石胆酸修饰的金纳米粒子对肝癌细胞的凋亡作用

背景

金纳米粒子（AuNPs）作为纳米材料，由于其独特的光学性质、良好的化学稳定性和生物相容性，在许多领域得到了广泛的应用[1,2,3,4,5]。因此，它在纳米电子学、纳米光子学、催化、传感器、生物标志物等诸多领域具有广阔的应用前景[6,7,8]。由于AuNPs具有较大的表面积和球形，它们可以用作抗肿瘤药物的载体[9,10,11,12]。此外，许多AuNP复合物已主要用于新型抗肿瘤药物以治疗癌症[13, 14]。 AuNP复合物作为抗肿瘤药物载体，可以控制细胞功能、调节基因表达、检测细胞内的分析物[15, 16]。因此，功能化AuNPs的改进成为癌症治疗研究的重要趋势之一[17,18,19]。

石胆酸（LCA）广泛存在于高等脊椎动物胆汁中的次级胆汁酸中。不同种类胆汁酸及其衍生物在医药等领域的应用已有报道[20,21,22]，如可用于治疗胆汁酸缺乏症、胆结石、胆结石等。肝脏疾病 [23,24,25]。并且一些胆汁酸及其衍生物可以作为药物载体，治疗肝病，促进吸收，降低胆固醇。 [26,27,28]。以往的报道表明，LCA对肝癌细胞有很强的抗肿瘤作用，细胞死亡机制是凋亡[29, 30]。细胞凋亡是生物细胞主动死亡的过程，是多细胞生物体调节机体发育、控制细胞衰老、维持内环境稳定的重要机制[31, 32]。尤其是抑制增殖、分化、降低恶性程度、促进肿瘤细胞凋亡是肿瘤治疗的目的[33,34,35,36,37]。

在这项研究中，我们通过将金纳米粒子与 LCA 衍生物结合，合成了具有生物靶向特性的金纳米粒子。我们通过使用 MTT 方法对 HepG2、SMMC-7721、QSG-7701 和 MCF-7 细胞进行 48 小时的细胞毒性研究。我们的细胞毒性结果表明，与其他癌细胞和正常细胞相比，AuNP@MPA-PEG-LCA 可以更有效地抑制多种肝癌细胞的生长。 Hoechst 33342 染色、膜联蛋白 V-FITC 染色、线粒体膜电位 (MMP) 分析和 AO/EB 染色实验证实了细胞凋亡在抑制细胞增殖中的作用。肝癌细胞ROS水平升高，提示AuNP@MPA-PEG-LCA可能通过ROS产生介导的线粒体功能障碍诱导细胞凋亡。

方法

材料

除非另有说明，否则化学品均购自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)，无需进一步纯化即可使用。 RPMI-1640 培养基和胎牛血清 (FBS) 来自 Invitrogen Corporation。 HepG2（人肝细胞肝癌细胞）、SMMC-7721（人肝细胞肝癌细胞）、QSG-7701（人正常肝细胞）和MCF-7（人乳腺癌细胞）购自上海生物科学研究所（中国上海）。

AuNP@MPA 的合成

根据 J. Turkevich 等人开创的方法制备了平均尺寸为 4.0 nm 的柠檬酸盐封端的金纳米粒子 (AuNP@MPA)。 [38]。简而言之，将 773 μl 38.8 mM 柠檬酸钠溶液和 2 mL 15 mM HAuCl 4 溶液溶解到 30 mL Milli-Q H2O 中，并在 25°C 下搅拌该溶液。然后，加入 3 mL 0.1 M NaBH4（新制备的）。在 25°C 反应 2 小时后，溶液从无色变为浅橙色。然后，在 pH 11 下加入 3 mL 0.01 M 3-巯基丙酸 (MPA) 的无水乙醇溶液，并在 25°C 下保持反应 2 小时。反应混合物离心得到化合物AuNP@MPA。

AuNP@MPA-PEG的合成

将 10.5 毫克 (0.0875 毫摩尔) 1-羟基吡咯烷-2,5-二酮 (NHS) 和 7 毫克 (0.035 毫摩尔) 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 (EDC) 添加到 50 mM AuNP@MPA 溶液中4-吗啉乙磺酸 (MES)，并将溶液在 25°C 下搅拌 30 分钟。然后，加入0.045 mmol NH 2 -PEG1000-NH 2 并将混合物在25℃下搅拌24小时。反应完成后离心得到化合物AuNP@MPA-PEG。

