激光辅助MAPLE沉积抗体功能化上转换纳米颗粒增强细胞培养性能

摘要

高性能细胞培养衬底依赖支持细胞功能和通讯的最佳表面。近期研究表明纳米结构涂层可增强细胞粘附，但传统溶液基方法常引入污染物。基质辅助脉冲激光蒸发（MAPLE）提供清洁、非破坏性路线将生物聚合物沉积到各种衬底。本研究通过单锅法合成NaGdF₄:Yb³⁺,Er³⁺上转换纳米颗粒（UCNPs）及其免疫球蛋白G（IgG）功能化对应物。UCNPs平均直径50±8 nm，TEM图像确认其表面存在IgG。利用532 nm Nd:YAG激光（10 Hz），通过MAPLE将带/不带IgG的UCNPs沉积玻璃底培养皿。随后播种人脐静脉内皮细胞（HUVECs）并与明胶包被玻璃对照比较。细胞活力测显示无细胞毒性，形态分析显示两种UCNP涂层表面粘附和增殖均改善。结果表明MAPLE沉积抗体功能化UCNPs可作为生物相容、高性能涂层用于细胞培养应用。

引言

上皮细胞衬于人体内外表面，在屏障功能、信号传导和免疫防御等生理过程中扮演物理屏障和活跃参与者双重角色[1]。组织工程中，细胞与衬底表面相互作用是决定细胞粘附、形态和功能的关键因素。传统蛋白涂层——胶原、明胶、纤连蛋白——长期用于增强玻璃或塑料表面细胞附着。近期进展显示纳米结构涂层可通过提供地形线索和增加有效表面积调控细胞行为，从而改善粘附和增殖[2-4]。

掺杂镧系离子（如NaGdF₄:Yb³⁺,Er³⁺）的上转换纳米颗粒（UCNPs）展现高效近红外（NIR）激发和可见或NIR发射，因低光毒性和高光稳定性在深层组织成像和生物传感中具有优势[5-9]。UCNPs表面功能化生物分子——亲和素、DNA、抗体——已实现靶向成像、传感和细胞标记[19-21]。然而，鲜有工作探索抗体功能化UCNPs作为细胞培养表面涂层。

传统沉积技术（溶胶-凝胶、旋涂、浸涂）存在厚度不可控、溶剂残留和生物分子变性风险。基质辅助脉冲激光蒸发（MAPLE）通过将目标材料包裹在冻结溶剂基质中规避这些问题；激光能量被基质吸收，导致材料温和转移至衬底而不直接烧蚀生物分子[24,25]。MAPLE已应用于药物递送、有机电子和生物医学涂层[31-35]，但其对细胞培养衬底影响仍未充分探索。

本工作报道NaGdF₄:Yb³⁺,Er³⁺ UCNPs及其IgG功能化类比物合成，随后MAPLE沉积至玻璃底培养皿。评估生物相容性及对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）行为影响，为未来组织工程应用奠基。

方法/实验

材料

所有试剂分析纯：Gd(NO₃)₃·6H₂O（99.9%）、Yb(NO₃)₃·5H₂O（99.9%）、Er(NO₃)₃·5H₂O（99.9%）、NaF（≥99%）、支链聚乙烯亚胺（PEI，Mw≈800）、抗人IgG（Fab特异性，FITC标记）、DAPI、Phalloidin-TRITC、溶剂（乙二醇、异丙醇）。材料购自Sigma-Aldrich、Fisher Scientific和Caledon。

一锅法合成UCNPs及UCNPs-IgG

UCNPs（NaGdF₄:Yb³⁺,Er³⁺）经改性水热路线合成。简述：三颈烧瓶中混合720 mg Gd(NO₃)₃·6H₂O、170 mg Er(NO₃)₃·5H₂O、160 mg Yb(NO₃)₃·5H₂O和20 mL乙二醇。加入0.7 g PEI，滴加溶于10 mL乙二醇中336 mg NaF。氮气保护下加热至200°C回流6小时。产物离心收集，乙醇和水洗涤，60°C干燥。

IgG功能化：15 mg UCNP粉末分散15 mL蒸馏水，加入5 mL硼酸缓冲盐水（pH 8）和20 μg IgG。室温搅拌2小时，离心洗涤沉淀。共轭物UCNPs-IgG贮于水性缓冲液中。

UCNPs和UCNPs-IgG一锅法合成示意图

MAPLE沉积UCNPs及UCNPs-IgG

MAPLE沉积使用MAPLE 2000系统（PVD Products, Inc.），532 nm Nd:YAG激光。纳米颗粒溶液（1 wt%异丙醇）在液氮冷却靶架中冻结。激光参数：10 Hz，200 μs脉宽，150 mJ/cm²能量密度，0.63 cm²光斑面积。预包被2 wt%明胶玻璃衬底距靶4.5 cm，25°C下1×10⁻⁶ Torr维持。靶架和衬底架分别以10 rpm和25 rpm旋转，沉积2小时。所得膜经EDX、FTIR和光致发光（PL）光谱表征。

