microRNA-342-5p 的下调或 Wnt3a 的上调抑制血管生成并维持动脉粥样硬化小鼠的动脉粥样硬化斑块稳定性

介绍

动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是一种与年龄相关的动脉疾病,以动脉增厚、狭窄、硬化和形成动脉粥样硬化斑块为特征[1]。它是发达国家的主要死亡和发病原因[2]。人类动脉粥样硬化病变的组织病理学研究表明，斑块发展和破裂的特点是脂质/坏死核心扩张、平滑肌细胞数量减少、巨噬细胞浸润和胶原蛋白含量减少 [3]。 AS 的关键细胞成分包括高脂血症、泡沫细胞形成、分化为巨噬细胞、单核细胞募集和诱导炎症 [4]。尽管临床上已经广泛应用了许多治疗AS的药物，但部分亚组患者仍处于心肌梗死、心肌缺血、心力衰竭和脑卒中的高危风险中[5]。因此，进一步探索潜在的分子机制可为AS治疗提供更多证据。

单个微小RNA (miRNA) 可以同时调节多个基因靶点[6]。研究表明 miR-342-5p 包含在印迹 14q32 miRNA 簇中，作为创新的 Notch 下游分子 [7] 并调节多种血管生成途径，例如转化生长因子 β 信号传导和血管内皮生长因子 [8]。相关的免疫调节 microRNA，如 miR-342-5p，在调节动脉粥样硬化的进展中具有多种重要作用 [9]。此外，一些 miRNA 已被建议参与 AS 的解决，例如 miR-155 和 miR-217 [10, 11]。一项研究报告称，miR-342-5p 是 AS 中巨噬细胞活化的新调节剂 [12]。另一项研究表明，巨噬细胞衍生的 miR-342-5p 促进 AS 并增加巨噬细胞的炎症刺激 [13]。曲等人. 曾发现在肛门直肠畸形中Wnt3a的表达受到miR-342-5p的负调控[14]，表明miR-342-5p与Wnt3a之间存在靶标关系。 Wnt 信号在胚胎发生过程中发挥重要作用，用于调节细胞极性、细胞增殖、轴形成和细胞凋亡 [15]。 Wnt3a 是中胚层基因的关键组成部分，在胚胎发育中起着至关重要的作用 [16]。已经提出，在 AS 回归期间对斑块巨噬细胞转录组的表观基因组指导分析揭示了 Wnt 信号通路的激活 [17]。此外，一项研究报告称，Wnt3a 调节血管平滑肌细胞的粘附和迁移，这有助于 AS 和再狭窄的发病机制 [18]。因此，本研究首次探讨了miR-342-5p靶向Wnt3a对AS易损斑块形成和血管生成的影响。

材料和方法

道德声明

根据美国国立卫生研究院实验室动物护理和使用指南中的建议，使用经批准的程序对动物进行了人道治疗。该方案经青海省人民医院机构动物护理和使用委员会批准（伦理编号：201870726）。

实验动物

雄性 ApoE ^−/− 8 周龄的 C57BL/6J 小鼠和 C57BL/6J 小鼠（无特定病原体级）可从北京 Vital 实验动物技术公司（中国北京）获得。小鼠（笼中 5-6 只小鼠）以 12 小时/12 小时昼/夜循环饲养，随意获取食物和水。

AS小鼠模型的建立

ApoE ^-/- 小鼠饲喂高脂饲料16 w，建立AS易损斑块模型。 C57BL/6 J 小鼠作为正常组使用天然饮料和食物。 ApoE ^-/- 12 w 后，小鼠的背部有光泽的浅色毛发和脱落的毛发。解剖3只模型小鼠的主动脉弓和头臂动脉进行苏木精-伊红（HE）染色，内膜无明显斑块沉积。 4 w后再次鉴定出3只造模小鼠，HE染色显示主动脉弓内膜有明显斑块沉积，模型建立成功。

