用 6-巯基嘌呤和神经元穿透肽修饰的金纳米颗粒促进 SH-SY5Y 细胞生长

背景

促进神经元细胞增殖和神经突生长在神经再生中很重要 [1, 2]，为此，为了治疗阿尔茨海默病 (AD)、帕金森病 (PD) 和中风等神经退行性疾病，已经做出了很多努力 [3]。 , 4]。许多研究表明，材料的表面特性会影响细胞形态，甚至干扰/促进细胞复制和分化，这在再生医学和开发具有活性生物功能的纳米材料作为神经药物的新策略中具有广阔的前景 [5] , 6].

在现有的生物材料中，金纳米材料由于其易于合成、便于表面功能化、毒性低、稳定性好和生物相容性好等优点，被广泛用于传感、标记、药物递送和成像等生物学领域[7, 8]。例如，之前的一项研究报道，与对照相比，与低功率激光照射相关的金纳米棒刺激神经突长度增加了 25 μm 的 NG108-15 神经元细胞 [9]。

6-巯基嘌呤 (6MP；图 1a) 是一种抗炎药物，已被用于使金纳米粒子 (AuNPs) 的表面功能化，通过 Au-硫键形成 6MP 修饰的 AuNPs (6MP-AuNPs) [10] .据报道，6MP-AuNPs 用于通过开关机制定量分析溶剂中的 6MP 浓度 [11]。然而，没有数据显示6MP-AuNPs对细胞的影响。

实验程序方案。 一 6-巯基嘌呤结构。 b 实验程序。颗粒在 pH 9.0 下合成并在 pH 7.4 下出现聚集。当颗粒加入SH-SY5Y细胞培养基后，它们被内化到细胞内并刺激细胞生长

在这里，我们使用神经元细胞系来研究 6MP-AuNPs 与细胞的相互作用，因为众所周知，神经元细胞受到培养基质的强烈影响。在神经元细胞系中，人神经母细胞瘤 (SH-SY5Y) 细胞因其对环境刺激的高度敏感性和神经研究中功能生物材料的重要性而被认为是一种广泛使用的模型系统。此外，为了提高 6MP-AuNPs 的神经细胞摄取效率，将神经元靶向肽 (RDP) 连接到颗粒表面以形成 6MP-AuNPs-RDP 共轭物。结果表明，该偶联物显示出明显的神经活性，但不具有6MP的抗增殖作用，导致细胞增殖和神经突生长显着增加。

方法/实验

6MP-AuNPs-RDP 共轭物的合成

通过还原法合成了尺寸为 20 nm 的柠檬酸盐包覆的 AuNP。简而言之，将 HAuCl4·3H2O（100 mL，0.01%）的水溶液在剧烈搅拌下加热 30 分钟，然后将柠檬酸钠溶液（10 mL，38.8 mM）快速加入 HAuCl4 溶液中。混合物再回流30分钟，直至得到深红色溶液，自然冷却至室温。

根据之前的报告 [12]，通过在室温下将 AuNP（0.33 mM）和 6MP 溶液（最终浓度 0.046 nM）混合 5 小时来制备 6MP-AuNP。然后，将混合物以 17,000g 离心 30 分钟。随后弃去上清液，重悬沉淀(6MP-AuNPs)，用去离子水洗涤3次。

为了获得 RDP 修饰的 6MP-AuNP，将 RDP（FAM w/CKSVRTWNEI IPSKGCLRVG GRCHPHVNGG GRRRRRRRRC；由中国上海吉尔生物科技有限公司合成）和 6MP（最终浓度分别为 0.023 nM）同时添加到 AuNP 溶液中(0.33 mM) 5 小时，然后以 17,000g 离心 30 分钟。作为对照，合成了 FAM 标记的打乱肽（FAM-SP；GRNECRIPRV GCVSRWRIGR KGRCHRLRPG GRVNRSHT GC）（上海吉尔生物科技有限公司，中国）并同时制备了 6MP-AuNPs-SP-FAM。然后弃去颗粒上清液，分别用去离子水洗涤颗粒。将颗粒溶液分别用0.1 M NaOH调至pH 9.0，然后通过0.22-μm注射器过滤器，4℃保存备用。

