。

USPIO-PAA/PEG体外细胞摄取与生物相容性评价

HADSCs以1×10⁶/孔密度接种6孔板。用含USPIO-PAA/PEG（Fe 10 μg/mL和0.1 μg/mL）培养基孵育2小时，普鲁士蓝（PB）染色鉴定细胞内Fe。

USPIO-PAA/PEG生物相容性用MTT比色法和5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）掺入实验（EdU增殖试剂盒，Thermo）测定。MTT实验：HADSCs以5×10³/孔密度接种96孔板，孵育不同浓度（0、10、20、40、80、160 Fe μg/mL）USPIO-PAA/PEG 24、48、72小时。每孔加20 μl MTT溶液（5 mg/mL）4小时，加150 μL二甲基亚砜溶解结晶。用酶标仪（BioTek Synergy HT）在OD 570 nm测定各孔吸光度值。EdU实验：HADSCs用160 Fe μg/mL SPIO-PAA/PEG孵育72小时，随后10 μM EdU孵育24小时。细胞收集、4%多聚甲醛固定、2 mg/mL甘氨酸中和。渗透后用染料溶液（叠氮647复合物）孵育，用流式细胞术评估EdU掺入率。

6-OHDA诱导PD模型

用15-20只雄性Wistar大鼠（SPF级，体重220±20 g）进行USPIO-PAA/PEG标记HADSCs在PD动物体内追踪。所有程序按中国法规（实验动物管理条例，2017）执行，经中国科学院实验动物护理使用委员会批准。全程动物在受控光照（12/12小时明/暗周期，7 am开灯）下饲养，自由取食饮水。PD模型通过将6-羟基多巴胺（6-OHDA，Sigma，St. Louis，MO，USA）双点注射至大鼠单侧纹状体建立。如前文[25,26]，大鼠立体定向注射3 μL 6-OHDA溶液（5 μg/μL）于两个坐标（AP: 1.2 mm, ML: 2.2 mm, DV: −4.0至6.0 mm；AP: −1.0 mm, ML: 4.4 mm, DV: −4.5至6.5 mm）。阿扑吗啡诱导旋转（0.5 mg/kg，皮下注射）测试验证PD模型有效性。6-OHDA处理后第1、2、3周皮下注射阿扑吗啡（0.5 mg/kg），在开放场评估30分钟旋转评分。阿扑吗啡诱导每分钟旋转>7次视为PD模型成功。

细胞移植与体内MRI成像

HADSCs达80%融合度时，用USPIO-PAA/PEG（铁浓度10 μg/mL）孵育2小时。PD模型制备3周后，将3×10⁶ USPIO-PAA/PEG标记HADSCs或生理盐水立体定向注射至PD大鼠模型左侧纹状体（AP: 1.2 mm, ML: 2.2 mm, DV: −4.0至6.0 mm）。移植动物术后立即及此后2天给予丁丙诺啡（0.5 mg/kg）。这些动物在移植手术后第1、2、3周接受阿扑吗啡诱导旋转测试。

体内MRI成像：用小动物体内成像系统（IVIS，PerkinElmer，Waltham，MA，USA）在HADSCs或生理盐水注射后第3、9、15、21天成像。

组织学分析

干细胞移植3周后取剩余大鼠模型大脑，切片厚度30 μm分析（n=5/组）。切片用抗酪氨酸羟化酶（TH，abcam，英国）孵育，Alexa-594偶联驴抗兔抗体（Abcam）显色。DAPI核染色对比。Leica TCS SP5共聚焦显微镜捕获图像。

统计分析

数值数据表示为均值±SD。用GraphPad Prism 7.0（GraphPad Software Inc.，San Diego，CA，USA）进行双尾Student t检验或单因素方差分析（ANOVA）评估差异。*表示p<0.05，NS表示无显著差异。

结果

纳米颗粒合成与表征

实验设计见图1。疏水性USPIO NPs采用热分解法制备。如图2a-c所示，原始USPIO NPs直径4.07±0.57 nm；PAA包覆后USPIO-PAA NPs直径增加至6.34±0.54 nm；进一步PEG修饰使USPIO-PAA/PEG NPs直径达10.07±0.55 nm。三种纳米颗粒均呈球形且均匀分散。统计分析显示USPIO、USPIO-PAA和USPIO-PAA/PEG NPs直径差异显著（F=10，**p<0.01，##p<0.01），表明PAA和PEG修饰成功（图2d）。

