一种由亚克力-金纳米复合材料制成的高灵敏度电化学 DNA 生物传感器，用于确定龙鱼的性别

背景

亚洲龙鱼 (Scleropages formoss )，一种淡水鱼，[1] 广泛分布于马来西亚、新加坡、泰国、印度尼西亚、柬埔寨、越南、老挝、缅甸和菲律宾等东南亚地区的农村。此外，在澳大利亚和新几内亚也发现了龙鱼 [1,2,3,4]。它通常被称为龙鱼、亚洲骨舌鱼、kelisa 或 baju-rantai [5, 6]。它仍然作为侏罗纪时代的原始鱼类幸存下来 [7, 8]。中国人和亚洲人认为它与许多其他文化一样是好运和幸福的象征[6]。一般来说，龙鱼在成熟时重约 7 kg，长 1 m [9]。这种观赏鱼具有迷人的颜色和形态，可以通过其独特的身体特征来识别，例如体型较长，胸鳍较大，背鳍和臀鳍位于身体后方。亚洲龙鱼种类中近缘淡水鱼的颜色主要有金色、红色和绿色三种。还有其他几种不同的物种来自东南亚的不同地区，对许多河流系统来说都是区域性的[8]。

亚洲龙鱼因其高知名度和观赏性需求量大，被大量猎杀牟利[6]，导致其种群数量迅速减少。考虑到观赏产业的高需求、对自然种群的过度开发以及因生活环境变化而导致自然栖息地稀少等因素，亚洲龙鱼自1980年起被国际贸易公约列为濒临灭绝的濒危物种。在濒危野生动植物种 (CITES) 中，最近被 2006 年 IUCN 红色名录列为濒危物种 [1, 3, 8, 10, 11]。但是，CITES 禁止这种濒危物种的商业贸易，但某些国家/地区除外，例如印度尼西亚、新加坡和马来西亚。 [2, 3, 12]。亚洲有多家 CITES 注册养殖者积极开展龙鱼养殖和贸易 [2, 12]。这种亚洲淡水鱼由地理上孤立的品系组成，它是该物种中唯一的基于东南亚河流不同地理分布的不同颜色品种。物种分布现在更加广泛，延伸到非洲的尼罗河、南美洲的亚马逊河、澳大利亚和新几内亚[1, 4, 8]。

在亚洲龙鱼的不同颜色中，与黑色、绿色、银色和其他颜色品种相比，红色和金色的龙鱼是孵化行业中最昂贵和最受欢迎的观赏宠物 [1, 5, 10, 13]。与其他鱼类相比，亚洲龙鱼的偷蛋现象是非典型的。一般来说，龙鱼在 3-4 岁时成熟，它们只产几个特大号（直径约 1 厘米）的卵（30-100 个）[14, 15] [16]。有趣的是，受精卵和幼虫随后在雄性龙鱼的口中受到保护并长大，表现出高度的父母关怀。由于龙鱼没有明显的两性异形表型器官，因此很难根据幼龙的肉眼观察来确定性别[14, 15]。由于后代是从他的嘴里采集的，因此只能确定其中一位父母（假定是男性）。无法从许多潜在的父母中确定另一个父母[16]。

通常，爱好者将龙鱼幼鱼放在水族馆中用于观赏以及在养鱼场进行养殖。然而，由于缺乏区分性别和颜色品种的辅助技术，所有类型的龙鱼幼鱼均以相同的价格出售。直到现在，还没有公开的方法来确定幼年龙鱼的性别和颜色。取而代之的是，已经使用基于龙鱼的遗传结构和传记的 DNA 分析进行了数百项研究，试图在它们的早期识别性别和颜色。基于体型和口腔估计的传统方法只能在龙鱼宝宝 3 个月左右时进行性别和颜色识别 [17]。然而，这种传统的目视检查方法耗时且经常提供不准确的结果。另一方面，广泛使用的基于 DNA 测序的标准方法，即聚合酶链反应 (PCR) 和凝胶电泳，需要大量的劳动力、时间和资源。先前采用了一种替代算法的发明问题解决 (ARIZ) 方法来检测龙鱼性别检测 [18]。 ARIZ 是一种用于性别检测的替代工具，包含九个不同的部分，总共 40 个复杂的步骤。它需要很长时间的学习和实践，需要经验丰富的人员来操作。例如，已经采用了ARIZ在各种工程系统中的应用，但大部分案例并没有涵盖ARIZ的所有要求和流程。