小鼠分组和治疗

ApoE ^-/- AS易损斑块小鼠分为6组，每组12只：AS组，阴性对照（NC）组（注射生理盐水ApoE ^-/- 小鼠），miR-342-5p agomir组（注射miR-342-5p agomir以在ApoE ^-/- 中过表达miR-342-5p表达 小鼠），miR-342-5p antagomir 组（注射 miR-342-5p antagomir 以降低 ApoE ^-/- 中的 miR-342-5p 表达 小鼠），过表达 (oe)-Wnt3a 组（注射 oe-Wnt3a 载体以上调 ApoE ^-/- 中的 Wnt3a 表达 小鼠）和 miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a 组（注射 miR-342-5p agomir 和 oe-Wnt3a 载体以上调 ApoE ^{-/-<中 miR-342-5p 和 Wnt3a 的表达/sup> 老鼠）。作为正常组的 C57BL/6 J 小鼠被喂食正常饮食。高脂肪饲料含有20%的脂肪和0.25%的胆固醇。 miR-342-5p agomir、miR-342-5p antagomir 和 oe-Wnt3a 载体购自 Sangon（中国上海）。 oe-Wnt3a载体、miR-342-5p agomir、miR-342-5p antagomir都溶解在0.2mL生理盐水中，每两周通过尾静脉以40mg/kg的剂量注射到小鼠体内。 8 周后，从眼球中采集血液样本，然后对小鼠实施安乐死以收集动脉组织 [19]。}

在初步实验中，ApoE ^−/− 对患有 AS 的小鼠注射 10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg miR-342-5p agomir、miR-342-5p antagomir 或 oe-Wnt3a 载体（每两周一次；总共 4 次）。然后，通过逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测β-catenin的表达水平。

样品采集与处理

采样前，小鼠禁食 12 小时，吸入乙醚麻醉，从眼球中采集血样。打开小鼠胸部，将胸主动脉与腹主动脉末端分离，并取出整个血管。用无RNA磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗后，包埋组织进行HE染色、油红O、天狼星红染色和免疫组化染色。部分血管组织保存在- 80°C，用于RT-qPCR和Western blot。

血脂水平检测

采用全自动生化分析仪（Roche，Basel，Switzerland）检测血清中总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）。检测按照试剂盒说明书（南京建诚生物工程研究所，南京，中国）进行。

酶联免疫吸附测定 (ELISA)

血清细胞因子含量测定：使用市售的白介素（IL）-5、IL-12p70、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和干扰素（IFN）-γELISA试剂盒。最后，通过酶标仪在 450 nm 处检测每个孔的光密度 (OD) 值。

氧化应激损伤测定：血清丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性采用MDA试剂盒（OD值在532nm分光光度计测）和SOD试剂盒（OD值用酶标仪在450度测定）纳米）。 IL-5、IL-12p70、TNF-α、IFN-γ、MDA和SOD ELISA试剂盒购自MultiSciences（联科）生物技术有限公司（中国浙江杭州）。

HE 染色、油红 O 染色和天狼星红染色

固定和嵌入后，将标本切成 4 微米厚的连续切片。切片经脱蜡水合，苏木精和伊红染色，分化，脱水，二甲苯透明，干燥，中性树胶密封。细胞核呈蓝色，其他组织如细胞质和结缔组织呈深浅不一的红色。通过荧光显微镜观察斑块形成。显微镜下选取HE染色切片的动脉壁，数码相机采集实验结果。利用Image Pro Plus6.0（IPP6.0）图像分析软件模块计算各切片横截面斑块面积和壁面积及其比值。

选择 4-5 μm 的切片进行油红 O 染色。切片在高温下干燥 20 分钟，并与 100% 异丙醇一起温育 5 分钟。然后将切片与 0.5% 油红 O 染色溶液在 60°C 烘箱中孵育 8 分钟，在 85% 异丙醇中洗涤 3 分钟，苏木精染色 1 分钟，清洗并密封。油红O染色结果提示脂质呈红色或橙色，细胞核呈淡蓝色。采用IPP6.0软件计算组织切片斑块中的脂肪面积和斑块面积。脂质含量 =油红O阳性染色面积/斑块面积 × 100%。

