伊卡里因负载mPEG纳米颗粒：增强对LPS诱导H9c2细胞心肌毒性的保护

摘要

淫羊藿苷（ICA），一种源自淫羊藿的黄酮醇苷，具有心脏保护、抗氧化和抗炎特性，但受限于水溶性差、清除快、口服生物利用度低。我们通过琥珀酸酐介导的酯化合成了亲水性聚乙二醇单甲醚（mPEG）共轭物（mPEG-ICA），随后透析法将游离ICA封装入聚合物形成ICA负载mPEG-ICA纳米颗粒（NPs）。傅里叶变换红外光谱（FT-IR）和质子核磁共振（¹H-NMR）证实共轭成功。动态光散射（DLS）显示平均流体动力学直径220±13.7 nm，ζ电位+2.30±1.33 mV；透射电镜（TEM）显示均匀球形形貌。pH 7.4磷酸盐缓冲液（PBS）中，纳米颗粒72 h释放52.8±1.7% ICA；pH 6.8下释放加速至48 h内75.7±0.2%。体外实验中，NPs维持H9c2细胞活力，减少乳酸脱氢酶（LDH）泄漏，抑制脂多糖（LPS）诱导的凋亡。促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA水平显著下调。结果表明ICA负载mPEG-ICA NPs为缓解LPS介导心肌损伤提供了有前景的纳米药物平台。

引言

心肌损伤后的心脏重构主要由持续炎症信号驱动，特别是TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18。这些细胞因子触发氧化应激、成纤维细胞激活和心肌细胞凋亡，最终损害心脏功能。淫羊藿苷（C₃₃H₄₀O₁₅）在临床前模型中被广泛报道具有免疫调节、抗氧化、抗凋亡作用，但其治疗潜力受疏水性、快速全身清除、口服吸收差限制。纳米载体系统——如胶束、脂质体、聚合物纳米颗粒——作为增强药物溶解度、延长循环时间、利用增强渗透和滞留（EPR）效应实现靶向递送至发炎心肌组织的有效策略应运而生。

聚乙二醇单甲醚（mPEG）相比线性PEG具有更优亲水性、生物相容性和低免疫原性。通过酯键共价连接ICA至mPEG-COOH，制造亲水-疏水两性分子，可自组装成纳米颗粒。酯键酸敏感，可在发炎心肌特有的微酸性微环境（pH≈6.8）响应释放ICA。本研究详述mPEG-ICA合成、ICA封装成纳米颗粒、理化表征、体外释放谱及对LPS诱导H9c2细胞损伤的心脏保护功效评价。

材料与方法

实验仪器

关键分析仪器包括：JA302电子天平、RE52CS-1旋转蒸发仪、78HW-1磁力搅拌器、101-OA鼓风干燥箱、NEXUS670 FT-IR光谱仪、UV-Vis分光光度计、TEM Glacios、JP-010S超声分散仪、实时qPCR系统、酶联荧光分析仪、奥林巴斯倒置显微镜、徕卡荧光显微镜、Thermo CO₂培养箱。

实验试剂

分析纯试剂来自商业供应商：淫羊藿苷（95%，1 g，DL070208）、LPS（55 mg，Sigma，Z06J9Y52452）、mPEG-Me（250 g，Sigma，MKBT7172）、二氯甲烷（500 mL，国药）、4-二甲氨基吡啶（100 g，阿拉丁）、N-羟基琥珀酰亚胺（100 g，瑞永）、FastKing cDNA合成试剂盒（天根）、碧云天凋亡试剂盒、SYBR Green qPCR试剂盒（QIAGEN）等。

mPEG-COOH合成

mPEG（5 g）、琥珀酸酐（0.40 g）、DMAP（0.50 g）在50 mL二氯甲烷中60°C回流反应2 h。蒸发浓缩，所得白色固体经透析（2 kDa截留分子量）对水透析48 h。冻干得mPEG-COOH。

mPEG-ICA聚合物合成

mPEG-COOH（0.37 g）经NHS（0.024 g）和DMAP（0.026 g）在10 mL无水DMSO中活化，再与溶于5 mL无水DMSO中的100 mg ICA在氮气保护下室温反应48 h。大量透析对水后冻干得mPEG-ICA聚合物。

ICA负载mPEG-ICA纳米颗粒制备

mPEG-ICA（5 mg）溶于2 mL DMSO，混合5 mg ICA（DMSO溶解），加入5 mL蒸馏水。室温搅拌15 min后，透析（3500 Da截留分子量）24 h并频繁换水，过滤得ICA负载mPEG-ICA NPs。

傅里叶变换红外光谱

样品与KBr混合压片，4000-4400 cm⁻¹扫描确认官能团转化。

核磁共振氢谱

样品溶于DMSO-d₶，500 MHz NMR分析确认酯化一致的化学位移。

UV-Vis光谱

以270 nm建立ICA标准曲线；用此曲线定量聚合物和纳米颗粒浓度。

ICA负载mPEG-ICA NPs表征

动态光散射检测

冻干后重分散于水，用Zetasizer 3000hs测粒径分布和ζ电位，每样品三次平行。

透射电镜形貌观察

1.0 mg/mL NP悬液滴加碳膜铜网，2%磷钨酸染色，80 kV成像。

稳定性测定

NPs加5%甘露醇冻干，重分散于水，监测粒径/PDI评估储存稳定性。

药物负载量与包封率测定

药物负载量（EE%）和包封效率（LC%）按UV-Vis吸光度计算：EE = NPs中药物质量 / NPs总质量 × 100%；LC = NPs中药物质量 / 初始药物质量 × 100%。

