石胆酸修饰金纳米粒子诱导肝癌细胞选择性凋亡

摘要

金纳米粒子（AuNPs）因其优异的生物相容性、光学性质和药物递送潜力而备受关注。本研究通过羧基偶联技术，利用聚乙二醇（PEG）作为间隔臂，将石胆酸（LCA）配体修饰在金纳米粒子表面，构建了AuNP@MPA-PEG-LCA纳米复合物。细胞毒性实验表明，该纳米复合物表现出显著的选择性：能有效抑制多种肝细胞癌细胞（HepG2、SMMC-7721）的增殖，而对正常肝细胞（QSG-7701）和乳腺癌细胞（MCF-7）毒性极低。通过Hoechst 33342染色观察核浓缩、Annexin V-FITC检测磷脂酰丝氨酸外翻、JC-1探针监测线粒体膜电位（MMP）丢失、AO/EB双染色等多重手段，均确认了AuNP@MPA-PEG-LCA诱导肝癌细胞凋亡。机制研究显示，纳米粒子触发细胞内活性氧（ROS）大量积累，导致线粒体功能障碍，进而激活程序性细胞死亡途径。这些发现表明，AuNP@MPA-PEG-LCA是一种极具前景的靶向肝癌纳米治疗药物。

研究背景

金纳米粒子凭借独特的表面等离子共振、化学稳定性和巨大的比表面积，成为生物医学领域药物递送、成像诊断和光热治疗的理想载体材料。其球形结构有利于细胞高效摄取并减少脱靶效应。通过靶向配体或聚合物修饰，可进一步提升AuNPs的治疗指数，尤其在肿瘤治疗中应用广泛。

石胆酸（LCA）作为一种次级胆汁酸，已有研究证实其通过诱导凋亡对肝癌具有强效抑制作用。作为天然内源性分子，LCA既可作为靶向配体引导AuNPs富集于肝脏组织，又能改善纳米粒子溶解度，还可能调节细胞内信号通路。将AuNPs的生物相容性与LCA的抑癌特性相结合，有望开发出利用ROS介导的线粒体途径选择性诱导肝细胞癌细胞凋亡的抗癌纳米药物。

材料与方法

主要试剂与细胞系

除特别注明外，所有试剂均购自Sigma-Aldrich。细胞培养基（RPMI-1640、FBS）来自Invitrogen。人肝细胞癌细胞株HepG2、SMMC-7721，正常肝细胞QSG-7701，以及乳腺癌细胞MCF-7均来源于上海生命科学研究院。

AuNP@MPA的制备

采用Turkevich法利用HAuCl₄和NaBH₄合成平均粒径4.0±0.5 nm的柠檬酸包裹AuNPs，随后在pH 11条件下用3-巯基丙酸（MPA）进行表面修饰，引入羧基基团以便后续偶联。

PEGylation修饰

将AuNP@MPA（0.0875 mmol）与NHS（0.0875 mmol）和EDC（0.035 mmol）在50 mM MES缓冲液中活化，加入NH₂-PEG₁₀₀₀-NH₂（0.045 mmol），室温反应24 h后离心纯化获得AuNP@MPA-PEG。

石胆酸偶联

将AuNP@MPA-PEG与LCA（0.045 mmol）在无水DMF中室温搅拌24 h，经多次离心纯化得到最终产物AuNP@MPA-PEG-LCA。

透射电镜表征

利用JEOL JEM-200CX透射电镜（200 kV）观察纳米粒子形貌与尺寸，样品滴铸于300目铜网上。

细胞毒性检测（MTT法）

将细胞与不同浓度（0.2–1.0 mg mL⁻¹）AuNPs共孵育48 h，采用MTT法检测细胞活力，Tecan Infinite M200酶标仪在570 nm处测定吸光度。

凋亡形态学观察（Hoechst 33342）

HepG2细胞经0.5 mg mL⁻¹ AuNP@MPA-PEG-LCA处理24 h和48 h后，用10 µg mL⁻¹ Hoechst 33342染色30 min，Leica-SP8共聚焦显微镜拍摄核形态。