UCNPs和UCNPs-IgG MAPLE沉积示意图

材料表征

沉积前UCNPs和UCNPs-IgG经透射电子显微镜（TEM，Philips CM-10，80 kV）检查。傅里叶变换红外光谱（FTIR）在Bruker Vector 22记录（600-4500 cm⁻¹，4 cm⁻¹分辨率，64扫描）。PL光谱用QuantaMaster 40分光荧光计（Horiba）测量。沉积后膜经EDX（Hitachi S-3400 N with INCA PentaFET-x3）和共聚焦显微镜（Zeiss LSM 5 Duo）检查。通过HUVECs培养24小时MTT实验评价细胞相容性。

细胞行为研究

HUVECs（ATCC）以~1×10⁵ cells/皿密度接种于玻璃衬底（对照明胶、UCNPs、UCNPs-IgG）。37°C孵育24小时后，4%甲醛固定，Phalloidin-TRITC（肌动蛋白）和DAPI（细胞核）染色，共聚焦显微镜成像。使用ImageJ量化细胞面积、连接长度、细胞长度和细胞计数。

细胞毒性实验

培养24小时后加入MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-四氮唑溴化物），孵育3小时，用Bio-Tek EL340I酶标仪490 nm测吸光度。三重复实验。

结果与讨论

MAPLE沉积前UCNPs和UCNPs-IgG表征

TEM图像确认UCNPs立方形貌，平均直径50±8 nm。高分辨TEM显示晶格间距0.312 nm，对应立方NaGdF₄（111）晶面（JCPDS 27-0697）。IgG共轭后颗粒尺寸增至54±8 nm，抗体层（~10±5 nm）可见为外周光晕（图3b）。

MAPLE沉积前TEM微观图：a UCNPs，b UCNPs-IgG

粉末XRD显示32°、37°、54°、65°特征峰（111、200、220、311），确认立方相（图4）。

NaGdF₄:Yb³⁺,Er³⁺上转换纳米颗粒XRD图谱

FTIR光谱显示PEI和IgG胺峰（1515、1511 cm⁻¹）、-CH₂-/C-C伸缩（2987、2900、1400 cm⁻¹）、羧基和酰胺带（1249、1650 cm⁻¹）确认IgG连接（图5）。

一锅法制备UCNPs-IgG和UCNPs的FTIR光谱

MAPLE沉积后UCNPs表征

UCNPs和UCNPs-IgG包被玻璃衬底EDX映射确认Gd、Er、Yb、F存在（图6a,b）。PL测量显示980 nm激发下保留绿光（540 nm）和红光（650 nm）发射，强度仅有微小变化，归因于表面缺陷或测量误差。

a MAPLE处理后样品EDX光谱，b 无MAPLE处理裸玻璃EDX光谱

包被表面FTIR进一步确认官能团保存：3648 cm⁻¹ -OH带（IgG）仅出现于UCNPs-IgG（图7a），1575 cm⁻¹胺带在UCNPs中明显（图7b）。裸玻璃无这些带（图7c）凸显纳米颗粒层成功沉积。

裸玻璃及包被UCNPs-IgG、UCNPs玻璃FTIR光谱

不同涂层上细胞行为

培养24小时后共聚焦图像显示所有表面细胞数相当，但UCNPs-IgG表面细胞铺展更大、胞质延伸更长、细胞间连接增加（图8）。定量分析显示UCNPs和UCNPs-IgG相对明胶对照细胞面积分别增加11.2%和22.2%；连接长度增加12.5%和17.5%；细胞长度增长8.2%和17.3%；纳米颗粒涂层表面细胞计数增加~8%（图9）。这些指标确认UCNPs和UCNPs-IgG增强内皮粘附和铺展且不诱导细胞毒性。

HUVECs在a对照、bUCNPs、cIgG修饰UCNPs上共聚焦微观图

不同涂层HUVECs培养：a细胞面积，b连接长度，c细胞长度，d细胞计数

涂层对细胞活力影响

MTT实验显示裸玻璃、UCNPs、UCNPs-IgG相对活力均>99%，超生物相容材料>85%基准。轻微活力增加（UCNPs 105%，UCNPs-IgG 104%）提示纳米颗粒涂层可能通过增强表面粗糙度和蛋白吸附产生轻微刺激作用。

HUVECs在裸玻璃、UCNPs、UCNPs-IgG和明胶对照上细胞活力

结论

我们证明NaGdF₄:Yb³⁺,Er³⁺ UCNPs及其IgG功能化对应物可通过单锅水热法合成，并经MAPLE沉积至玻璃培养皿，不损害结构和光致发光完整性。TEM、FTIR、XRD、EDX确认成功合成、共轭和沉积。生物相容性测显示无细胞毒性，共聚焦显微镜显示纳米颗粒涂层表面HUVECs粘附、铺展和细胞间网络增强。这些发现将MAPLE沉积抗体功能化UCNPs定位为先进组织工程和再生医学平台有前途的低污染涂层。

缩略语

DAPI:

4′,6-二脒基-2′-苯基吲哚二盐酸盐

EG:

乙二醇

HUVEC:

人脐静脉内皮细胞

IgG:

免疫球蛋白G

MAPLE:

基质辅助脉冲激光蒸发

PEI:

聚乙烯亚胺

Phalloidin-TRITC:

鬼笔环肽-四甲基罗丹明B异硫氰酸酯

UCNPs:

上转换纳米颗粒