在这项研究中，通过 N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺 (NAS) 部分用琥珀酰亚胺官能团修饰的丙烯酸聚合物微球用作 DNA 探针固定的基质。正如 Chen 和 Chiu 2000 和 Chaix 等人先前报道的那样。 2003 [19, 20]，琥珀酰亚胺官能团可以与胺官能团反应形成共价键。将 NAS 功能结合到用于 DNA 微生物传感器应用的丙烯酸微球中提供了一种简单制备方法的优点，其中可以在短时间内（几分钟）使用光聚合通过一步程序合成和功能化这些球。此外，微球的优点是体积小，为DNA探针固定提供了大的表面积，从而减少了反应物和产物的扩散障碍。这可以在更短的响应时间和更宽的线性响应范围方面提高生物传感器的性能，这将在此处报告的工作中得到证明。

在这项研究中，提出了一种高灵敏度、简单、易于制造、成本低的电化学 DNA 生物传感器方法，用于龙鱼幼鱼性别的高精度测定。 DNA 生物传感器由用胶体金纳米粒子 (AuNPs) 修饰的碳丝网印刷电极 (SPE) 和用 NAS 官能团功能化的聚丙烯酸酯微球构建而成。 AuNPs通过静电相互作用固定在碳SPE表面，在提高电极电导率和促进电子转移方面发挥重要作用，而丙烯酸微球（AcMPs）通过物理吸附直接沉积在AuNP修饰的SPE上。然后将龙鱼的胺化 DNA 探针共价连接到固定化的 AcMP-AuNP 复合材料上暴露的 AcMP 琥珀酰亚胺基团。通过微分脉冲伏安法 (DPV) 用蒽醌氧化还原标记检测探针-靶标杂交。掺入小而均匀的AcMPs能够保持较大的DNA负载能力，提高电化学龙鱼DNA生物传感器的灵敏度和检测限。

方法

仪器和电极

所有电化学测量均使用 Autolab PGSTAT 12 恒电位仪/恒电流仪 (Metrohm) 在 -1.0 V 至 -0.1 V 的电位窗口内的 0.02 V 阶跃电位下使用 DPV 进行。来自 Scrint Technology Co Malaysia 的 SPE 使用 AcMP 和 AuNP 修饰工作电极。棒状铂 (Pt) 电极和填充有 3.0 M KCl 内部溶液的 Ag/AgCl 电极分别用作辅助电极和参比电极。 Elma S30H超声浴用于制备均相溶液。

化学品

2-2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮 (DMPP) 购自 Fluka。 1,6-己二醇二丙烯酸酯 (HDDA)、丙烯酸正丁酯 (nBA) 和氯化金 (III) 三水合物由 Sigma-Aldrich 提供。根据 Grabar 等人报道的方法合成胶体 AuNPs。 (1995)。十二烷基硫酸钠 (SDS) 和 NaCl 购自 Systerm。 NAS 和蒽醌-2-磺酸一水合物钠盐 (AQMS) 购自 Acros。 Milli-Q 水 (18 mΩ) 用于制备所有化学和生物溶液。 DNA 探针的原液用 0.05 M 磷酸钾缓冲液 (pH 7.0) 稀释，而互补 DNA (cDNA) 和非互补 (ncDNA) 溶液则用 0.05 M 磷酸钠缓冲液在 pH 7.0 中制备，其中含有 1.0 mM空气质量管理系统。磷酸钾缓冲液有助于最大限度地将 DNA 探针固定在琥珀酰亚胺官能化的丙烯酸材料上，而磷酸钠缓冲液为 DNA 杂交反应提供了最佳条件 [21, 22]。

亚克力微球的合成

AcMPs 是根据先前描述的方法制备的，稍作修改 [22]。简而言之，将 450 μL HDDA、0.01 g SDS、0.1 g DMPP、7 mL nBA 单体和 6 mg NAS 的混合物溶解在 15 mL Milli-Q 水中，并在室温（25 °C）下进行超声处理) 10 分钟。之后，乳液溶液在连续的 N2 气流下用紫外线光固化 600 秒。然后通过在 4000 rpm 下离心 30 分钟收集得到的聚（nBA-NAS）微球，然后在磷酸钾缓冲液（0.05 M，pH 7.0）中洗涤 3 次，并在室温下干燥。