AuNP@MPA-PEG-LCA的合成

将在超纯水中的化合物 AuNP@MPA-PEG 添加到 200 μL 包含 17 mg (0.045 mmol) LCA 的无水二甲基甲酰胺 (DMF) 溶液中，并将反应溶液在 25°C 下搅拌 24 小时。反应完成后，将反应液离心得到化合物AuNP@MPA-PEG-LCA。

透射电子显微镜 (TEM)

在 JEOL JEM-200CX TEM 上检测 AuNP 的形态和尺寸，工作电压高达 200 kV。将 AuNP 溶液滴在铜网格（300 目）上。

AuNPs 的抗肿瘤能力分析

我们使用四种类型的细胞（HepG2、SMMC-7721、QSG-7701 和 MCF-7）通过修饰的 3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5 研究 AuNPs 的抗肿瘤能力-二苯基溴化四唑 (MTT) 法。测定中使用了 0.2、0.4、0.6、0.8 和 1.0 mg/mL 的 AuNP 和原始金纳米颗粒 (AuNP@MPA)。每孔OD570在Tecan Infinite M200多模读板仪上测定。

Hoechst 染色确定形态

使用 AuNP@MPA-PEG-LCA (0.5 mg/mL) 24 和 48 小时后，HepG2 细胞在细胞培养箱中用 10 μg/mL 的 Hoechst 33342 染色 30 分钟。 Leica-SP8共聚焦显微镜检测细胞核形态。

细胞前期凋亡：膜联蛋白 V-FITC 染色

使用 AuNP@MPA-PEG-LCA (0.5 mg/mL) 6 h 后，HepG2 细胞在细胞培养箱中用 Annexin V-FITC 染色 10 min，然后用 Leica-SP8 共聚焦显微镜观察。

对于 AuNP 的流式细胞仪检测，用 AuNP@MPA-PEG-LCA（0.5 毫克/毫升）处理 6 小时后，HepG2 细胞在细胞培养箱中用膜联蛋白 V-FITC 染色 10 分钟，并用 FACSCalibur 流式细胞仪检测(Becton Dickinson &Co., Franklin Lakes, NJ)。

线粒体膜电位 (MMP) 分析

在 37°C 下用 AuNP@MPA-PEG-LCA（0.5mg/mL）处理 6 小时的 HepG2 细胞与 10μg/mL JC-1（5,5',6,6'-四氯-1,1 ',3,3'-四乙基苯并咪唑基碳化菁碘化物；分子探针）在 37°C 下保持 10 分钟。随后用FACSCalibur流式细胞仪检测细胞。

对于荧光显微镜观察，将 HepG2 细胞用 AuNP@MPA-PEG-LCA 和 10 μg/mL JC-1 处理 10 分钟，然后使用 Leica-SP8 共聚焦显微镜观察。

活性氧 (ROS) 的测量

使用 2',7'-二氯荧光素二乙酸酯 (H2DCF-DA) 测定细胞内 ROS 的积累。用 AuNP@MPA-PEG-LCA 样品（0.5mg/mL）处理 HepG2 细胞 6 小时后，在 37°C 下与 10 μM H2DCF-DA 孵育 30 分钟。采用FACSCalibur流式细胞仪和共聚焦显微镜观察细胞荧光强度。

结果与讨论

金纳米粒子的制备和表征

首先，制备水溶性 AuNP@MPA（方案 1）。图 1a 描绘了 AuNP@MPA 的 TEM 结果。结果表明，AuNP@MPA 的形状和尺寸呈现出非常相似的球形，紧凑的尺寸为 4.0 ± 0.5 nm。然后制备 AuNP@MPA-PEG-LCA（方案 1）。并且还通过 TEM 分析了颗粒的形态（图 1c）。 TEM 图像显示 AuNP@MPA-PEG-LCA 的形态与 AuNP@MPA 的形态相似。经统计分析，AuNP@MPA-PEG-LCA的直径为~ 16 nm。

