基于二硫化锡纳米片的唾液电化学皮质醇生物传感器

介绍

皮质醇是一种类固醇激素，由下丘脑-垂体-肾上腺 (HPA) 系统分泌。它是众所周知的心理压力生物标志物，因此被称为“压力荷尔蒙”[1, 2]。皮质醇水平在 24 小时周期内遵循昼夜节律；清晨观察到的水平最高，到晚上水平逐渐降低 [3,4,5,6]。皮质醇水平过高会导致库欣病，出现向心性肥胖、紫纹和近端肌肉无力的症状。然而，皮质醇水平降低会导致艾迪生病，表现为慢性疲劳、不适、厌食、体位性低血压和低血糖 [7,8,9]。因此，维持适当的皮质醇平衡对人体健康至关重要。

人们对皮质醇测量作为医学和心理相关事件的前兆越来越感兴趣，其中最近的痛苦是创伤后应激障碍 (PTSD)。 PTSD 中异常的 HPA 轴功能的重要性是无可争辩的；因此，传统的评估方法仍然能够提供丰富的证据和信息[10,11,12,13,14]。最近，许多研究报告了皮质醇检测的重要性，并确定了与不同疾病的相关性 [15,16,17,18]。各种研究证实皮质醇与自闭症谱系障碍[19]、抑郁症[20]、自杀意念[21]、童年逆境和外化障碍[22]有关。

虽然确定皮质醇水平是一种重要的诊断工具，但常规实验室皮质醇检测技术如色谱法 [23, 24]、放射免疫测定 [25]、电化学发光免疫测定 [26,27,28]、酶联免疫吸附测定 [28, 29] ]、表面等离子体共振 [1, 30, 31] 和石英晶体微天平 [32] 需要大量的分析时间，价格昂贵，并且无法在即时 (POC) 设置中实施 [33]。因此，目前需要灵敏、高效、实时地测定皮质醇水平。

近年来，建立在抗原和抗体之间特异性分子识别基础上的电化学免疫分析方法由于其显着特点而成为一种很有前途的技术，例如涉及设备简单、分析快速、成本低、无标记POC检测、生物流体中皮质醇的高灵敏度和低检测阈值 [34, 35]。电势变化归因于电极处电化学氧化还原反应浓度的变化。分泌的皮质醇最终进入循环系统，可以在各种生物体液中找到，例如间质液 [36]、血液 [37]、尿液 [38]、汗液 [39] 和唾液 [40]。唾液皮质醇电化学检测是一种非侵入性方法，样品收集、处理和储存方便，其优势增强了其在 POC 传感器实时测量中的应用潜力[41]。

理想的生物传感器应具有低检测限、快速选择性和高灵敏度。为了制造免疫传感器，所选择的固定基质应具有高表面功能性、高生物分子负载和低电子传输阻力，以及高电子传输速率 [42]。然而，很少有人建议将金属硫化物纳米材料用于电化学生物传感的蛋白质固定。因此，这里选择二硫化锡作为潜在的固定基质用于免疫传感器的开发，以检测唾液中的皮质醇。

纳米二维 (2D) 材料在最近十年引起了广泛的研究兴趣。二维材料种类繁多，从半导体到金属，从无机到有机 [43,44,45,46] 和相关的复合材料 [47,48,49,50]。纳米二维材料的发现、制造和研究是各个领域的主流。纳米二维二硫化锡 (SnS2) 是一种带隙为 2.18–2.44 eV [51, 52] 的 n 型半导体，由夹在两层六边形排列且紧密排列的硫 (S) 原子之间的 Sn 原子组成，相邻的 S由弱范德华力连接的层 [53]。由于其迷人的电学性质、高载流子迁移率、良好的化学稳定性、低成本和光学性质 [54]，SnS2 已发展成为太阳能电池和光电器件中各种应用的有前途的材料 [55, 56]，作为电极锂离子电池 [57, 58]、气体传感器和葡萄糖监测仪 [59, 60]。电极材料的选择是提高性能的重要关键因素，它提供了大的反应面积和有利的微环境以促进酶与电极表面之间的电子转移。

在这项工作中，使用 SnS2 作为固定基质来制造生物传感器来检测皮质醇。与电化学传感相关的差分脉冲伏安法 (DPV) 研究结果表明，其灵敏度高达 0.0103 mA/Mcm ² 最低检测浓度为100 pM。