粒子的特征

在室温下用紫外/可见分光光度计（UV-2450，Shimadzu Corp，Kyoto，Japan）测量吸收光谱以检测颗粒的光学吸收。用去离子水稀释后，使用动态光散射（DLS）装置（Zetasizer Nano ZS；Malvern）分别测量颗粒的粒径和zeta电位。采用透射电子显微镜（TEM；Shimadzu）观察颗粒结构。

细胞培养

SH-SY5Y细胞在Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）和F-12培养基中按1:1的比例培养。培养基分别补充有 10% 胎牛血清 (FCS)、100 单位/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素。将细胞在加湿培养箱（Thermo Fisher Scientific，USA）中保持在 37°C 和 5% CO2 中。细胞培养试剂均购自美国HyClone。

细胞摄取

SH-SY5Y细胞以5 × 10 ⁴ 的密度接种于24孔板中 细胞/孔。当细胞汇合度达到 60% 时，将终浓度为 0.25 μg/mL 的 FAM 标记的 6MP-AuNPs-RDP 和 6MP-AuNPs-SP 分别加入细胞培养基中培养 2 小时。然后，丢弃细胞培养基并用新鲜培养基替换。用荧光显微镜（Olympus，Japan）观察细胞并拍照。

6MP-AuNPs-RDP 对神经元生长的影响

SH-SY5Y细胞以5 × 10 ⁵ 的密度接种于24孔板中 细胞/孔过夜。然后，将不同浓度（0、0.125、0.25、0.5、1.0 μg/mL）的 RDP-6MP-AuNPs 分别加入培养基中培养 24 小时。使用自动细胞计数器（Bio-Rad，USA）计算细胞数。

此外，根据先前的报告 [13]，通过 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑 (MTT) 测定法测量细胞代谢活性。简而言之，将SH-SY5Y细胞以5×10 ⁴ 的密度接种到96孔板中 细胞/孔，并在含有 10% FBS 的培养基中孵育过夜。然后，将颗粒分别加入培养基中 24 小时。细胞用 PBS 洗涤 3 次，然后将 100 μL 新鲜培养基和 10 μL MTT（PBS 缓冲液中的 5 mg/mL）加入每个孔中。孵育 4 小时后，移除培养基并加入 200 μL 二甲基亚砜 (DMSO) 以溶解产生的甲臜。使用酶标仪（Bio-Rad，美国）在 490 nm 处测量上清液的吸光度。未添加任何细胞的细胞用作空白，仅含有溶剂（0.1 M NaOH（pH 9.0）通过 0.1 M HCl 将 pH 值调节至 7.4）的细胞作为对照。相对细胞代谢活性计算为代谢活性 (%) =OD490 (样品-空白)/OD490 (对照-空白)。每个值取自四次独立实验的平均值。

为了确定 6MP-AuNPs-RDP 对神经突生长的影响，将 SH-SY5Y 细胞移植到 6 孔板中并生长至 30% 汇合。然后，细胞每天用 6MP-AuNPs-RDP (0.25 μg/mL) 处理一次，持续 3 天。在光学显微镜（Olympus，Japan）下观察神经突长度并使用ImageJ软件计算[14]。

涂有 6MP-AuNPs-RDP 的表面上的细胞增殖

将 6MP-AuNPs-RDP 均匀地铺在直径为 3.5 cm 的培养皿底部，然后将细胞移植到颗粒包被的培养皿上。孵育后，在光学显微镜下观察细胞并计算神经突长度。仅含溶剂的细胞用作对照。每个实验独立重复4次，取200个神经突的平均值计算神经突长度。

统计分析

数据表示为平均值 ± SEM。使用计算机程序通过单向方差分析（ANOVA）对数据进行分析，然后使用 SPSS 13.0 软件进行 Dunnett 多极差检验。与 p 的区别 <0.05 被认为具有统计学意义。

结果

纳米粒子的外观和特征

AuNPs 的水溶液在可见光下呈猩红色（图 2a，0 s）。添加 6MP 后，当 6MP 与 AuNPs 缀合时颜色逐渐变暗，最后，反应 5 小时后出现 6MP-AuNPs 的蓝黑色沉淀。将 pH 值调至 9.0 即可解决沉淀，此时 6MP-AuNPs 的水溶液呈玫瑰色。将pH值调至7.4后会重新形成沉淀。