AuNP@MPA-PEG-LCA的合成示意图

a 的 TEM 图像 AuNP@MPA，b AuNP@MPA-PEG和c AuNP@MPA-PEG-LCA

细胞毒性的结果

为了研究 AuNPs 的细胞毒性，选择 HepG2、SMMC-7721、QSG-7701 和 MCF-7 细胞并用 AuNPs 和 AuNP@MPA 处理 48 小时。并采用MTT法检测样品的细胞毒性。 AuNPs 和 AuNP@MPA 在不同细胞上的细胞活力如图 2 所示。结果表明 AuNP@MPA 在所有细胞中的细胞毒性都非常低。然而，随着纳米颗粒浓度的增加，AuNP@MPA-PEG-LCA可以更有效地抑制多种肝癌细胞的生长，但对正常细胞和其他癌细胞的损伤较小。即，AuNP@MPA-PEG-LCA对HepG2和SMMC-7721细胞的抗增殖活性高于QSG-7701和MCF-7细胞。

AuNP@MPA 和 AuNP@MPA-PEG-LCA (AuNPs) 与 HepG2、SMMC-7721、QSG-7701 和 MCF-7 细胞孵育 48 小时后的细胞活力

诱导细胞凋亡

凋亡细胞核是细胞凋亡的常见指标。用AuNP@MPA-PEG-LCA处理指定时间后，将细胞与Hoechst 33342一起孵育。然后使用共聚焦显微镜观察细胞核的形态特征。如图 3 所示，对照细胞和用 AuNP@MPA 孵育的细胞表现出完整且均匀的细胞核染色；然而，AuNP@MPA-PEG-LCA处理的HepG2细胞凋亡细胞数量随着孵育时间的增加而逐渐增加，细胞核显示出典型的细胞凋亡特征，如细胞核破碎、染色质凝聚、细胞体积减少。

用 Hoechst 33342 染色的 HepG2 细胞核的形态特征。HepG2 细胞与 AuNP@MPA-PEG-LCA (0.5 mg/ml) 孵育 a 0 h，b 24 小时和 c 48 小时和 d AuNP@MPA (0.5 mg/ml) 孵育 48 小时。凋亡细胞核凝聚、破碎，细胞体积缩小；比例尺 20 μm

众所周知，膜联蛋白 V 染色可以区分早期凋亡和坏死细胞。在细胞凋亡的早期阶段，膜联蛋白 V 可以结合膜磷脂磷脂酰丝氨酸 (PS)，其从质膜的内表面到外表面 [39]。因此，我们通过膜联蛋白 V-FITC 染色试验研究了诱导 AuNP@MPA-PEG-LCA 细胞凋亡的潜力。如图 4a 所示，对照细胞膜上没有明显的绿色荧光，但 AuNP@MPA-PEG-LCA 处理的 HepG2 细胞的细胞膜上有明显的绿色荧光。这种现象是早期细胞凋亡的有力指标。众所周知，共聚焦显微镜的图像只能证明细胞凋亡的发生；然而，流式细胞术可以快速、灵敏地测量细胞凋亡的发生并准确测定细胞凋亡率。因此，我们通过使用流式细胞术进一步研究了细胞凋亡的阶段。图 4b 显示了流式细胞术的细胞凋亡率结果。 AuNP@MPA-PEG-LCA处理的HepG2细胞凋亡百分比约为38.45%，而对照细胞的凋亡百分比仅为8.16%左右。显着的凋亡百分比表明AuNP@MPA-PEG-LCA孵育的细胞持续凋亡。

a的凋亡结果 共聚焦图像和 b 用 AuNP@MPA-PEG-LCA（0.5 mg/ml）处理的 HepG2 细胞的流式细胞术数据。细胞用膜联蛋白 V-FITC 染色（激发波长为 488 nm，发射波长为 500-560 nm）；比例尺 20 μm

