负载 ICA 的 mPEG-ICA 纳米颗粒的制备及其在治疗 LPS 诱导的 H9c2 细胞损伤中的应用

介绍

炎症反应参与了心室重构的整个病理过程,是心脏损伤后心脏病合理重构的主要原因[1, 2]。这些促炎细胞因子，包括肿瘤坏死因子 (TNF)-a、IL-1β、IL-6 和 IL-18，会导致心肌损伤和长期病理重塑 [3]。当心肌细胞受损时，它们还可以释放DAMPs（损伤相关分子模型），如HMGBI，激活内皮细胞表达趋化因子受体，产生炎症因子，诱导心肌细胞坏死或凋亡[4, 5]。此外，HMGB通过CXCL12/CXCR4促进炎症细胞，如巨噬细胞和中性粒细胞在受损心脏中的积累，加重心脏负担和损伤[5]。因此，阻断炎症反应的激活可作为减轻心脏病理重构的有效策略。

淫羊藿苷 (ICA C33H40O15) 是从淫羊藿中提取的脂质体化合物 [6]。大量研究表明，ICA 作为一种免疫调节剂、心脏保护剂、抗氧化剂、抗炎剂和抗细胞凋亡剂令人鼓舞 [7, 8]。尽管 ICA 具有积极的特性，但仍有多种因素限制了其应用，包括水溶性低、半衰期短和口服生物利用度低 [9]。纳米载体已成为增强靶向直接功效、抗炎和心脏保护的新策略；此外，纳米载体可以克服ICA的缺点[10, 11]。

最近，研究人员专注于药物输送系统 [12]。已经开发了各种纳米载体，例如胶束[13]、脂质体[14]和碳纳米管[15]。为了降低心血管疾病的死亡率和发病率，迫切需要设计一种载有足够ICA并具有靶向释放特性的新型纳米剂型。

为了克服 ICA 应用的局限性，我们使用聚乙二醇单甲醚 (mPEG) 作为载体 [16, 17]。 mPEG是聚乙二醇的衍生物，化学性质稳定，亲水性强于PEG[18]。然而，由于mPEG的末端羟基活性很小，mPEG作为载药纳米材料，必须进行羟基活化。因此，我们使用ICA作为疏水端，mPEG与琥珀酸酐酯化形成的羧基mPEG作为亲水端进行化学连接。形成的酯键在酸性条件下可加速裂解。

纳米颗粒在难溶性药物[19]、高分子药物[20]和基因治疗[21]的药物递送方面具有独特的优势。与肿瘤组织相似，心肌炎症部位具有相似的通透性和保留功能 (EPR) [22]。大小约为 200 nm 的纳米颗粒可以穿透间隙以实现药物富集 [23]。 mPEG-ICA NPs是在早期制备的，证实了它们在心肌缺血中的作用，但由于缺乏负载ICA，它们不能达到最佳效果[24]。因此，通过化学合成和物理包埋相结合制备的新型负载ICA的mPEG-ICA纳米颗粒，不仅可以提高ICA的水溶性和载药量，而且可以延长纳米制剂在心肌炎症中的缓释时间，有效改善ICA的缓释时间。药物的生物利用度，达到ICA靶向治疗LPS诱导的H9c2细胞损伤的最佳效果。我们研究了 ICA 在 pH 7.4 和 6.8 PBS 溶液中从负载 ICA 的 mPEG-ICA NPs 中的释放。此外，为了研究mPEG-ICA纳米粒对心肌炎症的影响，我们使用脂多糖（LPS）诱导H9C2细胞建立外部炎症模型，检测细胞活力、凋亡率和促炎细胞因子的mRNA表达，然后研究ICA负载mPEG-ICA纳米粒在心肌炎症过程中的药效学作用。

材料和方法

实验工具

使用以下：电子天平JA302（上海速展计量仪器有限公司）；旋转蒸发仪RE52CS-1（上海亚融生化仪器厂）；数显恒温磁力搅拌器78HW-1（杭州仪表电机有限公司）；电动鼓风干燥机101-OA（天津泰斯特仪器有限公司）；傅里叶变换红外光谱仪NEXUS670（Neliko Co., Ltd.）；紫外可见分光光度计（北京雷博特克仪器有限公司）；透射电子显微镜（TEM Glacios）；超声波分散萃取仪水浴振荡器JP-010S（中国捷盟有限公司）；实时荧光定量PCR仪；多功能酶标仪；倒置显微镜（奥林巴斯公司）荧光显微镜（徕卡，海德堡，德国）；二氧化碳细胞培养箱（Thermo公司）。