天狼星红染色：切片脱蜡水化，天青蓝染色液染色10分钟，天狼星红染色液染色20分钟，苏木精复染10分钟。最后，切片用梯度乙醇脱水，二甲苯澄清，中性树胶密封。组织切片斑块中的胶原面积由IPP6.0软件计算。胶原面积 =天狼星红阳性染色面积/斑块面积 × 100%。计算斑块面积中脂质和胶原蛋白的百分比。

苏木精、伊红和 Sirius 染料可从中国医药集团上海化学试剂有限公司（中国上海）获得。油红O粉购自Sigma-Aldrich化学公司（美国密苏里州圣路易斯）。

逆转录定量聚合酶链反应 (RT-qPCR)

将主动脉组织加入总 RNA 提取试剂 Trizol (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) 中，然后匀浆以提取总 RNA 并组成互补 DNA。引物均参考Genbank提供的序列，Primer 5.0设计，上海生工生物科技有限公司合成。 MiR-342-5p：forward：5′-CGGAGGGGTGCTATCTGTGATTGAG-3′，反向引物为试剂盒通用引物（Qiagen公司，德国希尔登）； Wnt3a：正向：5'-AGGTAAGCTACTCCCTCAACTA-3'，反向：5'-CTGAAGCACCCTCTCATGTATC-3'； β-肌动蛋白：正向：5'-GCACCACACCTTCTTACAATGAGC -3'，反向：5'-TCGTTGCCAATAGTGATGACC-3'； β-连环蛋白：正向：5'-TCAAGAGAGCAAGCTCATCATTCT-3'，反向：5'-CACCTTCAGCACTCTGCTTGTG-3'。反应结束后，计算机分析阈值循环（Ct）。以miR-342-5p与U6的相对比值作为其表达量，Wnt3a与β-actin的相对比值作为其表达量，通过2 ^-ΔΔCt 计算相对比值 方法。

蛋白质印迹分析

从主动脉组织中提取总蛋白质。蛋白质浓度采用二辛可宁酸法测定。进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。然后将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上，得到目标条带。将膜在 5% 脱脂牛奶中密封 1 小时，加入一抗 Wnt3a (1:500)、β-连环蛋白 (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA)、CD34 (1 :2500, Abcam, MA, USA) 和 β-肌动蛋白 (1:2000, Beyotime Biotechnology Co., Shanghai, China) 4 °C 过夜。用含有 Tween 20（pH =7.5、10 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L NaCl 和 0.2% Tween-20）的 Tris 缓冲盐水洗涤膜 10 min × 3 次，然后附加二抗（1：1000，ZSGB-Bio，北京，中国）2 小时。采用ImageJ软件评估条带灰度值并定量蛋白表达。

免疫组化染色

将 4-5 μm 的切片放在涂有 100 mg/L 聚赖氨酸并用丙酮固定的载玻片上。内源性过氧化物酶被牛血清白蛋白阻断。在组织中滴加 MOMA-2 抗体 (1:200)、α-SMA (1:200) 和 CD34 (1:200, Abcam Inc., Cambridge, MA, USA) 并加入二抗工作液 ( 1：1000）。组织用二氨基联苯胺显色，苏木精复染（1分钟），脱水、透明、密封并在显微镜下观察。每个免疫组化切片选择三个不同的视野。使用IPP6.0软件进行定量分析。 MOMA-2和α-SMA的免疫组化染色分别呈阳性，表明巨噬细胞和平滑肌细胞主要位于细胞质中，呈黄色至棕色。分别计算巨噬细胞和平滑肌细胞的百分比，结合斑块中脂质和胶原蛋白的百分比计算斑块易损指数。斑块脆弱性指数 =（巨噬细胞阳性百分比 + 脂质阳性百分比）/（胶原蛋白阳性百分比 + 平滑肌细胞阳性百分比）[20]。通过测量 CD34 表达评估微血管密度 (MVD)，并量化为微血管数/mm ² .

