基于丙烯酸-金纳米复合物的超灵敏电化学 DNA 生物传感器实现龙鱼性别快速鉴定

摘要

本研究建立了一种超灵敏电化学 DNA 生物传感器，可在阿托摩尔级检测限下鉴定亚洲龙鱼（Scleropages formosus）性别。传感器采用接枝琥珀酰亚胺基的丙烯酸微球与胶体金纳米颗粒（AcMP-AuNP）固定于碳丝网印刷电极上。氨基修饰 DNA 探针共价锚定于 AcMPs，靶标龙鱼 DNA 杂交通过蒽醌磺酸（AQMS）氧化还原标记，利用差分脉冲伏安法（DPV）定量。优化条件下，检测限达 1.0×10⁻¹⁸ M，线性范围 1.0×10⁻¹⁸ – 1.0×10⁻⁸ M (R²=0.99)，检测时间 <1 小时，是一种轻量、低成本的现场养殖诊断工具。

背景

亚洲龙鱼是珍贵观赏鱼，在东南亚和大洋洲部分地区具有文化意义。因市场需求大，野生种群遭过度捕捞，被 CITES 和 IUCN 列为濒危。幼鱼期准确性别鉴定对育种和市场监管至关重要，但传统外观法不可靠耗时，常规 PCR 繁琐且需精密实验室设备。纳米材料生物传感器近期提供新选择。整合丙烯酸聚合物微球与金纳米颗粒，可构建高比表面积、导电平台，增强探针负载和电子传递，提高灵敏度并缩短检测时间。

方法

仪器与电极

Autolab PGSTAT 12 电化学工作站进行 DPV 测量，使用 AcMPs 和 AuNPs 修饰的碳丝网印刷电极 (SPE)。铂辅助电极和 Ag/AgCl 参比电极 (3.0 M KCl)。Elma S30H 超声浴确保溶液均匀。

试剂

关键试剂：2,2-二甲氧基-2-苯基乙酰苯酮 (DMPP)、1,6-己二醇二丙烯酸酯 (HDDA)、正丁基丙烯酸酯 (nBA)、三水合氯金酸 (AuCl₃·3H₂O)、NAS。胶体金纳米颗粒按 Grabar 等人 (1995) 法合成。DNA 探针用 0.05 M K-磷酸盐缓冲液 (pH 7.0) 配制，杂交在 0.05 M Na-磷酸盐缓冲液 (pH 7.0) 含 1.0 mM AQMS 和 2.0 M NaCl 中进行。

丙烯酸微球合成

AcMPs 通过一步 UV 引发光聚合制备：HDDA、nBA、DMPP、NAS 水乳液混合，超声 10 分钟，N₂ 气氛下 UV 固化 600 秒。离心收集，K-磷酸盐缓冲液洗涤 3 次，自然干燥。

基于丙烯酸微球的 DNA 生物传感器制备

SPE 表面先滴涂 3 mg/ml AcMP 分散液，再滴涂 5 mg/ml 胶体 AuNPs。修饰电极在 5 µM 氨基修饰龙鱼 DNA 探针溶液中孵育 6 小时，充分洗涤。含 1 mM AQMS 和 2 M NaCl 的 5 µM 靶 cDNA 杂交 1 小时后，室温下在 0.05 M K-磷酸盐缓冲液中 DPV 分析。

电化学龙鱼 DNA 生物传感器优化

通过改变孵育时间 (1–18 h) 和杂交时间 (10–100 min) 优化探针固定。系统考察温度、pH、离子强度、阳离子价态以最大化 DPV 响应。最优条件：探针孵育 6 小时，杂交 30 分钟，25°C，pH 7.0，0.05 M Na-磷酸盐缓冲液，2 M NaCl，1 mM AQMS。

DNA 提取与龙鱼 DNA 分析

15 份龙鱼组织样本用 QIAquick PCR 纯化试剂盒提取。基因组 DNA 经 PCR 扩增，1.5% 琼脂糖凝胶电泳验证。同份提取物用生物传感器检测；DPV 电流高于基线指示雄性 DNA，基线电流对应雌性 DNA。t 检验 (95% 置信度) 评估统计学意义。

结果与讨论

SEM 确认均匀球形 AcMPs (图 2)，粒径分布窄 (图 3)。修饰 SPE 电化学表征显示扩散控制的可逆氧化还原过程，峰电流与扫描速率平方根线性相关 (R²=0.996；图 4)。DPV 响应 (图 6) 显示仅与互补 DNA 杂交后电流显著增加，确认探针特异性。

优化研究显示探针固定 6 小时后趋于平稳，室温下杂交 30 分钟达平衡 (图 7)。25°C 以上加速杂交但有变性风险，故选 25°C 为最优。pH 依赖性显示中性 pH 7.0 DPV 信号最大；偏离降低杂交效率 (图 9)。测试阳离子中 Na⁺ 增强效果最好，可能因沉淀少和有利静电屏蔽 (图 10)。离子强度分析确定 2 M NaCl 和 0.05 M Na-磷酸盐缓冲液为最佳杂交缓冲液 (图 11)。

标定曲线显示 1.0×10⁻¹⁸ M 至 1.0×10⁻⁸ M 线性响应 (R²=0.99) 及代表性 DPV 谱图 (图 12)。

龙鱼性别鉴定

现场样本检测中，生物传感器性别判定与 PCR 结果一致 (表 2)，证实其可靠用于快速现场检测。

结论

该电化学 DNA 生物传感器对龙鱼 DNA 表现出卓越灵敏度、宽动态范围和低检测限。其快速、阿托摩尔级检测能力，结合轻量一次性格式，使其成为可集成到即时检测设备的理想工具，支持养殖操作中早期性别和体色鉴定。