使用丙烯酸微球制造 DNA 生物传感器

在表面改性之前，用去离子水彻底冲洗碳 SPE，用 3 mg/mL 的丙烯酸聚合物微球滴涂，并在环境条件下风干，然后用 5 mg/mL 滴涂胶体金纳米粒子。用 CV 方法检查了用 AcMPs 和 AuNPs 改性前后碳 SPE 的电化学特性。图 1 描绘了该方法，该方法由电化学 DNA 生物传感器的 3 步制造和龙鱼 cDNA 检测的 1 步组成。大约 10 μL 的胶体 AuNPs (1 mg/300 μL) 首先沉积在碳 SPE 上并在 25 °C 下风干。由于 AcMP (1 mg) 很容易悬浮在乙醇 (100 μL) 中以形成稳定的分散体，因此将 10 μL 的 AcMP 悬浮液滴涂到 AuNP 改性的 SPE 上。然后将 AcMP-AuNP 修饰的碳 SPE 浸入 300 μL 5 μM 龙鱼 DNA 探针溶液中 6 小时以进行 DNA 固定过程，并用磷酸钾缓冲液（0.05 M，pH 7.0）小心洗涤 3 次以去除未结合的捕获探针。随后将固定的 DNA 探针浸入 300 μL 含有 2 M NaCl 和 1 mM AQMS 的目标 DNA 溶液中，使 DNA 杂交和嵌入反应在一小时内发生，然后依次用 Milli-Q 水和磷酸钠冲洗缓冲液 (0.05 M, pH 7.0) 用于去除非杂交 DNA 片段和 AQMS 电化学标记的特异性结合。所有 DPV 测量均在 4.5 mL 0.05 M 磷酸钾缓冲液中进行，pH 7.0，室温。

基于AcMP-AuNP修饰电极的电化学龙鱼DNA生物传感器的制作过程

电化学龙鱼DNA生物传感器的优化

分别使用 AcMP、AuNP 和 AcMP-AuNP 复合物修饰的 DNA 电极，在 1 mM AQMS 和 2 M NaCl 存在下，使用 DPV 电分析方法进行 cDNA (5 μM) 和 ncDNA (5 μM) 测试0.5 V/s 与 Ag/AgCl 参比电极的扫描速率。 DNA 探针固定持续时间是通过将 9 个单位的 AcMP-AuNP 修饰的 SPE 在 300 μL 的 5 μM 龙鱼 DNA 探针溶液中分别浸泡 1、2、3、5、6、7、8、12 和 18 小时来确定的，然后在含有 1 mM 蒽醌氧化还原嵌入剂和 2 M NaCl 的 DNA 杂交缓冲液（0.05 M 磷酸钠缓冲液，pH 7.0）中与 5 μM cDNA 反应。通过将 DNA 电极在 2 M NaCl 和 1 mM AQMS 存在下，将 DNA 电极浸入 300 μL 5 μM cDNA 溶液中 10-100 分钟来研究 DNA 杂交时间。温度对 DNA 杂交持续时间的影响是通过使用 DPV 技术在测量缓冲液中测量 4、25、40 和 50°C 下的龙鱼 DNA 生物传感器响应 5-90 分钟来完成的。对于 pH 值影响研究，将龙鱼 DNA 生物传感器浸入由 0.05 M 磷酸钠缓冲液制备的 5 μM cDNA 溶液中，该缓冲液由 2 M NaCl 和 1 mM AQMS 在 pH 5.5 和 pH 8.0 之间调节，然后进行 DPV 测量。各种带正电荷的离子（即 Ca ²⁺ , Na ⁺ , K ⁺ , 和 Fe ³⁺ 离子）对电化学龙鱼 DNA 生物传感器的响应是通过在 DNA 杂交反应和 DPV 测量之前将 CaCl2、NaCl、KCl 和 FeCl3 添加到 0.05 M 磷酸钠缓冲液（pH 7.0）中来进行的。通过将磷酸钠缓冲液和 NaCl 浓度分别从 0.002–0.1000 M 改变到 1.52–5.50 M 来优化杂交缓冲液的离子强度。然后通过对1.0×10 ^-18 的一系列cDNA浓度进行定量测量，建立了龙鱼DNA生物传感器的线性校准曲线。 到 2.0 × 10 ⁻² μM 通过 DPV 方法。所有实验一式三份进行。