双荧光素酶报告基因检测

miR-342-5p的靶基因通过生物预测网站（http://www.microRNA.org）进行分析。双荧光素酶报告基因检测用于验证Wnt3a是否为miR-342-5p的靶基因。将 Wnt3a 3'-非翻译区 (3'-UTR) 的野生型或突变序列克隆到 GP-miRGLO 载体 (GenePharma, Shanghai, China)。报告基因（0.5 μg）和 1、10 或 100 pM miR-342-5p agomir 转染小鼠主动脉内皮细胞（No. 506，MingzhouBio，Ningzhou，China）48 小时，使用双荧光素酶检测系统测试荧光素酶活性（Promega，WI，美国）。

统计分析

所有数据均由 SPSS 21.0 软件（IBM Corp. Armonk, NY, USA）解释。测量数据表示为平均值 ± 标准偏差。两组之间的差异由 t 制定 -test，而通过单向方差分析 (ANOVA) 和 Tukey 的多重比较检验在多个组之间进行。 P 建立统计显着性 值 <0.05.

结果

ApoE 主动脉组织中的 miR-342-5p 增加和 Wnt3a 减少 ^-/- 小鼠和 miR-342-5p 直接靶向 Wnt3a

MicroRNA (miRNA) 靶基因与动脉粥样硬化相关功能有关。 miR-342-5p、Wnt3a和β-catenin在AS模型小鼠的主动脉组织中通过RT-qPCR和Western blot检测进行检测。结果表明，与正常组相比，AS组中miR-342-5p升高，而Wnt3a和β-catenin降低（均P <0.05)。与NC组相比，miR-342-5p agomir组miR-342-5p增强，Wnt3a和β-catenin降低（均P <0.05)，而 miR-342-5p 降低，Wnt3a 和 β-catenin 在 miR-342-5p antagomir 组中升高（均 P <0.05)。与 NC 组相比，oe-Wnt3a 组的 Wnt3a 和 β-catenin 表达升高（均 P <0.05)。与miR-342-5p agomir组相比，miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a组Wnt3a和β-catenin的表达上调（P <0.05)（图 1A-D）。此外，在初步实验中，测试了不同浓度miR-342-5p agomir、miR-342-5p antagomir和oe-Wnt3a处理下β-catenin的表达情况，结果显示（附加文件1：图S1 ) miR-342-5p agomir 浓度越高，β-连环蛋白表达越低； miR-342-5p antagomir 浓度越高，β-catenin 表达越高； oe-Wnt3a浓度越高，β-catenin的表达越高。

ApoE ^-/- 主动脉组织中miR-342-5p增加而Wnt3a减少 小鼠和 miR-342-5p 直接靶向 Wnt3a。 A RT-qPCR检测小鼠主动脉组织中miR-342-5p的表达。 B RT-qPCR检测小鼠主动脉组织Wnt3a mRNA的表达(n =12)。 C , D 通过蛋白质印迹分析检测小鼠主动脉组织中 Wnt3a 和 β-catenin 蛋白的表达 (n =12)。 E Wnt3a 3'-UTR 中 miR-342-5p 的结合位点。 F miR-342-5p agomir 剂量依赖性降低转染 Wnt3a 3'-UTR (N =3)。 G 转染 miR-342-5p agomir 或 scramble (N =3)。 *P <0.05 vs. 正常组， ^# P <0.05 vs. NC 组。 &P <0.05 对比 miR-342-5p agomir 组。测量数据表示为平均值 ± 标准偏差。两组之间的比较由 t 制定 -test，而多组之间的比较通过单向方差分析和 Tukey 的多重比较测试进行评估。 AS，动脉粥样硬化； NC，阴性对照

miRNA 可以通过与其信使 RNA 3'UTR 结合来抑制特定基因的翻译。生物信息学网站预测 miR-342-5p 和 Wnt3a 之间存在靶标关系（图 1E）。双荧光素酶报告基因检测报道，在 Wnt3a 3'UTR 载体转染的小鼠主动脉内皮细胞中，转染 miR-342-5p agomir 后，海肾/萤火虫荧光素酶值呈剂量依赖性降低，从 10 降至 100与 NC 组相比，pM miR-342-5p agomir 和 100 pM miR-342-5p agomir 组下降了 64%。这表明 Wnt3a 3'UTR 中存在 miR-342-5p 靶位点。然而，Wnt3a 突变组的海肾/萤火虫荧光素酶活性值未受影响（图 1F、G）。因此，可以证实Wnt3a是miR-342-5p的直接靶基因，miR-342-5p/Wnt3a可以调控AS的进展。