红外吸收法显示USPIO-PAA在1728 cm⁻¹有明显羰基吸收峰（PAA分子羰基伸缩振动峰）；USPIO-PAA/PEG在1595 cm⁻¹有碳氮键面内弯曲振动峰和3440 cm⁻¹羟基伸缩振动峰（图2e）。所有数据进一步确认PAA或PEG分子成功修饰到NPs表面。

USPIO-PAA/PEG显示良好体外磁响应与HADSC生物相容性

用不同浓度（相当于Fe浓度）MRI图像灰度值评估USPIO-PAA和USPIO-PAA/PEG体外成像能力。拟合后获得不同浓度分散液横向弛豫时间值。以横向弛豛率1/T2为纵坐标、Fe浓度为横坐标，计算得USPIO-PAA横向弛豛率107.94 s⁻¹ mM⁻¹（图3a），USPIO-PAA/PEG为84.65 s⁻¹ mM⁻¹（图3b）。两者均显示良好MRI成像性质。SPIO-PAA和SPIO-PAA/PEG磁滞回线显示：SPIO-PAA在10,000 Oe以上饱和磁化值57 emu/g（图3c），SPIO-PAA/PEG为40 emu/g（图3d）。矫顽力和剩磁均接近零（图3c、d），进一步表明两者均为超顺磁性。

不同时间孵育USPIO-PAA/PEG NPs与HADSCs，发现对细胞存活无显著影响（p>0.05）。当等效Fe浓度0-160 μg/mL范围内，HADSCs细胞活力保持96%以上。且孵育时间增加（24至72小时）在各Fe浓度下均不诱导显著细胞损失（图4a）。USPIO-PAA/PEG NPs不同样品浓度孵育iPSCs得类似观察（图4b）。即使HADSCs用160 μg Fe/mL USPIO-PAA/PEG处理72小时，增殖能力（EdU掺入率指示）未受USPIO-PAA/PEG影响（图4c）。所有数据表明合成USPIO-PAA/PEG NPs生物安全性。

为鉴定细胞能否被USPIO-PAA/PEG NPs有效标记，用等效Fe 10 μg/mL或0.1 μg/mL孵育HADSCs 2小时。图4d显示，USPIO-PAA/PEG（Fe 10 μg/mL）存在下，近100% HADSCs观察到大量染蓝NPs。即使剂量降至0.1 μg Fe/ml，仍在几乎所有HADSC观察到均匀分散PB染色。与其他报道SPIO[14,27,28]相比，USPIO-PAA/PEG表现出高细胞摄取效率。

PD大鼠模型中USPIO-PAA/PEG NPs标记HADSCs长期追踪

USPIO-PAA/PEG NPs标记HADSCs经立体定向注射移植至PD大鼠模型左侧纹状体。图5显示，移植3天后左侧纹状体观察到清晰MRI信号，表明移植细胞适当体内追踪。D3、D9、D15、D21动态观察显示，NP标记移植细胞可清晰追踪长达3周，MRI信号过程中无明显减弱。结果表明合成纳米颗粒具有移植细胞体内追踪良好潜力。

USPIO-PAA/PEG NPs标记HADSCs在PD模型中展现治疗效果

为评估NPs标记HADSCs是否有治疗效果，首先进行分离HADSCs表型表征。图6a显示培养HADSCs为梭形细胞。流式细胞术分析显示HADSCs高表达间充质标记CD90（>99%）和CD105（>99%），鲜有表达造血标记CD34和CD45（图6b-g）。HADSCs特定条件下可向脂肪生成或成骨谱系分化，分化能力用油红O或茜素红染色显示（图6h）。注意分化HADSCs中脂滴或钙化结节，对照HEK293细胞无此结构（图6h）。所有表明HADSCs符合间充质细胞标准。

6-OHDA注射后第1、2、3周阿扑吗啡诱导旋转分别为17.1±1.79、28.7±1.77、31.86±1.72次/分钟，确认大鼠PD模型成功建立。如图7所示，NPs标记HADSCs移植至病变侧纹状体后，PD大鼠模型旋转数第1、2、3周分别降至32.59±1.12、31.85±1.98、31.54±1.72。统计分析显示移植手术后第2周起生理盐水组与HADSC给药组有显著差异（第2周p<0.01，第3周p<0.01；各组n=5），表明NPs标记HADSCs改善PD模型行为损伤。