实验试剂

使用以下：试剂名称纯度/规格/生产批号（制造商）：淫羊藿苷（95%/1 g/DL070208 Sahn Chemical Technology Co., Ltd.）；脂多糖（型号 055-100 g/Z06J9Y52452 B5 25 mg Sigma Co., Ltd.）；聚乙二醇单甲醚（分析纯/250 g/MKBT7172 V，Sigma Co., Ltd.）；二氯甲烷（分析纯/500 mL/20171103 中药集团化学试剂有限公司）； 4-二甲氨基吡啶（分析纯/100 g/L170741 上海阿拉丁生化科技有限公司）； N-羟基琥珀酰亚胺（生物试剂/100克/RA328L758上海瑞永生物科技有限公司）； FastKing一步法去除基因组cDNA合成预混试剂盒第一链（天根生物科技有限公司）；细胞凋亡检测试剂盒（碧云天）； SYBR Green荧光定量试剂盒（QIAGENGmbH公司）。

mPEG-COOH的合成

称重 mPEG (5.00 g)、琥珀酸酐 (SA, 0.40 g) 和 4-二甲氨基吡啶（摩尔比 1:1.5/1.5, 0.50 g）并放入 250 mL 圆底烧瓶中。加入 50 毫升二氯甲烷，回流并在 60°C 下搅拌 2 小时。用旋转蒸发仪在35°C下蒸半天除去二氯甲烷，得到白色固体，在室温常压下保持半天，直至无乙醚残留。将粉末溶解在 50 mL 二次蒸馏水中，并在 2-kDa 透析袋中透析 48 小时，并不断更换水。除去溶解的SA，滤出不溶解的物质。将滤液冻干称重得到羧化mPEG(mPEG-COOH)。

mPEG-淫羊藿苷聚合物的合成

mPEG-COOH(0.37 g)，N 称取-羟基琥珀酰亚胺（0.024 g）和 4-二甲氨基吡啶（0.026 g）在 250 mL 圆底烧瓶中，然后加入 10 mL 脱水二甲亚砜（DMSO）作为溶剂，在室温下搅拌一半一天激活羧基。然后，将 100 mg 淫羊藿苷标准品放入小管中，加入 5 mL 已除去水的 DMSO，使标准品完全溶解。然后将标准样品加入圆底烧瓶中，在氮气保护下室温搅拌48小时。用二次蒸馏水连续透析后，标准样品不含 DMSO，我们使用 UV 确认去除了 DMSO。然后将透析液在真空冷冻干燥机中冷冻干燥48小时，得到淡黄色产物，即mPEG-ICA聚合物。

制备载有 ICA 的 mPEG-ICA 纳米粒子 (NPs)

在小管中称量 mPEG-ICA（5 毫克），溶解在 2 毫升 DMSO 中，然后在 37°C 的水中摇动 5 分钟。 5mg ICA溶解于适量DMSO中，放入小烧杯中，缓慢加入mPEG-ICA溶解于DMSO中，加入5mL蒸馏水。然后将溶液在磁力搅拌器上在室温下搅拌 15 分钟。然后，将反应物在3500透析袋中透析并在水中透析24小时，期间不断换水，将DMSO溶剂透析干净，过滤后得到负载ICA的mPEG-ICA纳米颗粒。

傅立叶变换红外光谱

将适量的标准 ICA、mPEG-COOH 和 mPEG-ICA 聚合物在玛瑙研钵中研磨成粉末，与适量的干燥 KBr 粉末混合并研磨成细粉。压片后，混合物在傅里叶红外光谱仪中扫描，扫描范围为 4000-4400 cm/mol ^-1 ，并记录其红外光谱。 ICA和mPEG-COOH用于材料表征，mPEG-ICA聚合物用于产品表征。

核磁共振氢谱

ICA、mPEG-COOH 和 mPEG-ICA 聚合物溶解在氘代二甲基亚砜 (DMSO-d6) 中并装入样品管中，样品管插入转子中。然后将样品置于500 MHz核磁共振谱仪上，设置采样参数。

紫外-可见光谱

将淫羊藿苷标准品 (4.0 毫克) 加入 25 毫升容量瓶中，加入甲醇至刻度，然后摇晃溶解直至澄清。然后，在 25 mL 容量瓶中准确测量 0.3 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL 和 2.5 mL 等分的淫羊藿苷标准溶液，并加入甲醇调节体积。然后在紫外分光光度计上以 270 nm（最大吸收波长）的波长测量溶液的吸光度值，甲醇作为空白对照。记录数据以生成线性回归。