上调 Wnt3a 或下调 miR-342-5p 对 ApoE 中脂质水平的影响 ^-/- 老鼠

此外，为了研究miR-342-5p靶向和调节Wnt3a信号通路是否会影响AS小鼠的脂质水平，利用全自动生化分析仪观察脂质水平的变化。结果显示（图2A-D）与正常组相比，AS组TC、TG和LDL-C含量升高，HDL-C含量降低（均P <0.05)。与NC组相比，miR-342-5p agomir组TC、TG和LDL-C含量升高，HDL-C含量降低（均P <0.05），而miR-342-5p antagomir组和oe-Wnt3a组TC、TG和LDL-C含量降低，HDL-C含量升高（均P <0.05)。与miR-342-5p agomir组相比，miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a组TC、TG和LDL-C含量降低，HDL-C含量升高（均P <0.05)。这些结果表明miR-342-5p和Wnt3a对AS小鼠的血脂水平有调节作用，进一步说明了miR-342-5p和Wnt3a之间的靶向调控关系。 Wnt3a的过表达会逆转过表达的miR-342-5p对AS小鼠的影响。

上调 Wnt3a 或下调 miR-342-5p 对 ApoE ^-/- 脂质水平的影响 老鼠。 A 小鼠组血清HDL-C含量比较。 B 小鼠组血清LDL-C含量比较。 C 小鼠组血清TG含量比较。 D 小鼠组血清中TC含量的比较。 n =12.*P <0.05 vs. 正常组， ^# P <0.05 vs. NC 组。 &P <0.05 对比 miR-342-5p agomir 组。测量数据表示为平均值 ± 标准偏差。多组之间的比较通过单向方差分析和 Tukey 多重比较检验进行评估。 AS，动脉粥样硬化； NC，阴性对照

Wnt3a 过表达或 miR-342-5p 低表达对 ApoE 血清中炎症和氧化应激相关细胞因子的影响 ^-/- 老鼠

然后，通过ELISA检测AS小鼠血清中细胞因子的含量，结果报告（图3A-D）与正常组相比，IL-5、IL-12p70、IFN-γ和TNF-α增强在 AS 组中（所有 P <0.05)。与NC组相比，miR-342-5p agomir组IL-5、IL-12p70、IFN-γ和TNF-α含量升高（均P <0.05)，而 miR-342-5p antagomir 组和 oe-Wnt3a 组中 IL-5、IL-12p70、IFN-γ 和 TNF-α 含量下降（均P <0.05)。与miR-342-5p agomir组相比，miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a组的IL-5、IL-12p70、IFN-γ和TNF-α含量降低（所有P <0.05)。提示miR-342-5p靶向调控Wnt3a信号通路进一步调控AS小鼠血清中相关细胞因子水平。

Wnt3a过表达或miR-342-5p低表达对ApoE血清炎症和氧化应激相关细胞因子的影响 ^-/- 老鼠。 A 小鼠组血清IL-5含量比较。 B 小鼠组血清IL-12p70含量比较。 C 小鼠组血清中IFN-γ含量的比较。 D 小鼠组血清中TNF-α含量的比较。 E，小鼠组血清中MDA含量的比较。 F 小鼠组血清中SOD活性的比较。 n =12.*P <0.05 vs. 正常组， ^# P <0.05 vs. NC 组。 &P <0.05 对比 miR-342-5p agomir 组。测量数据表示为平均值 ± 标准偏差。多组之间的比较通过单向方差分析和 Tukey 多重比较检验进行评估。 AS，动脉粥样硬化； NC，阴性对照