DNA 提取和龙鱼 DNA 分析

马来西亚渔业部渔业研究所（FRI）提供了总共 15 份龙鱼鱼组织样本。所有的鱼组织样本都储存在 70% 乙醇中的 4°C 冷却器中，然后运送到实验室。鱼组织样品用 Milli-Q 水清洗并切成小块，在环境条件下干燥，然后保存在 -20°C 的冰箱中。然后，根据制造商的方案，使用 QIAquick PCR 纯化试剂盒（英国曼彻斯特）分别提取来自每个组织样本（每个 35–40 mg）的龙鱼 DNA，并在不使用时储存在 -20 °C 下。然后使用 Bio-Rad PCR 热循环仪 (PTC-100, Hercules, USA) 进行基因组 DNA 片段的 PCR 扩增。然后用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物的DNA片段。龙鱼 DNA 提取物也通过电化学 DNA 生物传感器进行分析，以确定性别。将获得的 DPV 响应与在不存在龙鱼 DNA 的情况下获得的基线电流进行比较。 t 应用测试来确定 DNA 生物传感器响应与基线电流在 4 个自由度和 95% 置信水平之间的显着差异。在显着高于基线电流时获得的 DNA 生物传感器响应表明检测到雄性龙鱼，反之亦然。

结果与讨论

在扫描电子显微镜（SEM，LEO 1450VP）下观察到合成的 AcMP（图 2）。光聚合制备的丙烯酸酯的尺寸分布如图3所示。

丙烯酸聚合物微球的SEM图像

光聚合制备的丙烯酸微球的粒径分布

在 K3Fe(CN)6 存在下，含 AcMPs-AuNPs 的碳 SPE 的不同扫描速率的影响表明，氧化和还原峰值电流随着扫描速率从 0.05 V/s 增加到 0.30 V/s 而增加（图 3）。 4）。因此，预计电极表面的电子转移过程是可逆的[22,23,24,25]。

含有 AcMP-AuNP 的改性碳 SPE 在不同扫描速率（0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 和 0.30 V/s）下，1.0 mM K3Fe(CN)6 在 pH 7.0 的 0.05 M 磷酸钠缓冲液中的循环伏安图电极表面材料

基于Randles-Sevcik方程，

发现氧化还原峰值电流与扫描速率的平方根之间具有良好的线性关系，并具有相关系数（R ² ) 在 50–300 mV/s 的范围内为 0.996，如等式所示。 2和图5a。

氧化峰值电流 (ip/μA) 与扫描速率平方根 ((mV/s) ^1/2 ) (a ) 和氧化峰值电流对数 (ip/μA) 与扫描速率对数 (log (mV/s)) 的关系图 (b )

这表明修饰电极表面的反应为扩散控制反应[22,23,24,25]。

此外，基于图 5b，当将氧化电流的对数值与扫描速率的对数值作图时，得到一条斜率为 0.65 的线性线，接近于扩散控制过程的理论值 0.50 .因此，研究表明改性SPE表面的反应主要是扩散控制的。

对于快速、可逆和单电子转移过程的理想情况，在 298 K 时 ΔEp =0.059 V。但是，随着扫描速率增加的峰值电位偏移表明更大的峰值电位分离超过 0.059 V（图 4） ）。这意味着电极表面的电子转移过程很慢 [22, 25, 26]，可能是由于覆盖电极表面的 AcMP 材料的存在产生的电阻。

图 6 显示了基于 AcMP、AuNP 和 AcMP-AuNP 修饰的碳 SPE 的龙鱼 DNA 生物传感器的 DPV 响应。实验 (a) 和 (c) 之间观察到的显着 DPV 电流差异表明，龙鱼 DNA 探针通过 AcMP 的琥珀酰亚胺官能团和胺化 DNA 探针的胺官能团之间的强共价键成功接枝到 AcMP 上，以及固定的龙鱼 DNA 探针仅对其 cDNA 具有选择性 [19, 20]。 AuNPs 起到了帮助电子从嵌入的 AQMS 到制造的电极表面的传导的作用。如果复合材料 (f) 中不包含 AuNP，只有金纳米粒子 (e) 以及金纳米粒子和 AcMP 复合材料 (d)，则只能观察到非常小的电流响应。实验(b)中获得的低DPV电流是由于与ncDNA没有发生DNA杂交反应，这也表明电极表面没有AQMS氧化还原指示剂的特异性吸收[27, 28]。