在 25 mL 容量瓶中准确称量 mPEG-ICA 聚合物（4.3 mg），并添加甲醇至刻度。摇动溶液直至溶解并澄清。取2.0 mL 样品溶液准确称量3 次，溶解于25 mL 容量瓶中，甲醇定容。然后在紫外分光光度计上以270nm（最大吸收波长）的波长测量溶液的吸光度值，以甲醇为空白对照，记录3次数据，取平均值。然后计算淫羊藿苷的含量。

将上述方法制备的负载ICA的mPEG-ICA纳米粒子置于25mL容量瓶中，加入甲醇至刻度，摇晃烧瓶直至溶液溶解澄清。取2.0 mL 样品溶液准确称量3 次，溶解于25 mL 容量瓶中，甲醇定容。然后在紫外分光光度计上以270nm（最大吸收波长）的波长测量溶液的吸光度值，以甲醇为空白对照，记录3次数据，取平均值。收集数据计算负载ICA的mPEG-ICA纳米颗粒的平均ICA含量。

加载 ICA 的 mPEG-ICA NP 的表征

动态光散射检测

动态光散射粒度仪（DLS；zetasizer 3000hs，Malvern Instruments，Malvern，UK）用于测量负载 ICA 的 mPEG-ICA NP 的粒度分布和潜力。将新制备的 mPEG-ICA 和负载 ICA 的 mPEG-ICA NPs 冻干并重新分散在蒸馏水中，倒入比色杯中，然后放入动态光散射粒度分析仪样品池中进行检测。每个样品分析3次。

TEM 形态观察

将载有 ICA 的 mPEG-ICA NP（1.0 毫克/毫升）溶液滴在带有碳膜和滤纸的铜网上干燥。将网格置于干燥器中，并加入 2% (w/w) 磷钨酸并使其自然干燥 10 分钟。然后，通过透射电子显微镜观察了负载ICA的mPEG-ICA NPs在80 kV加速电压下的形态特征。

稳定性测量

将制备的载有 ICA 的 mPEG-ICA NPs 用 5% 甘露醇在真空冷冻干燥机中冷冻干燥 48 小时，然后将冻干的纳米颗粒重新溶解在双蒸水中以检测其粒径和 PDI 值的变化.

载药量和包封率的测定

在 10 mL 容量瓶中准确测量 1.8 mL ICA 负载的 mPEG-ICA NP 溶液，加入 0.2 mL DMSO，超声进行 2 分钟。在 270 nm 处测定溶液的吸光度，并使用具有相同溶剂的 mPEG-ICA 聚合物作为空白。将测定样品的吸光度代入标准曲线方程，计算淫羊藿苷含量。在DMSO/H2O =1/9溶剂体系中，在270 nm处测量淫羊藿苷的准曲线方程，计算纳米粒的载药量（EE%）和包封率（LC%）。

• 载药量（EE%） =纳米粒载药量/载药纳米粒总质量 × 100%

• 包封率(LC%) =纳米颗粒中的药物质量/剂量 × 100%。

药物体外释放

将 5 毫升游离 ICA、mPEG-ICA 聚合物和负载 ICA 的 mPEG-ICA NP 置于透析袋 (3500 kDa) 中，将其两端固定并在 25 mL PBS（释放介质）中在 37°C 下透析，并且100 rpm 超声波振动（pH =7.4）。在预定的时间段内（Tn，n =0, 0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 和 72 h)并用相同体积的新鲜溶液代替。进行紫外-可见分光光度法以确定透析液在不同时间在 270 nm 处的吸光度。如所述计算 ICA 释放的百分比，并测量三个样品以计算平均药物释放。透析液含量采用标准曲线法测定，体外释放试验重复3次。

药物释放公式为Q % =(C n × V + V n Σ ⁿ t =0 C 我 )/(WNP × LC%)，其中W是NP的重量，LC%是纳米颗粒的载药量，C n 是 Tn 时的样品浓度，V 是释放介质的总乘积 (25 mL)，Vn 是样品重量 (2 mL)，C 我 是 T 我 (i =0, 0.5, 1, ...., n h ,V 0 =C 0 =0).

