靶向miR-342-5p/Wnt3a轴稳定动脉粥样硬化斑块并抑制ApoE−/−小鼠血管生成

摘要

微RNA-342-5p（miR-342-5p）与动脉粥样硬化（AS）相关，但其机制角色不明。本研究探讨miR-342-5p如何调控Wnt3a信号通路并影响ApoE^−/−小鼠AS模型中斑块易损性和新生血管形成。24周龄雄性ApoE^−/−小鼠高脂饲料诱导16周建立易损斑块模型。RT-qPCR和Western blot定量miR-342-5p和Wnt3a表达。功能实验评估miR-342-5p抑制（反义寡核苷酸）和Wnt3a过表达（oe-Wnt3a载体）对血清脂质、炎症氧化应激因子、斑块形态、微血管密度（MVD）的影响。结果显示AS主动脉中miR-342-5p上调、Wnt3a和β-连环蛋白下调，miR-342-5p直接靶向Wnt3a 3′UTR。拮抗miR-342-5p或过表达Wnt3a降低总胆固醇、甘油三酯、LDL-C、促炎细胞因子（IL-5、IL-12p70、IFN-γ、TNF-α），升高HDL-C和SOD活性，减少脂质核面积、增加胶原含量、减少巨噬细胞浸润、降低MVD。相反miR-342-5p过表达加重所有参数。因此miR-342-5p通过抑制Wnt3a促进斑块不稳定和血管生成；恢复Wnt3a可缓解这些效应，提示AS治疗新靶点。

引言

动脉粥样硬化（AS）仍是全球心血管发病死亡首因。斑块不稳定——以富脂坏死核、薄纤维帽、巨噬细胞浸润、胶原减少为特征——导致破裂急性事件。虽然降脂疗法改善预后，许多患者仍发生心血管事件，凸显新型分子干预必要性。微RNA（miRNAs）为短非编码RNA，转录后调控多靶基因。miR-342-5p位于14q32 miRNA簇，报道影响TGF-β和VEGF途径血管生成及调节血管疾病炎症反应。但其在AS中具体角色及与关键信号级联相互作用仍不全明。Wnt/β-连环蛋白通路对血管细胞稳态至关重要，影响平滑肌增殖、内皮完整性、斑块组成。先前工作显示miR-342-5p在其他疾病背景下负向调控Wnt3a，提示AS中潜在调控轴。本研究阐明miR-342-5p/Wnt3a相互作用及其对ApoE^−/−小鼠斑块稳定性和血管生成的影响。

材料与方法

动物与伦理

雄性ApoE^−/−和C57BL/6J小鼠（8周龄）12 h明暗周期饲养，标准饲料或高脂饲料（20%脂肪、0.25%胆固醇）16周。所有操作遵循NIH指南，经青海省人民医院机构动物护理使用委员会批准（伦理号201870726）。

实验设计

ApoE^−/−小鼠随机分六组（n=12/组）：AS、NC（生理盐水）、miR-342-5p agomir、miR-342-5p antagomir、oe-Wnt3a、miR-342-5p agomir+oe-Wnt3a。治疗（40 mg/kg，尾静脉）双周给药8周。C57BL/6J作正常对照。

生化分析

商业试剂盒（南京建成生物工程）测血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、LDL-C、HDL-C、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）。细胞因子（IL-5、IL-12p70、IFN-γ、TNF-α）ELISA定量（MultiSciences）。

组织处理

12 h禁食后处死小鼠；收集主动脉，RNA-free PBS洗涤，分组用于组化（HE、Oil Red O、Sirius Red）或分子实验（RT-qPCR、Western blot）。组化样本石蜡包埋、4 μm切片、标准染色。

基因表达与蛋白分析

RT-qPCR用2^−ΔΔCt法定量miR-342-5p、Wnt3a、β-连环蛋白及参考基因（U6、β-actin）。Western blot检测Wnt3a、β-连环蛋白、CD34、α-SMA、β-actin，ImageJ灰度分析。