材料和方法

材料

氢化可的松（皮质醇）、抗兔皮质醇抗体（抗皮质醇，C-Mab）、六氰基铁酸钾（II）、六氰基铁酸钾（III）、β-雌二醇、睾酮、孕酮和皮质酮购自Sigma-Aldrich（St .路易斯，密苏里州，美国）。牛血清白蛋白 (BSA) 购自 PanReac。五水氯化锡 (IV) (SnCl4 ^. 5H2O) 和硫代乙酰胺 (C2H5NS) 由 Showa（日本）和 Alfa Aesar（英国）提供。用 NaCl、KCl、Na2HPO4 和 KH2PO4 制备的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 购自 Sigma-Aldrich。微抛光氧化铝来自 Buehler（英国）。所有其他化学品均为分析级，无需进一步纯化即可使用。皮质醇唾液ELISA试剂盒（货号SA E-6000）购自LDN（德国）。

二硫化锡的合成

将 SnCl4·5H2O 和 C2H5NS 粉末混合在 70 mL 去离子水中并将 pH 值调整为 7.4。将含有反应物的水热高压釜反应器从室温加热到 200 ^° C 1 h，并保持在 200 ^° C 11 小时。然后，将得到的 SnS2 粉末用去离子水和乙醇以 6000 rpm 的速度洗涤 15 分钟，最后在 80 ^° 空气中干燥 C. 该水热法成功应用于SnS2的合成。

材料表征

X 射线衍射（XRD，PANalytical，荷兰）用于研究二维六方 SnS2 薄片的晶相。多功能场发射扫描电子显微镜（FE-SEM，Zeiss，德国）用于对材料的表面形貌进行成像。采用场发射枪透射电子显微镜（FEG-TEM，Tecnai，USA）观察SnS2的微观结构，采用选区衍射（SAED，Tecnai）获得晶体图案。

BSA/C-Mab/SnS2/GCE 生物传感器的制造

首先用氧化铝浆料抛光玻璃碳电极（GCE），然后将 5 M SnS2 混合物滴在预处理的 GCE 表面上。在 PBS 中制备抗皮质醇抗体 (1 mg/mL) 和 BSA (1%) 的溶液。然后依次用抗体和 BSA 溶液装饰 SnS2/GCE。制备的 BSA/C-Mab/SnS2/GCE 生物传感器在 4 ^° 的冷藏条件下储存 C 不使用时。检测系统的研究思路和设置如图1所示。

检测系统的研究理念与设置

电化学分析

使用电化学阻抗谱 (EIS) 和循环伏安法 (CV) 对制造的 BSA/C-Mab/SnS2/GCE 进行表征，以比较它们的电活性行为。使用 CV 和差分脉冲伏安法 (DPV) 进行作为皮质醇浓度函数的电化学反应研究。所有实验均使用三电极系统进行，其中 GCE 作为工作电极，Pt 线作为辅助电极，饱和甘汞电极作为参比电极，在含有 5 mM Fe(CN) 的 10 mM PBS (pH 7.4) 中进行)6 ^3-/4- .电化学测量在 CHI6114E 型系列电化学工作站（CH Instruments，USA）上进行。除非另有说明，否则 CV 和 DPV 测量在 - 0.4 V 和 1.0 V 之间以 10 mV/s 扫描速率进行。

唾液样本采集和电化学传感

在中午左右从两名健康的自愿受试者收集唾液样本 (2 mL) 以验证开发的 BSA/C-Mab/SnS2/GCE。唾液样品在未经任何过滤的情况下获得，最初储存在 - 20 °C 以保持生物学特性。感测前，唾液样品解冻至室温，3500rpm离心15分钟，收集上清液进行测定。分离的唾液储存在- 20°C。 BSA/C-Mab/SnS2/GCE 用于唾液样品中皮质醇浓度的电化学传感。将BSA/C-Mab/SnS2/GCE电化学检测皮质醇与上述市售ELISA皮质醇试剂盒进行比较。

干扰研究

通过将生物传感器置于以下不同溶液中，研究了潜在混杂剂（例如其他类固醇激素）对 BSA/C-Mab/SnS2/GCE 特异性的抑制作用：100 nM β-雌二醇、100 nM 睾酮、100 nM 孕酮和 100 nM 皮质酮，10 分钟，然后通过 CV 扫描。扫描速率为10 mV/s，扫描范围为- 0.4 V至0.6 V。