mPEG-ICA-ICA NPs 在不同发布媒体中的发布

将两毫升负载 ICA 的 mPEG-ICA NP 溶液放入透析袋（4-88 kDa，分子量截止值）并放入 pH 7.4 和 pH 6.8 磷酸盐缓冲盐水（PBS 释放介质，37°C，25毫升）。然后，收集 2 mL 释放介质进行采样，并以预定间隔 (Tn, n =0、0.5、1、2、4、8、12、24 和 48 小时）。不同时间透析液在 270 nm 处的吸光度通过紫外-可见分光光度法测定。计算ICA释放的百分比，并测量三个样品以计算平均药物释放。

细胞测试实验

H9c2 (rat H9c2)，大鼠心室成肌细胞系，购自上海生化与细胞生物学研究所。将细胞在含有 10% 胎牛血清（Gibco，美国）的 DMEM 中在 37°C 下在含 CO2 的气氛中培养。 H9c2 细胞通常接种到 10 厘米的培养皿中 [25]。当细胞生长到大约 80% 时，将它们用 0.25% 胰蛋白酶 (Gibco) 进行继代培养。然后将细胞接种于相应的培养皿或96孔板中进行后续研究。

用 LPS 或 ICA 纳米颗粒处理细胞

H9c2细胞分为以下五组：（1）对照组：使用正常培养基，（2）LPS组：细胞用10mg/L LPS处理24小时； (3) ICA 组：细胞用 20 μmol/L ICA (1:1000, DMSO) 和 10 mg/L LPS 处理相同时间，(4) mPEG-ICA 聚合物组：细胞用 20 μmol /L mPEG-ICA 聚合物和 LPS 终浓度相同，持续时间相同； (5) ICA负载mPEG-ICA NPS组：细胞用20 μmol/L ICA负载mPEG-ICA NPs和10 mg/L LPS处理，其他条件同上组。

MTT

通过 MTT 确定 ICA 纳米颗粒对 LPS 诱导的心肌细胞损伤的细胞活力。简而言之，H9c2 细胞用 LPS 和不同的 ICA 纳米粒子处理 24 小时。之后，将细胞用终浓度为 0.5 mg/mL 的 MTT 在 37°C 下染色 4 小时，然后加入 150 μL 的二甲基亚砜 (DMSO) 以溶解甲状腺晶体。在酶标仪（*/SpectraMax i3 Molecular Devices，阿富汗）中在 570 nm 处测量光密度。

乳酸脱氢酶 (LDH) 释放

为了研究纳米 ICA 对 LPS 诱导的 H9c2 损伤的影响，我们评估了 LDH 在培养基中的释放。简言之，按照24小时的相应处理，收集培养基，按照LDH检测试剂盒（Beyotime Biotechnology）的方案进行LDH检测。最后，用光谱仪在 490 nm 处测量 OD 值。

Hoechst 33,258 染色

Hoechst 33,258 染色用于通过荧光显微镜观察核形态。处理后，H9c2 细胞用 PBS 洗涤两次，固定在 4% 多聚甲醛缓冲液（Fisher Scientific，匹兹堡，宾夕法尼亚州）中，用 PBS 冲洗并在 37°C 下用 Hoechst 33,258 染色 15 分钟 [26]。染色后，立即用荧光显微镜（Leica，Heidelberg，Germany）观察细胞核形态。凋亡指数 =凋亡核数/总核数 × 100%。

TUNEL（末端 dUTP 缺口末端标记）分析

对于H9c2细胞DNA完整性的检测，我们采用了TUNEL技术。 H9c2 细胞在 24 孔培养板中培养。处理后，用 PBS 洗涤 3 次，并用 4% 聚甲醛固定 30 分钟 [27]。然后，加入 1% Triton X-100 5 分钟以增加细胞膜通透性。然后用TUNEL一步检测试剂盒（Beyotime Biotechnology）按照说明书对细胞进行染色，荧光显微镜下观察细胞凋亡情况。各组细胞凋亡率以绿色荧光细胞核（TUNEL阳性）占总细胞核（蓝色）（细胞核经DAPI染色）的百分比表示[28]。

流式细胞术检测细胞凋亡

为了进一步研究不同ICA纳米颗粒对LPS诱导的细胞凋亡的影响，我们使用Annexin V-FITC/PI双染色法分析细胞凋亡率。如上所述进行 H9c2 处理后，收获细胞并重悬于 195 μL 结合缓冲液中，该缓冲液含有 10 μL 膜联蛋白 V-FITC 和 5 μL PI，然后在室温下避光孵育 15 分钟。在 4°C 下以 1500 rpm 离心 10 分钟后，吸出染色缓冲液，将细胞用 PBS 洗涤两次并重悬于 100 μL PBS 中。最后用流式细胞仪检测样品。