MMP 下降

线粒体在细胞凋亡中起着重要作用，因为它可以释放促凋亡因子，如细胞色素 C 和凋亡诱导因子 [40,41,42]。因此，我们通过使用共聚焦显微镜和流式细胞术来探索 MMP 的变化。图 5a 显示了通过共聚焦显微镜观察用 AuNP@MPA-PEG-LCA 处理的 JC-1 标记的 HepG2 细胞的荧光图像。我们可以观察到对照HepG2细胞中有明显的红色JC-1荧光和健康的线粒体，表明存在JC-1聚集。然而，用AuNP@MPA-PEG-LCA处理的HepG2细胞中有更多的绿色荧光，表明发生了膜塌陷。凋亡细胞中的线粒体破坏表明 JC-1 不会在线粒体内积累，而是分布在整个细胞中。作为单体形式，分散存在的 JC-1 发出绿色荧光。为了进一步量化 MMP 的变化，我们通过流式细胞术评估了用 JC-1 染色的 HepG2 细胞。通过流式细胞术在用 AuNP@MPA-PEG-LCA 处理的 HepG2 细胞和对照细胞中记录的代表性 JC-1 红/绿比信号如图 5b 所示。我们可以观察到，从 JC-1 染色的细胞的定量分析中可以观察到，在用 AuNP@MPA-PEG-LCA 处理的细胞中，红色/绿色的比例显着降低，而对照细胞则显着增加，这表明 AuNP@ MPA-PEG-LCA可诱导HepG2细胞凋亡。

一 通过共聚焦显微镜和b观察到的JC-1标记细胞的荧光图像 流式细胞术分析AuNP@MPA-PEG-LCA对MMP的影响

AuNP@MPA-PEG-LCA 对 ROS 的影响

众所周知，细胞内ROS水平升高可触发细胞凋亡，这也是参与诱导细胞凋亡的有力证据[43]。为了进一步探索线粒体功能障碍是否与 ROS 的产生有关，我们通过使用共聚焦显微镜和流式细胞术测定了 H2DCF-DA 染色的 HepG2 细胞中的 ROS 水平。如图 6a 所示，与对照细胞相比，用 AuNP@MPA-PEG-LCA 处理的 HepG2 细胞中 H2DCF-DA 的绿色荧光强度显着增加。也就是说，AuNP@MPA-PEG-LCA处理后HepG2细胞中ROS的含量显着增加。然后，通过流式细胞术研究细胞中ROS含量的定量分析。如图 6b 所示，与对照细胞相比，用 AuNP@MPA-PEG-LCA 孵育的细胞中检测到更高的荧光强度，这表明用 AuNP@MPA-PEG-LCA 处理的细胞中的 ROS 含量更高.数据表明线粒体功能障碍可能与 ROS 的产生有关。这些结果初步表明ROS的产生在AuNP@MPA-PEG-LCA诱导细胞凋亡中具有重要作用。

HepG2 细胞用 AuNP@MPA-PEG-LCA 处理 6 小时后 ROS 产生的分析。 a检测HepG2细胞内ROS的含量 共聚焦显微镜（激发波长为 488 nm，发射波长为 530 nm）和 b 流式细胞术（激发波长为 488 nm，发射波长为 525 nm）

结论

总之，我们合成了平均直径为 16.0 nm 的 AuNP@MPA-PEG-LCA，可以抑制多种肝癌细胞的生长。 AuNP@MPA-PEG-LCA有效抑制细胞因凋亡而增殖，核染色、JC-1染色、MMP分析和膜联蛋白V-FITC染色实验证明了这一点。在流式细胞术研究中，AuNP@MPA-PEG-LCA 在肝癌细胞中的阻滞进一步证明了它们的凋亡行为。因此，初步机制研究表明，AuNPs可以通过ROS介导的线粒体功能障碍有效诱导细胞凋亡，并且在促进肝癌细胞程序性细胞死亡方面更有效。

缩写

AuNPs：

金纳米粒子

DMF：

二甲基甲酰胺

EDC：

1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐

FBS：

胎牛血清

H2DCF-DA：

2',7'-二氯荧光素二乙酸酯

HepG2：

人肝细胞肝癌细胞

JC-1：

5,5',6,6'-四氯-1,1',3,3'-四乙基苯并咪唑基碳化菁碘

LCA：

石胆酸

MCF-7：

人乳腺癌细胞

MES：

4-吗啉乙磺酸

MMP：

线粒体膜电位

MPA：

3-巯基丙酸

MTT：

3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基溴化四唑

NHS：

1-羟基吡咯烷-2,5-二酮

PEG：

聚乙二醇

附注：

磷脂酰丝氨酸

QSG-7701：

人正常肝细胞

ROS：

活性氧

SMMC-7721：

人肝细胞肝癌细胞

TEM：

透射电子显微镜