纳米粒子的反应过程和特性。 一 制备 6MP-AuNPs 的反应过程。将 6MP 加入 AuNP 溶液后，溶液颜色发生变化，5 小时内逐渐形成沉淀。 b 当通过 0.1 M NaOH 将 pH 值调节至 9.0 时，6MP-AuNPs-RDP 沉淀溶解。 c 颗粒尺寸分布的 DLS 测量。 d AuNPs、6MP-AuNPs 和 6MP-AuNPs-RDP 的 Zeta 电位。 e TEM下的粒子结构

6MP-AuNPs-RDP 是通过在 pH 9.0 下将 AuNP 与 6MP 或 RDP 的硫醇基团结合来制备的。 6MP-AuNPs-RDP 的水溶液显示出与 6MP-AuNP 溶液相同的玫瑰色（图 2b）。当6MP-AuNPs-RDP溶液的pH值调至7.4时，颗粒在溶液底部沉淀。

通过 DLS 分别检查 6MP-AuNPs 和 6MP-AuNPs-RDP 溶液（pH 9.0）的大小和 zeta 电位（图 2c）。数据显示6MP-AuNPs-RDP的平均尺寸略大于6MP-AuNPs（24.6 vs 20.5 nm），而前者的zeta电位显着高于后者（- 25.8 vs - 37.2 mV），表明阳离子 RDP 增加了颗粒的表面电位。 TEM 图像显示这两种纳米颗粒都是球形的（图 2d）。

纳米颗粒的细胞摄取

当将颗粒溶液调节至 pH 7.4 并加入细胞培养基时，颗粒开始聚集并逐渐沉入孔底。然而，30 分钟后，细胞周围出现明显的空白斑块，6MP-AuNPs-RDP 处理的细胞间隙的颗粒聚集比 6MP-AuNPs 少（图 3a）。此外，与6MP-AuNPs处理的细胞相比，6MP-AuNPs-RDP处理的细胞内观察到更多的纳米颗粒。

纳米颗粒的细胞摄取。 一 将 0.25 μg/mL 的 6MP-AuNPs 和 6MP-AuNPs-RDP 溶液分别调节至 pH 7.4，然后加入细胞培养基中孵育 30 分钟。颗粒被内化到 SH-SY5Y 细胞中或沉淀在井底。 b 6MP 和荧光标记的肽修饰 AuNP 的示意图。将 SH-SY5Y 细胞与颗粒孵育 2 小时后，拍摄图像 (c ) 和荧光强度 (d ) 进行了测量。数据表示为平均值 ± SEM。这些值是四个独立实验的平均值。 ^** p <0.01 与 6MP-AuNPs-SP 处理的细胞相比

为了进一步确定颗粒可以进入神经元细胞，荧光标记的肽与颗粒结合（图 3b）。将细胞与这些纳米粒子孵育 2 小时后，在 6MP-AuNPs-RDP 处理的细胞中观察到强荧光，而在 6MP-AuNPs-SP 处理的细胞中观察到相对较弱的绿色荧光。 （图 3c）。使用荧光光谱仪（Hitachi Ltd. Co. Tokyo，Japan）进行荧光强度测量的结果表明，6MP-AuNPs-RDP 处理的细胞比 6MP-AuNPs-SP 处理的细胞具有显着更高的荧光强度（图 3d )，表明RDP是一种细胞穿透肽(CPPs)，可以提高颗粒的细胞摄取效率。

纳米粒子对神经元生长的影响

为了检查颗粒是否对神经元生长有影响，在将细胞与颗粒孵育 24 小时后，使用 MTT 测定和细胞计数来测量细胞代谢活性和数量。结果表明，单独的 RDP 不影响细胞生长，而 6MP-AuNPs-RDP 和 6MP-AuNPs 在各自浓度高于 0.125 和 0.5 μg/mL 时，以剂量依赖性方式增加细胞代谢活性和细胞数量（图 2）。 4a、b)。此外，6MP-AuNPs-RDP处理的细胞表现出比6MP-AuNPs处理的细胞更高的代谢活性，这可能与6MP-AuNPs-RDP比6MP-AuNPs更高的细胞穿透效率有关。

颗粒增加细胞代谢活性（a ) 和数字 (b )，以及 6MP-AuNPs 和 6MP-AuNPs-RDP 的浓度从 0 到 1.0 μg/mL 数据表示为平均值 ± SEM。仅具有溶剂{0.1 M NaOH (pH 9.0) 通过0.1 M HCl 将pH 7.4 调节} 的细胞用作对照。这些值是四个独立实验的平均值。 ^* p <0.05, ^** p <0.01 与 RDP 处理的细胞相比， ^# p <0.05 和 ^## p <0.01 与 6MP-AuNPs 处理的细胞相比