逆转录定量聚合酶链反应 (RT–qPCR)

RT-qPCR 用于检测炎症标志物的 mRNA 表达水平，包括 TNF-α、IL-1β 和 IL-6。 H9c2 细胞处理 24 小时后，如前所述使用 TRIzol 提取总 RNA，并使用 NanoDrop™ One/OneC 微型紫外-可见分光光度计（Thermo，ND-ONEC-W，美国）进行测量。使用 ExScript RT 试剂盒合成 cDNA，并在荧光定量 PCR 仪 (BIO-RAD CFX96 Touch*) 上使用 SYBR Green 试剂在以下条件下进行扩增：95°C 5 分钟，95°C 30 秒， 58°C 30 秒，共 28 个循环。本研究使用的引物如下：

Actin::

正向 5' GCTGTCCCTGTATGCCTCT-3';

反向 5'-TTGATGTCACGCACGATTT-3';

TNF-α::

正向 5′TCTATACCACTTCACAAGTCGGA-3′;

反向 5'-GAATTGCCATTGCACAACTCTTT-3';

IL-1β::

正向 5′GGATGACGACCTGCTA 3′;

反向 5'-CACTTTGTTGGCTTATGTTCTG3'

IL-6::

正向 5'TGCCTTCTTGGGACTGAT-3';

反向 5'-CTGGCTTTGTCTTTCTTGTTAT-3'。

将每个靶基因的量标准化为肌动蛋白基因的量。实验一式三份。

结果与讨论

FTIR 和 H ¹ 核磁共振谱

从mPEG-ICA光谱来看，两个酯键(-C=O-)的伸缩振动吸收峰在1700 ^-1 和 1740 ⁻¹ 厘米。与mPEG-COOH谱相比，在1650 cm ^-1 处有一个过量的C=C伸缩振动峰 ，表明ICA与mPEG-COOH酯化合成成功形成mPEG-ICA（图1）。

mPEG-ICA (A ), ICA (B ) 和 mPEG-COOH (C ）。 H ¹ mPEG-COOH和mPEG-ICA的NMR氢谱

从 mPEG-ICA 氢谱中，12.6 ppm 表明 ICA 酚羟基由于存在移动到低场的 –C=O 强吸收电子基团。大约 7.5 ppm 的苯环氢峰和 3.5 ppm 的峰面积非常大，判断为 mPEG 聚合物中的 -CH2-O- 氢峰。大量分析表明，烷基氢信号为 0–2 ppm。因此，可以得出结论，1.7 ppm 是 ICA 中的双键氢峰。 mPEG-COOH和ICA的特征峰出现在mPEG-ICA聚合物中，证明mPEG-COOH与ICA的合成成功（图1）。

粒径、zeta 电位和 TEM

mPEG-ICA纳米粒子的平均粒径约为（145.0 ± 15.2）nm，聚合物的分散指数（PDI）值为（0.277 ± 0.00）。载有 ICA 的 mPEG-ICA 纳米颗粒的粒径略有增加，约为 (220.0 ± 13.7) nm，PDI 为 (0.119 ± 0.00)。 PDI 越小，ICA 加载的 mPEG-ICA NPs 的分布越均匀。 mPEG-ICA纳米粒子的zeta电位为（0.439 ± 0.258）mV，ICA负载的mPEG-ICA纳米粒子的zeta电位为（2.30 ± 1.33）mV。透射电镜显示载有ICA的mPEG-ICA纳米颗粒呈球形，形态规则且尺寸相对均匀（图2）。

ICA负载mPEG-ICA纳米颗粒的粒径、zeta电位和TEM

载药和封装效率

ICA 负载的 mPEG-ICA NPs 中的 ICA 含量可以通过紫外分光光度法计算。建立ICA浓度标准曲线，根据标准曲线计算药物浓度，得到聚合物中ICA的含量。根据计算，基于mPEG-ICA聚合物吸光度（1.2397 ± 0.1024），ICA含量为（0.4132 ± 0.0359）mg/mL，负载ICA的mPEG-ICA纳米颗粒吸光度为（1.6289 ±9 ），ICA含量为（1.6289 ±9 ）。 ICA的含量为(0.5496 ± 0.3234)mg/mL。根据方法中的公式计算，mPEG-ICA聚合物的载药量为（16.5 ± 0.014）%，包封率为（41.3 ± 0.036）%；负载ICA的mPEG-ICA NPs的载药量为(21.9 ± 0.013)%，包封率为(54.9 ± 0.032)%（表1）。