此外，检测小鼠血清中MDA含量和SOD活性，结果显示（图3E、F）与正常组相比，AS组MDA含量升高，SOD活性降低（均P <0.05)。与NC组相比，miR-342-5p agomir组MDA含量增加，SOD活性降低（均P <0.05），而在miR-342-5p antagomir组和oe-Wnt3a组中MDA含量降低，SOD活性升高（均P <0.05)。与miR-342-5p agomir组相比，miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a组的MDA含量降低，SOD活性增强（均P <0.05)。因此，得出了消耗miR-342-5p和恢复Wnt3a抑制AS小鼠氧化应激的结论。

去除 miR-342-5p 或恢复 Wnt3a 对 ApoE 主动脉斑块中脂质和胶原蛋白含量的影响 ^-/- 老鼠

为了探讨miR-342-5p靶向Wnt3a对小鼠主动脉组织斑块面积的影响，进行HE染色，结果显示（图4A、B）除正常组外，其余均形成AS斑块。其他组的部分。 AS组斑块面积大，纤维帽变薄，脂质核增大，斑块内出现较多泡沫细胞和胆固醇结晶沉淀，动脉和肌层内壁增厚，斑块变厚。不稳定。 NC组的情况与AS组相似。 miR-342-5p antagomir和oe-Wnt3a组斑块面积小，动脉内膜光滑，纤维帽数量少且变薄。斑块中没有破裂，但有不同大小的泡沫细胞。胆固醇晶体分布不对称，部分钙化，平滑肌细胞和胶原纤维数量增多，斑块趋于稳定。与NC组相比，miR-342-5p agomir组斑块面积增加，AS病变加重（P <0.05) 而 miR-342-5p antagomir 组和 oe-Wnt3a 组斑块面积减少，AS 病变减少（均 P <0.05)。与miR-342-5p agomir组相比，miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a组的斑块面积减少（P <0.05).

miR-342-5p消耗或Wnt3a恢复对ApoE主动脉斑块脂质和胶原含量的影响 ^-/- 老鼠。 A 小鼠主动脉 HE 染色的结果（比例尺：50 μm）。 B 各组小鼠主动脉斑块面积比较。 C 所有小鼠组的主动脉油红 O 染色结果（比例尺：100 μm）。 D 小鼠主动脉组织脂质含量比较。 E 每组小鼠的主动脉天狼星红染色结果（比例尺：50 μm）。 F 小鼠主动脉组织胶原含量比较。 n =12. ^# P <0.05 vs. NC 组。 &P <0.05 对比 miR-342-5p agomir 组。测量数据表示为平均值 ± 标准偏差。多组之间的比较通过单向方差分析和 Tukey 多重比较检验进行评估。 AS，动脉粥样硬化； NC，阴性对照

采用油红O染色和天狼星红染色检测miR-342-5p靶向Wnt3a对小鼠主动脉组织斑块脂质含量和胶原含量的影响，结果表明（图4C-F）油红O染色显示红色脂肪和蓝色细胞核，而天狼星红色染色显示红色胶原纤维和蓝色细胞核。与NC组相比，miR-342-5p agomir组脂质含量升高，胶原含量降低，miR-342-5p antagomir组和oe-Wnt3a组脂质含量降低，胶原含量积累组（所有 P <0.05)。与miR-342-5p agomir组相比，miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a组脂质含量降低，胶原含量升高（均P <0.05)。实验结果充分说明miR-342-5p靶向调控Wnt3a信号通路对AS小鼠主动脉斑块脂质和胶原含量具有调控作用。

下调 miR-342-5p 或上调 Wnt3a 对 ApoE 主动脉斑块中巨噬细胞和平滑肌细胞的影响 ^-/- 老鼠

AS的程度与单核巨噬细胞的含量成正比[21]。 VSMC 是动脉中间层的主要细胞，对于维持动脉壁的完整性至关重要。 VSMC 参与动脉壁重建，并在不同阶段的 AS 中发挥重要作用 [22]。 α-SMA 是平滑肌细胞的特异性标志物 [23]。本研究采用巨噬细胞标记抗体（MOMA-2）标记巨噬细胞，并应用免疫组化分别检测MOMA-2和α-SMA的表达。