PD以黑质表达酪氨酸羟化酶（TH）神经元丧失为特征。用抗TH免疫染色发现6-OHDA减少黑质TH表达神经元，PD大鼠模型纹状体移植HADSCs可缓解此减少（图8）。结合细胞移植缓解PD大鼠行为损伤观察，结论：USPIO-PAA/PEG NPs标记HADSCs在PD大鼠模型中发挥治疗作用。

讨论

细胞疗法是神经退行性疾病治疗极具前景策略，过去20年处于临床前研究前沿[29,30]。追踪移植细胞是阐明潜在机制和评估临床效果不可或缺部分；但具有挑战性且在一定程度上阻碍细胞疗法应用[31,32]。计算机断层扫描（CT）、近红外荧光成像（NIFI）和MRI是移植细胞体内追踪最常用方法[31,32]。与CT较高辐射和NIFI低灵敏度相比，MRI显示深层组织成像好、对比度高、电离辐射低，适合体内追踪[33-36]。因此开发适合MRI示踪剂成为推动细胞疗法应用不可或缺部分。

SPIO是MRI可视化简单可靠标记策略。为实现移植细胞长期体内追踪，SPIO颗粒需具有均一超小尺寸，因大颗粒可能导致示踪剂分布不均并干扰正常血液循环[33]。此外，纳米颗粒内化效率和生物相容性是评价示踪剂另一重要指标。纳米颗粒通常通过液相内吞[37]、受体介导内吞[38]和吞噬[39]进入细胞。为获得更好细胞摄取，SPIO颗粒通常用中间配体修饰[18,40,41]。

除细胞追踪外，SPIO也用于药物递送[42]。组织分布和药代动力学清除是两种应用重要指标。与NPs-PAA相比，NPs-PAA/PEG显示血液中更长保留时间和更慢尿液清除[43]。密集PEG包覆NPs在黏膜上皮表面（包括胃肠道[44]、呼吸系统[45,46]和脑肿瘤[42]等）提供更均匀分布。此外，PEG包覆减少蛋白质吸附和冠层形成，这反过来可能以减少摄取为代价促进NPs均匀分布[47]。作为潜在良好诊疗工具，SPIO-PAA/PEG对MSC标记能力及其在PD等脑疾病应用研究不足，本研究旨在回答此问题。本研究合成新型超小USPIO-PAA/PEG纳米颗粒，分别用PAA和PEG配体修饰SPIO核。USPIO-PAA/PEG NPs具有均一超小直径（10.07±0.55 nm）、水溶液良好分散性、与多种细胞类型生物相容性及体外体内良好磁响应效应。重要的是，脑移植标记HADSCs信号在MRI下可清晰检测长达三周，显示良好临床应用潜力。

PD以黑质多巴胺能神经元进行性丧失和多巴胺能网络多巴胺水平缺乏为特征[1]；受影响最重的是黑质纹状体通路包括纹状体。本研究将USPIO-PAA/PEG标记HADSCs移植至PD大鼠模型纹状体，发现此移植改善行为损伤；而且在一定程度上减轻黑质多巴胺能神经元丧失。类似地，Ardeshir等报道移植源自大鼠脂肪组织MSC减轻PD模型阿扑吗啡诱导旋转[48]。不同于移植胎儿中脑组织[49]或多巴胺能神经祖细胞[50]，HADSCs主要通过旁分泌效应[51,52]而非替代受损组织发挥治疗作用。研究显示MSC作为免疫调节、神经保护和神经元分化促进者，这些效应本质上由MSC分泌组介导[6,7,51]。我方结果与此观察一致；而且表明新型USPIO-PAA/PEG示踪剂未干扰HADSCs神经保护效应。

结论

我们开发了新型USPIO-PAA/PEG示踪剂，显示高细胞摄取效率、优异生物相容性和长期MRI追踪能力。USPIO-PAA/PEG标记HADSCs细胞移植后可用MRI追踪3周。此外，标记HADSCs显著减轻PD模型行为损伤，增加黑质多巴胺能神经元数量。USPIO-PAA/PEG示踪剂开发可为干细胞研究和应用提供有前景工具。