稳定性判断

透析法制备的负载ICA的mPEG-ICA纳米颗粒粒径为（220.0 ± 13.7）nm，PDI为（0.119 ± 0.00）。在 5% 甘露醇中冷冻干燥 48 小时后，纳米颗粒可以重新溶解在水中以形成稳定的纳米颗粒。粒径为255 nm，PDI为（0.326 ± 0.00），略大于透析纳米粒子（图3）。

负载ICA的mPEG-ICA NPs的稳定性

mPEG-ICA-ICA 药物体外释放

在图 4 中，ICA 的释放很大程度上取决于释放介质的 pH 值。在 pH 7.4 的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 释放介质中，游离淫羊藿苷在 12 小时内释放 (77.21 ± 0.15)% 并完全释放。由于负载淫羊藿苷药物的mPEG-ICA NPs可以增加纳米颗粒的释放，因此mPE-ICA纳米颗粒的药物释放在72小时内释放到（44.08 ± 0.12）%，负载ICA的mPEG-ICA纳米颗粒达到（52.80 ± 1.70） %。将负载 ICA 的 mPEG-ICA 纳米颗粒置于 pH 6.8 的缓冲溶液中，我们发现纳米颗粒介导的药物释放在 48 小时内达到 (75.66 ± 0.17)%。这可能是因为一些负载 ICA 的 mPEG-ICA NPs 已解聚 NPs 或 mPEG-ICA 分子在 NPs 中断裂。这些观察结果表明，在 pH 6.8 的酸性条件下，ICA 的释放更为有利。也说明负载ICA的mPEG-ICA纳米粒子的释放特性有利于心肌炎性损伤的局部治疗，因为局部病变导致病灶呈弱酸性环境。

A 在 pH 7.4 的 PBS 中，ICA 负载的 mPEG-ICA NPs 的 ICA 释放。 B 在 pH 7.4 和 pH 6.8 的 PBS 中，37 °C 下负载 ICA 的 mPEG-ICA NPs 的 ICA 体外释放

H9C2 细胞活力和乳酸脱氢酶释放

首先，为了观察载有 ICA 的 mPEG-ICA 纳米粒子的细胞毒性，我们向 H9c2 细胞添加了游离药物（20 µM ICA）、mPEG-ICA NPs 和载有 ICA 的 mPEG-ICA NPs，MTT 结果显示没有明显的细胞毒性。纳米颗粒（图 5）。然后，我们进一步探讨了它们是否可以保护 H9c2 细胞免受 LPS 诱导的损伤（图 6）。 LPS 处理 24 小时后，细胞活力降低至 (50.0 ± 3.22)%（对照组 100%），其中用 ICA、mPEG-ICA NPs 和负载 ICA 的 mPEG-ICA NPs 处理显着增加了 H9c2 细胞的活力分别为 (55.94 ± 1.06)%、(60.97 ± 2.615)% 和 (65.36 ± 1.214)% (P <0.05).

Evaluation of the cytotoxicity of ICA nanoparticles on H9c2 cells. Data are expressed as the mean ± SEM of three separate experiments

Evaluation of the effects of ICA nanoparticles on LPS-induced H9c2 cell injury. Cell viability in different groups was measured by MTT assay. Data are the mean ± SME. (**P  < 0.01 vs. con; # P  < 0.05 and, ## P  < 0.01 vs. LPS; &P  < 0.05 vs. LPS + mPEG-ICA)

In addition, LDH levels are a marker of cell damage; therefore, we measured the release level of LDH in the culture medium (Fig. 7). LDH levels were increased in the LPS group compared with the normal culture group. Treatment with ICA, mPEG-ICA NPs or ICA-loaded mPEG-ICA NPs reduced the LDH level increase induced by LPS, especially in the ICA-loaded mPEG-ICA NP group. These results showed that ICA nanoparticles could protect cells from LPS.