显微镜下MOMA-2和α-SMA免疫组化染色分别呈阳性，表明巨噬细胞和平滑肌细胞主要位于细胞质中，呈黄色至棕色。 MOMA-2免疫阳性表明巨噬细胞主要位于细胞质中，呈黄色至棕色。免疫组化结果表明，与NC组相比，miR-342-5p agomir中斑块巨噬细胞（MAMO-2）阳性染色百分比升高，阳性平滑肌细胞百分比降低（均P <0.05)。 miR-342-5p antagomir组和oe-Wnt3a组斑块巨噬细胞（MAMO-2）阳性染色百分比降低，阳性平滑肌细胞百分比增加（均为P <0.05)。与 miR-342-5p agomir 组相比，miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a 组（均 P <0.05)（图 5A-D）。提示miR-342-5p靶向调控Wnt3a信号通路可以调控AS小鼠动脉组织斑块中巨噬细胞和平滑肌细胞的聚集。

Wnt3a高表达或miR-342-5p低表达对ApoE ^-/- 主动脉斑块易损性的影响 老鼠。 A 每组小鼠中 MOMA-2 的免疫组织化学染色（比例尺：50 μm）。 B 图A的定量分析。C 每组小鼠中 α-SMA 的免疫组织化学染色（比例尺：50 μm）。 D 图C的定量分析 . E AS小鼠主动脉组织斑块易损指数的比较。 n =12. ^# P <0.05 vs. NC 组。 &P <0.05 对比 miR-342-5p agomir 组。测量数据表示为平均值 ± 标准偏差。多组之间的比较通过单向方差分析和 Tukey 多重比较检验进行评估。 AS，动脉粥样硬化； NC，阴性对照

Wnt3a 高表达或 miR-342-5p 低表达对 ApoE 主动脉斑块脆弱性的影响 ^-/- 老鼠

计算斑块脆弱性指数：（巨噬细胞阳性百分比 + 脂质阳性百分比）/（平滑肌细胞阳性百分比 + 胶原蛋白阳性百分比）。与NC组相比，miR-342-5p agomir组的斑块脆弱性指数升高（P <0.05) 并在 miR-342-5p antagomir 组和 oe-Wnt3a 组中降低（均 P <0.05)。与miR-342-5p agomir组相比，miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a组的斑块脆弱性指数降低（P <0.05)（图 5E）。简而言之，miR-342-5p靶向调控Wnt3a信号通路介导的AS小鼠动脉组织斑块易损性。

miR-342-5p 低表达或 Wnt3a 过表达对 ApoE 主动脉斑块血管生成的影响 ^-/- 老鼠

针对内皮细胞标志物 CD34 的抗体可以检测血管密度 [24]。通过免疫组织化学和蛋白质印迹。与NC组相比，miR-342-5p agomir组的MVD升高，而miR-342-5p antagomir组和oe-Wnt3a组的MVD减弱（所有P <0.05)。与miR-342-5p agomir组相比，miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a组的MVD降低（P <0.05)（图 6A-C）。总的来说，miR-342-5p靶向调控Wnt3a信号通路直接参与调控AS小鼠斑块新生血管密度。

miR-342-5p低表达或Wnt3a高表达对ApoE主动脉斑块MVD的影响 ^-/- 老鼠。 A 各组ApoE ^-/- CD34免疫组化染色 小鼠（比例尺：50 μm）。 B ApoE ^-/- 主动脉斑块MVD比较 老鼠。 C ApoE ^-/- 中CD34蛋白表达的比较 老鼠。 n =12. ^# P <0.05 vs. NC 组。 &P <0.05 对比 miR-342-5p agomir 组。测量数据表示为平均值 ± 标准偏差。多组之间的比较通过单向方差分析和 Tukey 多重比较检验进行评估。 AS，动脉粥样硬化； NC，阴性对照