体外药物释放

NPs置于25 mL PBS（pH 7.4或6.8），37°C、100 rpm振荡。定时取样2 mL，补充等量新鲜培养基，270 nm UV-Vis分析。按标准方程计算累积释放%。

细胞实验

H9c2大鼠心肌母细胞培养于DMEM+10% FBS，37°C/5% CO₂。96孔板接种（10⁴ cells/孔）用于活力、LDH、凋亡、qPCR实验。

LPS或ICA纳米颗粒处理细胞

分五组：(1) 对照（无处理），(2) LPS（10 µg/mL）24 h，(3) ICA（20 µM）+ LPS，(4) mPEG-ICA聚合物（20 µM）+ LPS，(5) ICA负载mPEG-ICA NPs（20 µM）+ LPS。

MTT法

24 h处理后加0.5 mg/mL MTT孵育4 h。甲臜溶于DMSO，570 nm测吸光度。

乳酸脱氢酶（LDH）释放

商业试剂盒定量培养上清LDH活性，490 nm读吸光度。

Hoechst 33342染色

Hoechst 33342（1 µg/mL）染色15 min，荧光显微镜观察核形态。凋亡指数=凋亡核/总核×100%。

TUNEL实验

TUNEL试剂盒检测DNA断裂；绿色荧光凋亡核相对总DAPI染色核计数。

流式细胞术检测凋亡

Annexin V-FITC/PI双染色；流式细胞术定量早期和晚期凋亡群体。

逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）

TRIzol提取RNA，逆转录，Bio-Rad CFX96系统SYBR Green扩增。TNF-α、IL-1β、IL-6、actin（内参）基因表达以actin归一化。引物序列见原稿。

结果与讨论

FTIR和¹H NMR谱图

FT-IR显示1700和1740 cm⁻¹特征酯羰基吸收，确认共轭成功。¹H-NMR显示12.6 ppm酚羟基信号、7.5 ppm芳香质子、3.5 ppm PEG亚甲基质子，确认ICA和mPEG莫ieties共存。

粒径、Zeta电位和TEM

核心聚合物NPs平均145±15.2 nm（PDI=0.277），ICA负载NPs扩大至220±13.7 nm（PDI=0.119）。负载后Zeta电位从+0.44±0.26 mV升至+2.30±1.33 mV，表明胶体稳定性改善。TEM图像确认球形均匀形貌（图2）。

药物负载量与包封效率

UV-Vis分析得ICA负载NPs药物负载量21.9±0.013%，包封效率54.9±0.032%，优于仅聚合物NPs（负载量16.5%，EE=41.3%），符合预期治疗载量。

稳定性测定

加5%甘露醇冻干后重分散，粒径适度增至255 nm（PDI=0.326）但保持可接受均一性，确认储存稳定性（图3）。

mPEG-ICA-ICA体外药物释放

pH 7.4 PBS中，游离ICA 12 h释放77.2%，mPEG-ICA聚合物NPs 72 h释放44.1%。ICA负载NPs在中性pH 72 h释放52.8%，pH 6.8下48 h释放75.7%，体现pH响应加速释放（图4）。

H9c2细胞活力与LDH释放

MTT实验显示ICA、mPEG-ICA、ICA负载NPs在20 µM下无细胞毒性。LPS暴露后活力降至50.0%（对照=100%）。ICA、mPEG-ICA、ICA负载NPs处理分别恢复活力至55.9%、61.0%、65.4%（p<0.05）（图5、6）。

LDH实验显示LPS处理后酶泄漏显著上升；ICA、mPEG-ICA、ICA负载NPs显著降低LDH释放，ICA负载NPs效果最显著（图7）。

LPS诱导细胞凋亡

Hoechst 33342染色显示LPS处理组染色质浓缩碎片化；ICA负载NPs显著减弱凋亡形态（图8）。TUNEL定量：LPS诱导47.6%凋亡，ICA、mPEG-ICA、ICA负载NPs分别降至35.5%、26.5%、17.9%。流式细胞术佐证：LPS总凋亡35.9%，ICA负载NPs组16.7%，mPEG-ICA组19.2%（图9-10）。

LPS诱导H9c2细胞炎症因子mRNA表达

RT-qPCR显示LPS显著上调TNF-α、IL-1β、IL-6转录本。ICA、mPEG-ICA、ICA负载NPs处理均抑制这些细胞因子，ICA负载NPs下调最显著（图11）。

这些发现证实ICA负载mPEG-ICA NPs通过向发炎心肌递送ICA，减少氧化应激、凋亡和炎症因子产生，提供增强心脏保护。

结论

我们通过混合化学-物理方法成功制备ICA负载mPEG-ICA纳米颗粒，显著改善ICA溶解度、负载量和持续pH响应释放。在LPS挑战H9c2细胞中，这些NPs恢复细胞活力、减弱LDH泄漏、抑制凋亡、抑制促炎细胞因子表达，优于游离ICA或单独聚合物。数据支持ICA负载mPEG-ICA NPs作为治疗炎症性心肌损伤靶向纳米药物的潜力。