AcMP-AuNP 基 DNA 电极与 cDNA (a ) 和非互补 DNA (b )，AcMP 的 DPV 响应 (f ) 和 AuNP 修饰的 SPE (e )、AcMP-AuNP 复合修饰 SPE 以及基于 AcMP-AuNP 复合修饰探针 DNA SPE 的 DNA 生物传感器的响应 (c ) 在 1 mM AQMS 存在下以 0.5 V/s 的扫描速率与 Ag/AgCl 参比电极反应之前

对于 DNA 探针固定持续时间，图 7a 显示 DNA 生物传感器响应在 DNA 探针固定时间的前 1-3 小时缓慢增加，并且在 DNA 探针固定持续时间的 3 到 6 小时之间可以看到 DNA 生物传感器响应的突然增加.这是因为需要更长的固定时间来促进更大量的 DNA 探针附着在 AcMP-AuNP 修饰的电极上。随着 DNA 探针固定时间的进一步延长，DNA 生物传感器响应没有明显变化，因为固定化 AcMP 的结合位点已与 DNA 探针完全结合。龙鱼 DNA 生物传感器的响应也取决于 DNA 杂交时间。图 7b 中所示的生物传感器响应曲线显示了 DPV 电流响应趋势随着 DNA 杂交持续时间从 10 到 60 分钟而增加，此后电流响应几乎趋于平稳。此时，电极上固定的DNA探针已与cDNA完全杂交[29]。

DNA 探针固定时间的影响 (a ) 和 DNA 杂交时间 (b ) 在 1 mM AQMS 和 2 M 离子强度下使用 5 μM DNA 探针和 cDNA 对龙鱼 DNA 生物传感器的响应

还注意到制造的龙鱼 DNA 生物传感器的 DNA 杂交时间依赖于温度，并且作为一个很大的优势，我们在室温下 30 分钟内获得了最大电流响应（图 8）。在低温下，即 4°C，完成 DNA 杂交反应需要很长时间，因为低温会减慢 DNA 杂交反应的速度。在高于 25°C 的温度下可以实现更快的 DNA 杂交时间，这归因于固定的 DNA 探针和 cDNA 在高温下形成双链体 DNA 之间发生更高的 DNA 杂交反应速率。然而，高温会使DNA的双螺旋结构永久变形，即使将温度重新调整到最佳值，DNA分子也无法再生[28, 30]。

温度对龙鱼 DNA 生物传感器 DNA 杂交时间的影响。 DPV 响应在 0.05 M K-磷酸盐缓冲液（pH 7.0）中在 4、25、40 和 50°C 下测量，实验时间为 5-90 分钟

作为龙鱼 DNA 生物传感器响应优化的一部分，研究了溶液 pH 值对 DNA 杂交反应的影响。由于 DNA 磷酸二酯骨架的质子化，DNA 生物传感器在 pH 5.5 和 pH 6.5 之间显示出可忽略不计的电流变化，这降低了 DNA 分子在水性环境中的溶解度（图 9）。 DNA 杂交介质的 pH 值进一步增加，龙鱼 DNA 生物传感器响应在 pH 值 7.0 时突然增加，此后随着 DNA 在较高 pH 值下不可逆变性，当 pH 环境变为碱性条件时，可观察到 DPV 电流的急剧下降范围 [23、24、31、32、33]。由于在中性 pH 值下获得最大 DPV 响应，因此使用 0.05 M 磷酸钠缓冲液将龙鱼 DNA 生物传感器响应的下一次电化学评估维持在 pH 7.0。

基于AcMP-AuNP复合改性碳SPE的龙鱼DNA生物传感器在pH 5.5和pH 8.0之间的DPV响应。 DPV 测量在 0.05 M K-磷酸盐缓冲液 (pH 7.0) 中进行，温度为 25 °C，扫描速率为 0.5 V/s，相对于 Ag/AgCl 参比电极