The effect of ICA nanoparticles on the LDH level induced by LPS in H9c2 cells. Data are the mean ± SD. ***P  < 0.01 versus con; ##P  < 0.01 versus LPS treatment group; *&P  < 0.05 versus LPS + mPEG-ICA group

Cell apoptosis induced by LPS

First, nuclear morphology was detected by Hoechst 33,258 staining (Fig. 8). Nuclear chromatin exhibited condensation, breakage and fragmentation after LPS damage in the LPS group. However, for ICA-loaded mPEG-ICA NP group, the number of apoptotic cells obviously decreased. Moreover, we used TUNEL staining to observe cellular DNA breaks or DNA damage (Fig. 9). The number of apoptotic nuclei in the LPS-induced group was (47.57 ± 3.41)% (P  ˂ 0.0001) compared to (6.47 ± 1.87)% in the normal culture group. After treatment with ICA-loaded mPEG-ICA NPs, mPEG-ICA NPs and ICA, the apoptosis rates decreased to (17.92 ± 3.12)% and (26.54 ± 3.68)% and (35.49 ± 4.25)%, respectively, and ICA-loaded mPEG-ICA NPs significantly reduced the apoptosis rate compared with mPEG-ICA NPs. In addition, flow cytometric analysis in LPS-induced H9c2 cells showed that (35.93 ± 2.23)% of the cells were in the early and late apoptotic stages (Fig. 10). After treatment with ICA-loaded mPEG-ICA NPs or mPEG-ICA NPs, the total apoptotic rates were reduced to (16.70 ± 2.77)% and (19.15 ± 3.67)%, respectively. These results were in line with the Hoechst 33,258 staining and TUNEL staining findings and indicated that ICA-loaded mPEG-ICA NPs largely prevented the cells from undergoing apoptosis.

Detection of apoptosis by Hoechst 33,258 staining. A Nuclear morphology in cells stained with Hoechst 33,258. B Quantitative analysis of the apoptosis rate by Hoechst 33,258 staining. Data are the mean ± SEM (***P  < 0.005 vs. con; #P  < 0.05 vs. LPS; &P  < 0.05 vs. LPS + mPEG-ICA)

Detection of apoptosis by TUNEL. A Cells with TUNEL and DAPI staining; B apoptosis rate. Data are the mean ± SEM (****P  < 0.0001 vs. con; ###P  < 0.005 vs. LPS; &&P  < 0.01 vs. LPS + mPEG-ICA)

A . Apoptotic rate detected by flow cytometry. H9c2 cells were stained by Annexin V/PI double staining. Q1-LL cells were Annexin V/PI double-negative stained, indicating viable cells; Q1-LR cells were Annexin V-positive and PI-negative stained, indicating early apoptosis; Q1-UR cells were Annexin V/PI double-positive stained, indicating late apoptosis. B . Apoptotic rate (%). Data are the mean ± SME. (***P  < 0.005 vs. con; #P  < 0.05 and ##P < 0.01 vs. LPS; &P  < 0.05 vs. LPS + mPEG-ICA)

Inflammatory cytokine mRNA in LPS-induced H9c2 cells

Next, we evaluated the effect of ICA-loaded mPEG-ICA NPs on the mRNA expression of TNF-α, IL-1β and IL-6 in LPS-induced H9c2 cells. After LPS treatment for 24 h in H9c2 cells, the mRNA levels of TNF-α, IL-1β and IL-6 were increased. These increases were attenuated by ICA-loaded mPEG-ICA NPs, mPEG-ICA NPs and ICA treatment, and ICA-loaded mPEG-ICA NPs treatment markedly lowed TNF-α, IL-1β and IL-6 mRNA expression (Fig. 11).

Effects of ICA-loaded mPEG-ICA NPs on the mRNA expression levels of IL-1β, TNF-α and IL-6 in LPS-induced H9c2 cells. Effects of ICA-loaded mPEG-ICA NPs on the mRNA IL-1β in the LPS induced H9c2 cells. (**P  < 0.01 compared with con; #P  < 0.05 compared with LPS; &P  < 0.05 compared with LPS + mPEG-ICA.) (2) Effects of ICA-loaded mPEG-ICA NPs on the mRNA TNF-α. (***P  < 0.005 vs. con; #P  < 0.05 vs. LPS group; &P  < 0.05 vs. LPS + mPEG-ICA) (3) Effects of ICA-loaded mPEG-ICA NPs on mRNA IL-6. Data are the mean ± SEM (* P  < 0.05 vs. con; #P  < 0.05 vs. LPS; &P  < 0.05 vs. LPS + mPEG-ICA)