ELISA 检测唾液皮质醇

根据制造商的方案对唾液样品进行 ELISA。为了建立皮质醇测量的校准曲线，在含有六种已知标准皮质醇浓度（0.0、0.1、0.4、1.7、7.0 和 30 ng/mL）的 96 孔滴定板中进行测定，以确定每个孔的吸光度在 450 纳米。校准曲线与趋势线拟合，得到未知样品的计算方程。

结果与讨论

SnS2的材料分析

从图 2a 中的 XRD 图案可以看出，合成产物仅显示对应于六方相 SnS2（JCPDS 卡号 89-2358）的 XRD 峰。图 2b、c 说明了合成后的 SnS2 的 FE-SEM 图像，具有均匀的薄片状形态，尺寸约为 300 nm。图 2d-f 显示了 SnS2 的 FEG-TEM 和 SAED 图像，其中六方 SnS2 的晶格条纹间距为 0.167 nm 和 0.316 nm，为单晶结构。纳米薄片的堆叠小于10层，总厚度小于10 nm。

一 SnS2 的 XRD 图。 SnS2 纳米薄片的 FE-SEM 图像是在 (b ) × 250,000 和 (c ) × 100,000。 d SnS2 纳米薄片的 FEG-TEM 图像。 e SnS2 纳米薄片的横截面 FEG-TEM 和放大的 FEG-TEM 图像。 f SnS2纳米薄片的SAED图像

电极的电化学响应

添加二硫化锡可以大大提高氧化电流。如图 3a、b 所示，随着电荷转移电阻值的增加，氧化电流的大小从 SnS2/GCE 减少到 C-Mab/SnS2/GCE，然后是 BSA/C-Mab/SnS2/GCE。因此，结果表明传感器特性在电极上发生了改变。最初，通过将扫描速率从 10 mV/s 改变到 100 mV/s 来研究 BSA/C-Mab/SnS2/GCE，如图 3c 所示。电流响应随扫描速率的变化，如图 3d 所示，表明氧化电流随扫描速率线性增加，并遵循以下关系：I =0.5156 υ–0.0319 (R ² =0.9985) 在氧化过程中，I =0.6758υ–0.0288 (R ² =0.9997) 减少。然而，随着扫描速率的增加，峰值电流的增量接近线性，具有明确的氧化还原峰，表明是表面控制的过程，具有稳定的电子转移。

一 GCE 电极（曲线 a）、SnS2/GCE 电极（曲线 b）、C-Mab/SnS2/GCE 电极（曲线 c）、BSA/C-Mab/SnS2/GCE 电极（曲线 d）的 CV 响应研究。 b GCE、SnS2/GCE、C-Mab/SnS2/GCE 和 BSA/C-Mab/SnS2/GCE 电极的 EIS 响应研究。插图：对应的等效电路。 c BSA/C-Mab/SnS2/GCE 电极的氧化响应电流幅度增加，扫描速率从 10 mV/s 增加到 100 mV/s。 d 电流幅度随着扫描速率的增加而增加。 e BSA/C-Mab/SnS2/GCE 电极的 CV 研究作为皮质醇浓度从 100 pM 到 100 μM 变化的函数。 f 具有不同皮质醇浓度的电流响应的线性曲线。 g BSA/C-Mab/SnS2/GCE 电极的 DPV 研究作为皮质醇浓度从 100 pM 到 100 μM 变化的函数。 h 不同皮质醇浓度电流响应的线性曲线

在 100 pM 到 100 μM 的范围内，电流随着皮质醇浓度的增加而降低。电流的差异与感知到的皮质醇浓度直接相关。对于 BSA/C-Mab/SnS2/GCE 电极，获得了电流值和分离良好的氧化峰，如图 3e、f 所示。电流随浓度对数的变化几乎是线性的。很明显，线性回归系数的降低对 CV 更好。因此，使用更具体和准确的 DPV 进行了进一步的测量。这种 DPV 研究的结果表明，电流响应的幅度随着皮质醇的加入而降低，如图 3g 所示。图 3h 中显示的校准曲线绘制了电流响应的幅度和皮质醇浓度的对数，发现线性相关并遵循以下方程：y =− 0.0103x + 0.0443； R ² =0.9979。该传感器的检测范围在 100 pM 到 100 μM 之间，检测限为 100 pM，灵敏度为 0.0103 mA/Mcm ² (R ² =0.9979）。