纳米颗粒对神经突长度的影响

除了颗粒可以增加细胞代谢活性外，在高浓度 (1 μg/mL) 的颗粒下也观察到颗粒对神经突长度的影响。图像（图 5a）显示聚集的纳米颗粒沉降在孔的底部，并且在 6MP-AuNPs-RDP 处理的细胞周围出现了更大的空白斑块区域。

纳米颗粒促进神经突生长。图片 (a ) 和神经突长度 (b ) 在细胞分别用 RDP、6MP-AuNPs 和 6MP-AuNPs-RDP 处理 24 小时后。仅含溶剂的细胞用作对照。这些值是 200 个神经突的平均值。 ^* p <0.05 和 ^** p <0.01 与对照相比

孵育24小时后，结果显示颗粒处理的细胞比对照细胞具有更长的轴突，而RDP处理的细胞与对照之间没有显着差异。此外，6MP-AuNPs-RDP处理的细胞的神经炎明显长于6MP-AuNPs处理的细胞（图5b）。

从图5的结果来看，6MP由于其细胞毒性而杀死了所有的SH-SY5Y细胞；因此，我们没有使用 6MP 来镀膜。此外，如图所示。如图3、4和5所示，相对少量的6MP-AuNPs进入细胞，神经突长度和细胞数量均明显低于6MP-AuNPs-RDP。因此，选择6MP-AuNPs-RDP进行进一步研究以考察对细胞生长的影响。

重复施用 6MP-AuNPs-RDP 后细胞增殖和神经突生长

为了进一步确定 6MP-AuNPs-RDP 对细胞增殖和神经突生长的影响，在 6 孔板培养细胞后的第 1、2 和 3 天，将 6MP-AuNPs-RDP 分三次加入细胞培养基中（第0）。结果表明，颗粒处理细胞的神经突长度明显长于对照（图6a、b），且细胞经颗粒处理后细胞代谢活性增强（图6c）。 <图片>

纳米颗粒诱导细胞增殖和神经突生长。 一 第 1、2、3 和 4 天的细胞图像。b 6MP-AuNPs-RDP 处理的细胞和对照的神经突长度。这些值是 200 个神经突的平均值。 ^** p <0.01 与对照相比。 c 6MP-AuNPs-RDP 处理的细胞的代谢活性。这些细胞每天接受 3 次处理，持续 3 天。首先，在细胞从细胞移植后培养 24 小时后，将 6MP-AuNPs-RDP 添加到细胞培养基中。颗粒的每个浓度为 0.25 μg/mL。 d 细胞在 6MP-AuNPs-RDP 表面涂层上的神经突生长图像。将 6MP-AuNPs-RDP 铺在直径 3.5 cm 的培养皿底部，然后将细胞移植到培养皿上。 e 在 0 ~ 3 天测量神经突长度。仅含溶剂的细胞用作对照。这些值是 200 个神经突的平均值。 ^** p <0.01 与对照相比， ^* p <0.05, ^** p <0.01 与第 1 天的细胞相比。蓝色箭头指向代表性神经突

为了检查当颗粒用作表面涂层材料时 6MP-AuNPs-RDP 对神经突生长的影响，培养皿底部涂有 6MP-AuNPs-RDP，然后将细胞转移到涂层上。图像显示颗粒迅速附着在细胞膜上（图 6d），然后颗粒被内化并分布在整个细胞中，包括细胞质、核膜和细胞核。结果还表明，颗粒处理的细胞具有明显长于对照的神经突（图 6e）。

纳米颗粒对冷冻保存后细胞生长的影响

为了检查细胞对颗粒的耐受性并确定细胞在脱离生长状态后是否保持增殖能力，将 6MP-AuNPs-RDP 处理的细胞冷冻并在它们达到指数生长期时储存数天。然后，回收细胞并在 24 孔板上培养（图 7a）。结果表明，颗粒处理细胞的数量显着增加，神经突比对照长（图7b，c），表明颗粒处理细胞的生长不受冷冻和恢复过程的影响.