In this study, we analyzed the suitability of polymer nanoparticles to load ICA for the treatment of LPS-induced H9c2 cell damage. The synthesis method is highly feasible and has many advantages. First, mPEG is nontoxic and has good biocompatibility [29]. In this study, a chemical bonding method was used to assemble mPEG and ICA into an mPEG-ICA polymer, and then dialysis was used to physically wrap the ICA and form stable nanoparticles [30]. Nanoparticles can significantly improve the water solubility of ICA and can realize the long circulation of nanoparticles in the body [31, 32]. Compared with mPEG-ICA nanoparticles, ICA-loaded mPEG-ICA nanoparticles have many significant advantages. First, their PDI value is smaller, which proves that the particle size distribution is more uniform [33]. Second, the drug loading and encapsulation efficiencies of ICA-loaded mPEG-ICA NPs are both higher than those of mPEG-ICA NPs, making it easier to reach the effective drug concentration of ICA [34]. In a pH 6.8 solution, nanoparticles release more drugs, and an acidic environment may destroy the self-assembly force of nanoparticles and accelerate the cleavage of ester bonds, resulting in faster release of the drug into the medium and effective enrichment of the drug in the inflammation site [35, 36].黄等人。 used LPS-induced osteoblasts to validate the model to explore the anti-inflammatory mechanism of Icariin. They found that Icariin can significantly upregulate the expression of BMP-2 and Runx2 in LPS-induced osteoblasts, thereby achieving effective therapeutic effects [37]. A study has shown that ICA can inhibit the inflammatory response of chondrocytes induced by LPS and reduce collagen formation [38]. In addition, ICA can also inhibit the caspase-1 signaling pathway mediated by the NLRP3 inflammasome and reduce LPS-induced sagging [39]. However, LPS-induced cells cannot effectively absorb ICA. Making ICA nanoparticles can solve this problem well. It may be that ICA is loaded by nanocarriers, greatly increasing its water solubility and allowing it to enter cells through free diffusion. At the same time, studies have shown that nanoparticles can promote cell endocytosis and tissue cell efflux and significantly improve the bioavailability of ICA [40, 41].

The results of the MTT assay and lactate dehydrogenase release experiments showed that ICA-loaded mPEG-ICA NPs could effectively alleviate the cell damage induced by LPS, and ICA-loaded mPEG-ICA NPs could release ICA from the particles. Furthermore, compared with the mPEG-ICA NPs, ICA-loaded mPEG-ICA NPs could load more ICA and release more easily. We also found that these nanoparticles markedly decreased apoptosis induced by LPS to alleviate the inflammatory response in H9c2 cells. Moreover, the antiapoptotic effect of ICA-loaded mPEG-ICA NPs was better than that of mPEG-ICA NPs and ICA. These results indicated that ICA nanoparticles could protect cardiomyocytes from inflammatory injury.

Inflammatory cytokines are the key factors involved in the development and progression of cardiovascular disease and are markers of the inflammatory response [42, 43]. Some researchers have found that TNF-α, IL-1β and IL-6 were closely related to cardiac function. The addition of these inflammatory cytokines to isolated cardiomyocytes resulted in abnormalities in cardiac function and promoted cardiomyocyte loss [44]. Our RT–qPCR results showed that ICA-loaded mPEG-ICA NPs could significantly inhibit the mRNA expression of TNF-α, IL-1β and IL-6. Therefore, these results implied that the protective effects of ICA-loaded mPEG-ICA NPs may occur through controlling inflammatory cytokines.

Conclusion

ICA-loaded mPEG-ICA NPs are a new type of nanomedicine successfully synthesized through nanotechnology (a combination of chemical synthesis and physical embedding). This process not only converts the hydrophobic drug ICA into water-soluble nanomedicine but also successfully improves the load capacity of ICA. In the weakly acidic solution, the ICA release from ICA-loaded mPEG-ICA NPs was greater than that of the neutral solution, indicating that nanoparticles are meaningful for the treatment of inflammatory cardiovascular diseases. Treatment with ICA nanoparticles effectively protected against LPS-induced H9c2 damage, promoted cell viability and inhibited cell apoptosis. Further experiments demonstrated that the new ICA-loaded mPEG-ICA NPs could release inflammatory cytokine production.

数据和材料的可用性

Not applicable.

缩写

mPEG:

Polyethylene glycol monomethyl ether

ICA:

Icariin

FT-IR:

Fourier transform infrared spectroscopy

NMR:

Nuclear magnetic resonance spectroscopy

DLS:

Dynamic light scattering

TEM:

Transmission electron microscope

TNF:

Tumor necrosis factor

EPRs:

Permeability and retention functions

SA:

Succinic anhydride

DMSO:

Dehydrated dimethyl sulfoxide