早期凋亡检测（Annexin V-FITC）

细胞经0.5 mg mL⁻¹ AuNP@MPA-PEG-LCA处理6 h后，Annexin V-FITC染色，流式细胞仪（FACSCalibur, BD）定量分析，同步获取共聚焦图像。

线粒体膜电位检测（JC-1）

用JC-1探针（10 µg mL⁻¹）检测处理6 h后HepG2细胞的MMP变化，流式细胞术与共聚焦显微镜双重验证。

活性氧水平测定

采用H₂DCF-DA（10 µM）探针，经0.5 mg mL⁻¹ AuNP@MPA-PEG-LCA处理6 h后，流式细胞术与共聚焦显微镜定量细胞内ROS水平。

结果与讨论

纳米粒子表征

TEM图像显示AuNP@MPA-PEG-LCA保持球形结构，平均粒径16.0±1.2 nm（图1c）。PEG和LCA的修饰层使水动力学尺寸显著大于核心AuNP@MPA（4.0 nm），该尺寸范围有利于肿瘤组织的增强渗透与滞留（EPR）效应。

选择性细胞毒性

MTT实验（图2）显示：AuNP@MPA对所有细胞系均无明显细胞毒性；而AuNP@MPA-PEG-LCA呈剂量依赖性抑制HepG2和SMMC-7721细胞活力，IC₅₀均低于0.6 mg mL⁻¹，但对QSG-7701和MCF-7细胞影响极小。这种选择性谱系有力证明了LCA赋予的肝脏靶向能力。

凋亡核形态学改变

Hoechst染色（图3）显示，经AuNP@MPA-PEG-LCA处理的HepG2细胞随时间延长（48 h）出现进行性核浓缩、碎裂和染色质边聚，为典型晚期凋亡特征；对照组及AuNP@MPA处理组核形态均匀完整。

Annexin V-FITC验证早期凋亡

Annexin V染色（图4）显示，处理组细胞磷脂酰丝氨酸明显外翻至细胞膜外侧。流式细胞术定量显示凋亡率达38.45%，对照组仅8.16%，确证了早期凋亡的诱导。

线粒体膜电位去极化

JC-1分析（图5）显示处理组红色聚集体荧光减弱、绿色单体荧光增强，提示MMP塌陷。流式细胞术红/绿荧光比值显著下降，佐证线粒体功能障碍是凋亡的下游关键事件。

ROS生成与氧化应激

H₂DCF-DA染色（图6）显示处理组细胞绿色荧光显著增强，流式细胞术定量确认ROS水平大幅升高，提示氧化应激先于线粒体去极化而发生，是启动凋亡的上游信号。

结论

本研究成功构建了粒径约16 nm的AuNP@MPA-PEG-LCA纳米粒子，其通过触发ROS介导的线粒体功能障碍途径，选择性诱导肝细胞癌细胞凋亡。核形态学、Annexin V结合、JC-1 MMP检测和ROS水平测定等多维度实验一致证实了该机制。研究结果确立了AuNP@MPA-PEG-LCA作为肝癌靶向纳米药物的巨大应用潜力。

缩略语

AuNPs:

金纳米粒子

DMF:

二甲基甲酰胺

EDC:

1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐

FBS:

胎牛血清

H₂DCF-DA:

2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯

HepG2:

人肝细胞癌细胞

JC-1:

5,5′,6,6′-四氯-1,1′,3,3′-四乙基苯并咪唑基氰碘化物

LCA:

石胆酸

MCF-7:

人乳腺癌细胞

MES:

4-吗啉乙磺酸

MMP:

线粒体膜电位

MPA:

3-巯基丙酸

MTT:

3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐

NHS:

N-羟基琥珀酰亚胺

PEG:

聚乙二醇

PS:

磷脂酰丝氨酸

QSG-7701:

人正常肝细胞

ROS:

活性氧

SMMC-7721:

人肝细胞癌细胞

TEM:

透射电子显微镜