使用不同的盐阳离子进行阳离子化合价对 DNA 杂交反应的影响，例如Ca ²⁺ , Na ⁺ , K ⁺ , 和 Fe ³⁺ DNA 杂交缓冲液中的离子。带正电荷的离子可以与带负电荷的DNA分子磷酸二酯链发生静电相互作用，克服固定化DNA探针与靶DNA之间的空间位阻和静电排斥，从而促进DNA杂交过程[34]。图 10 表明在 Na ⁺ 顺序的阳离子存在下 DNA 杂交反应是有利的> K ⁺ > Fe ³⁺ > Ca ²⁺ . Ca ²⁺ 的存在 和 Fe ³⁺ 与 Na ⁺ 相比，注意到离子导致龙鱼 DNA 生物传感器电流响应显着下降 和 K ⁺ 离子。这些现象归因于在 DNA 杂交缓冲液中形成了难溶的磷酸钙和磷酸铁 (III) 盐 [22]，这降低了溶液的离子含量并导致 DNA 分子之间的高静电排斥。结果，DNA 杂交率下降并导致生物传感器性能不佳。当 Na ⁺ 时获得最高的 DNA 生物传感器响应 由于其体积小且对DNA磷酸二酯键的亲和力强，因此将其加入到DNA杂交磷酸盐缓冲液中。

Ca ²⁺ 的作用 , Na ⁺ , K ⁺ , 和 Fe ³⁺ DNA杂交缓冲液（pH 7.0的0.05 M磷酸钠缓冲液）中离子对龙鱼DNA生物传感器DPV响应的影响

还必须优化 NaCl 和磷酸钠缓冲液 (pH 7.0) 的浓度，以便为杂交缓冲液提供最佳离子强度。图 11b 表明低于和高于 2 M 的离子强度无法克服 DNA 链之间的高静电排斥。发现约 0.05 M 的磷酸钠缓冲液（图 11a）和 2 M 的 NaCl 为具有最大生物传感器性能的龙鱼目标 DNA 分析提供最佳离子强度。在 pH、缓冲容量和离子强度方面的最佳杂交缓冲条件将使 DNA 杂交反应发生在最小的空间位阻[30]。

龙鱼 DNA 生物传感器响应趋势为 a 磷酸钠缓冲液浓度和b 杂交缓冲液的离子强度分别为0.002-0.100 M和1.52-5.50 M

优化后的DNA生物传感器用于检测一系列浓度在1.0×10 ^-12 之间的龙鱼cDNA 和 1.0 × 10 ⁻² 微米。 DNA 生物传感器表现出从 1.0 × 10 ^-18 的宽线性响应范围 到 1.0 × 10 ⁻⁸ M (R ² =0.99）。在 1.0 × 10 ⁻¹⁸ 获得的检测限 (LOD) M 是基于生物传感器响应标准偏差在近似 LOD 的响应曲线处的三倍除以线性校准斜率计算的。微米范围内的均质 AcMP 粒径对 DNA 生物传感器的灵敏度和重现性 (RSD =5.6%) 具有显着影响。固定化 NAS 功能化 AcMP 的大结合表面积允许大量 DNA 分子共价结合到电极表面，从而提高了 DNA 生物传感器在龙鱼 DNA 生物传感器的动态线性范围和检测限方面的分析性能（图. 12).

The arowana DNA biosensor response curve (a ) and linear calibration range (b ) and the DPV voltammogram (c ) obtained using 1.0 × 10 ⁻¹⁸ to 1.0 × 10 ⁻² μM cDNA at pH 7.0

Determination of Arowana Fish Gender with DNA Biosensor

The developed electrochemical DNA biosensor has been validated with the standard PCR-based method to determine the gender of Asian arowana fish. With the results tabulated in Table 2, both methods provided the same result for the gender determination of arowana fish. This indicates that the proposed DNA biosensor can be used for accurate determination of arowana gender in a simple and fast way.

结论

The electrochemical DNA biosensor developed in this study demonstrated good sensitivity, wide linear response ranges, and low detection limit in the determination of arowana target DNA. In addition, the DNA biosensor showed a good response towards arowana cDNA, which implies that the electrochemical DNA biosensor could be used to successfully detect the arowana DNA segments. The developed arowana DNA biosensor can be further redesigned into a point-of-use device prototype that offers a great potential for the application in the fish culture for early identification of arowana gender and colour, which is economically advantageous in fishery and aquaculture sectors.