纳米颗粒在冷冻储存后增加了神经突长度和细胞数量。 (a ) 细胞在储存前用 6MP-AuNPs-RDP (1.0 μg/mL) 处理，回收细胞并继续培养 3 天。神经突长度 (b ) 和单元格编号 (c ) 6MP-AuNPs-RDP 处理的细胞在储存后显着增加。仅含溶剂的细胞用作对照。数据表示为平均值 ± SEM。 ^** p <0.01 与对照相比。蓝色箭头指向代表神经突

讨论

AuNPs在化学、物理、材料、生物学、医学和相关跨学科领域的各个领域都显示出巨大的潜在应用。为了稳定 AuNPs 的结构，最常使用硫醇修饰的配体作为稳定剂，它们可以通过形成 Au-S 键与 AuNPs 表面结合。本研究中，6MP和RDP的巯基与AuNPs表面结合，颗粒结构稳定，可用于进一步研究。

从结果可以看出，颗粒具有明显的酸碱特性，这与 6MP 分子的 N(9)-H 基团在 10.4 ~ 11.2 溶液中发生的解离有关， 6MP-AuNP 溶液的 pH 值低于 6 时发生聚集。6MP 分子的 N9 质子化中和了 pH 值低于 6 的 6MP-AuNPs，然后分子间相互作用（碱基堆积相互作用）变得非常强并得到补偿静电排斥。 RDP 改性后，除了 6MP-AuNPs 的酸碱特性外，硫醇-RDP 的 pI 约为 11.5，因此颗粒表现出更复杂的酸碱行为。从滴定来看，6MP-AuNPs-RDP 的 pI 值为 7.8，接近生理条件（pH 7.4）。因此，6MP-AuNPs-RDP和6MP-AuNPs可以从细胞培养基中沉淀出来。

在这项研究中，我们发现 RDP 提高了 6MP-AuNPs 的细胞摄取，这与之前的研究一致。众所周知，RDP是一种由39个氨基酸组成的长肽，来源于狂犬病病毒糖蛋白，具有将外来大分子转运到神经元细胞中的能力[15, 16]。在我们之前的研究中，当纳米团簇与 RDP 结合时，金纳米团簇的细胞吸收效率显着提高 [17]。 RDP渗入细胞的机制可能与神经细胞膜γ-氨基丁酸(GABA)受体或烟碱乙酰胆碱受体介导的内吞作用有关[18, 19]。

该研究还表明 6MP-AuNPs-RDP 相对于 6MP 的相反作用，即 6MP-AuNPs-RDP 促进细胞增殖和神经突生长，显示出明显的神经活性。 6MP-AuNPs-RDP 和 6MP 的这种显着差异的机制可能与 6MP（C6 硫醇基的嘌呤衍生物）的化学结构有关 [20]。在 6MP-AuNPs-RDP 表面，6MP 的硫醇基团与 AuNPs 结合从而被阻断。因此，嘌呤基团暴露在颗粒表面。众所周知，嘌呤通过细胞内嘌呤能信号通路在促进神经元生长（如细胞分化、神经突形成和延伸、突触发生）方面发挥着至关重要的作用 [21, 22]，包括丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节蛋白激酶 (MAPK/ERK) 和磷脂酰肌醇 3-激酶/丝氨酸-苏氨酸激酶 Akt (PI3K/Akt) 通路（与神经营养因子和细胞因子诱导的通路相同）[23]。因此，6MP-AuNPs-RDP的嘌呤可能有助于细胞增殖和神经突生长。

应该指出的是，SH-SY5Y 细胞对 6MP-AuNPs-RDP 表现出良好的耐受性。当颗粒处理的细胞接受颗粒的重复给药或从冷冻储存中恢复时，即使细胞在被颗粒包覆的表面上生长，它们仍然保持增殖活性，这表明 6MP-AuNPs-RDP 应该有潜力申请。

结论

在这里，我们建议用 6MP 和 RDP 修饰的 AuNPs 可以有效促进细胞增殖和神经突生长。由于纳米颗粒优异的生物相容性和生物安全性，它们是一种很有前途的生物材料，可用作神经元生长的神经纳米材料。

缩写

6MP：

6-巯基嘌呤

广告：

阿尔茨海默病

AuNPs：

金纳米粒子

DLS：

动态光散射

DMEM：

Dulbecco改良Eagle培养基

DMSO：

二甲亚砜

FCS：

胎牛血清

MTT：

3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑

PD：

帕金森病

RDP：

狂犬病毒衍生肽

TEM：

透射电子显微镜