免疫组化

切片免疫染色MOMA-2（巨噬细胞）、α-SMA（平滑肌细胞）、CD34（内皮细胞）。Image Pro Plus 6.0量化染色强度。斑块易损性指数=(巨噬细胞%+脂质%)/(平滑肌细胞%+胶原%)。MVD按CD34⁺微血管/mm²计数。

荧光素酶报告基因实验

Wnt3a 3′UTR（野生型和突变型）克隆入GP-miRGLO。小鼠主动脉内皮细胞共转染报告质粒和梯度miR-342-5p agomir，48 h后测荧光素酶活性。

统计分析

数据均值±SD。两组比较用不配对t检验；多组用单因素方差分析配Tukey事后检验。p<0.05为显著。

结果

AS主动脉中miR-342-5p上调、Wnt3a下调

RT-qPCR显示AS小鼠miR-342-5p显著增加（~3.5倍，p<0.01），Wnt3a同步下降（~0.4倍，p<0.01）。Western blot确认Wnt3a和β-连环蛋白蛋白水平降低。荧光素酶实证miR-342-5p直接结合Wnt3a 3′UTR，100 pM时报告基因活性降64%，突变结合位点消除该效应。

miR-342-5p拮抗或Wnt3a过表达改善血脂谱

miR-342-5p antagomir和oe-Wnt3a显著降TC、TG、LDL-C（~30–40%，p<0.01），升HDL-C（~20%，p<0.05），相对AS和NC组。miR-342-5p agomir加重血脂异常。Wnt3a过表达挽救miR-342-5p过表达不良效应。

miR-342-5p抑制抑制炎症氧化应激标志物

AS小鼠血清IL-5、IL-12p70、IFN-γ、TNF-α、MDA升高（p<0.01）。miR-342-5p antagomir或oe-Wnt3a降这些细胞因子和MDA~40%，升SOD活性~35%（p<0.01）。miR-342-5p agomir进一步加剧炎症氧化指标。

斑块形态经miR-342-5p抑制或Wnt3a过表达改善

HE染色显示miR-342-5p antagomir和oe-Wnt3a组斑块面积减小、纤维帽增厚、脂质核减少、胶原含量增加（Sirius Red），相对AS和NC组（p<0.01）。Oil Red O定量证明治疗组脂质含量降~30%。斑块易损性指数在antagomir和oe-Wnt3a组降45%，miR-342-5p agomir组增60%（p<0.01）。

巨噬细胞聚集和平滑肌细胞受调节

免疫组化显示miR-342-5p antagomir和oe-Wnt3a降MOMA-2⁺巨噬细胞%~50%，升α-SMA⁺平滑肌细胞%~30%（p<0.01）。联合治疗miR-342-5p agomir+oe-Wnt3a使巨噬细胞和平滑肌细胞水平趋向基线。

靶向miR-342-5p/Wnt3a轴减弱血管生成

CD34免疫染色和Western blot显示miR-342-5p antagomir和oe-Wnt3a较AS小鼠降MVD~55%（p<0.01）。miR-342-5p agomir增MVD~70%（p<0.01）。联合治疗缓和血管生成反应。

讨论

发现未表征的miR-342-5p/Wnt3a轴调控脂质代谢、炎症、氧化应激、斑块组成、新生血管形成。AS主动脉miR-342-5p上调直接抑制Wnt3a，抑制β-连环蛋白信号，促进易损斑块表型。反之抑制miR-342-5p或恢复Wnt3a重建保护性血脂谱、降促炎细胞因子、增抗氧化防御、稳定斑块结构、遏制病理性血管生成。结果与miR-342-5p参与巨噬细胞激活炎症报道、Wnt信号血管生物学既定角色一致。体内稳健逆转AS标志物凸显调控该轴治疗潜力。

结论

首次证实miR-342-5p通过靶向Wnt3a促进ApoE^−/−小鼠斑块易损性和血管生成。药理学抑制miR-342-5p或上调Wnt3a稳定动脉粥样硬化斑块，或成AS治疗有前景策略。