存储稳定性研究

还进行了 CV 研究，以 1 天至 1 周的间隔研究 BSA/C-Mab/SnS2/GCE 的保质期。为了比较两种保存条件，一种条件是将电极在真空下干燥保存，而另一种条件是将电极保存在 4°C。电极在 4°C 和真空下的氧化还原峰稳定性分别如图 4a、c 所示。可见，4℃保存条件优于真空保存。图 4b、d 显示，电极在真空下储存 7 天时的电极稳定性值为 82%，而电极在 4°C 下储存时的电极稳定性值为 91%。可以观察到，电极在 4°C 下的稳定性高于真空下的稳定性。电极活性的丧失可能是由真空下皮质醇抗体活性的降解引起的。储存稳定性是酶传感器的关键问题。未来的电极设计中可能会引入保护涂层。

不同保存条件下BSA/C-Mab/SnS2/GCE电极的氧化还原峰稳定性(a 和 b ) 在真空下 (c 和 d ) 4 °C 7 天

干扰研究

BSA/C-Mab/SnS2/GCE 的 CV 研究结果用于测量潜在的混杂因素，例如 β-雌二醇 (100 nM)、睾酮 (100 nM)、孕酮 (100 nM) 和皮质酮 (100 nM) 与皮质醇 (10 nM)，如图 5a 所示。与皮质醇信号响应的变化相比，干扰的影响不到皮质醇结果的5%，表明这种潜在的干扰可以方便地忽略。

一 涉及 β-雌二醇 (100 nM)、睾酮 (100 nM)、孕酮 (100 nM) 和皮质酮 (100 nM) 对皮质醇 (1 0 nM) 的干扰研究。 b ELISA法与电化学法测定唾液皮质醇的比较

使用ELISA和电化学方法检测唾液皮质醇

用 ELISA 和 BSA/C-Mab/SnS2/GCE 电极对唾液皮质醇样品进行的测量总结在表 1 和图 5b 中。 ELISA测定的皮质醇浓度为1.105×10 ^-8 M 和 3.998 × 10 ⁻⁹ M. 电化学测量皮质醇的计算结果为1.046 × 10 ^-8 M 和 3.911 × 10 ⁻⁹ M. 这两种技术实现了良好的相关性，显示出可比较的结果，只有 2-5% 的差异。因此，结果表明该BSA/C-Mab/SnS2/GCE可用于唾液等生物相关液体中的电化学皮质醇传感。

与其他研究的比较

本研究的结果与文献中报道的涉及唾液皮质醇电化学传感器的其他研究进行了比较，以便更好地了解这种 BSA/C-Mab/SnS2/GCE 的性能。表 2 和表 3 显示了在皮质醇检测中使用非金电极获得的结果的比较。目前的工作有三个主要优点。首先，这些材料的成本远低于其他研究中提出的设备。其次，制备过程相对简单快速。最后，检测限与其他文献报道的相似，甚至比报道的更好，而唾液皮质醇的目标检测范围很容易获得。

结论

水热法已成功应用于合成 SnS2。通过XRD、FE-SEM、FEG-TEM和SAED表征了SnS2的性质。使用 CV 和 DPV 确定电极的电化学响应作为皮质醇浓度的函数。我们的皮质醇传感器的检测范围为 100 pM 至 100 μM，检测限为 100 pM，灵敏度为 0.0103 mA/Mcm ² (R ² =0.9979）。获得的传感参数在正常生理范围内。潜在干扰的影响小于5%，表明该传感器具有良好的特异性。稳定性测试表明，传感器在 4°C 下的活性优于真空下。该电极用于测量唾液样品中皮质醇的结果与ELISA一致。因此，使用这种BSA/C-Mab/SnS2/GCE电极进行电化学分析可以取代更传统的耗时的免疫分析方法。

数据和材料的可用性

本研究期间生成或分析的所有数据均包含在这篇已发表的文章中。

缩写

二维：

二维

BSA：

牛血清白蛋白

C-Mab :

皮质醇抗体

简历：

循环伏安法

DPV：

微分脉冲伏安法

EIS：

电化学阻抗谱

ELISA：

酶联免疫吸附试验

FEG-TEM：

场发射枪透射电子显微镜

FE-SEM：

场发射扫描电子显微镜

GCE：

玻碳电极

HPA：

下丘脑-垂体-肾上腺

PBS：

磷酸盐缓冲盐水

POC：

护理点

创伤后应激障碍：

创伤后应激障碍

SAED：

选区衍射

XRD：

X射线衍射