恢复的 microRNA-326-5p 通过抑制脑缺血/再灌注损伤中的 STAT3 抑制神经元凋亡并减轻线粒体损伤

介绍

脑缺血/再灌注损伤(CI/RI)是继缺血性卒中后继发的一种脑损伤[1]。脑 I/R 最典型的特征是再灌注后的初始短暂性脑缺血 [2]。 CI/RI 激活神经元凋亡并导致海马和皮质损伤 [3]。目前，最常见的临床应用是溶栓治疗 CI/RI [4]。然而，再灌注会增加活性氧 (ROS) 的产生，导致细胞内 DNA 损伤、氧化应激相关损伤、蛋白质氧化和脂质过氧化，从而进一步恶化血脑屏障和水肿 [5]。因此，寻找新的有针对性的选项的紧迫性是 CI/RI 的首要任务。

MicroRNA (miRNA) 被广泛认为在 CI/RI 中具有潜在和预后作用 [6, 7]。例如，一篇文章证明 miR-202-5p 可减轻缺血性损伤大脑中动脉闭塞 (MCAO) 模型大鼠的神经元损伤和神经功能缺损，以及氧和葡萄糖剥夺 (OGD) 诱导的细胞损伤 [8] .此外，还发现 miR-98 的上调可改善 I/R 中风小鼠的神经学结果 [9]，而 miR-451 的过表达可减轻 CI/RI 小鼠的缺血性脑细胞凋亡 [10]。具体而言，miR-326-5p 对内皮祖细胞具有促血管生成能力，可改善急性心肌梗死后的心脏功能 [11]。然而，在 CI/RI 中以 miR-326-5p 为中心的研究仍处于起步阶段。信号转导和转录激活因子 (STAT) 是由 CI/RI 激活的独特蛋白质家族 [12]。在生物信息学网站上，STAT3 被预测为 miR-326-5p 的靶点；因此，我们研究了 miR-326-5p 介导的 STAT3 在 CI/RI 中的作用。 STAT3 通过释放促炎介质使缺血性神经炎症过程和继发性脑损伤恶化 [13, 14]。具体而言，Janus 激活激酶 2(JAK2)/STAT3 通路在阻断 CI/RI 诱导的细胞凋亡中发挥功能作用 [15]。 Mitofusin-2 (Mfn2) 是一种线粒体融合因子，可以防止心脑血管 I/RI [16] 并改善缺血性脑损伤中缺氧诱导的神经元凋亡 [17]。也有报道称Mfn2对CI/RI有保护作用[18]。

总之，较少深入的研究发现了 miR-326-5p 和 STAT3 在 CI/RI 中的联合作用。鉴于此，本研究假设miR-326-5p通过靶向STAT3减弱CI/RI。

材料和方法

道德声明

实验经扬州大学附属医院动物护理与使用委员会批准；扬州大学，在《扬州大学附属医院实验大鼠饲养与使用指南》下开展；扬州大学。

实验动物

来自扬州大学（中国扬州）比较医学中心的雄性成年 Sprague-Dawley 大鼠（6-8 周龄，250 ± 30 g）被饲养在特定的无病原体环境中，可以自由获取食物和水， (24 ± 1)°C，(50 ± 5)% 湿度和 12 小时光/暗循环。

细胞分离与识别

将大鼠斩首安乐死，将大脑切成1 mm ³ 配置细胞悬液，将其与0.4%台盼蓝溶液按9:1混合（台盼蓝终浓度为0.04%），用血细胞计数器计算细胞密度和存活率。细胞（1 × 10 ⁶ 细胞/mL）以5 × 10 ⁶ 接种于用L-聚赖氨酸（0.1mg/mL）预包被的细胞培养瓶中 每瓶细胞。当细胞贴壁时，将其与更新的培养基（NeurobasalA + B27 + L-谷氨酰胺）一起培养并连续培养6-7天，每2-3天换液一次。

细胞鉴定：利用大鼠皮质神经元制备神经元载玻片，与原代兔抗大鼠巢蛋白（NES）多克隆抗体（1:200），以及异硫氰酸荧光素（FITC）标记的山羊抗兔免疫球蛋白孵育G（1:50，均来自 Cell Signaling Technology，Beverly，MA，USA）。之后，用抗荧光猝灭剂密封细胞并通过荧光显微镜观察。

OGD模型建立

神经元在不含葡萄糖的厄尔氏溶液中培养，并暴露于 95% N2 和 5% CO2 的混合气体中。正压通气30分钟后，形成细胞培养的缺氧环境（体外OGD模拟缺血）。孵育 90 分钟后，除去不含葡萄糖的厄尔溶液后，将细胞与维持细胞培养基一起孵育。细胞被常规培养用于后续实验（体外氧-葡萄糖再灌注的再灌注模拟）。常氧条件下的正常培养基作为对照。

神经元被分为对照组； OGD组、阴性对照（NC）组（OGD处理的神经元转染乱序寡核苷酸）、miR-326-5p agomir组（OGD处理的神经元转染miR-326-5p agomir）、sh-STAT3组（经OGD处理的神经元转染STAT3 shRNA）和miR-326-5p agomir + 过表达（oe）-STAT3组（经OGD处理的神经元转染miR-326-5p agomir和pcDNA-STAT3载体）。寡核苷酸和载体均由GenePharma（中国上海）提供。

使用 lipofectamine 2000 (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific)，将杂乱寡核苷酸、miR-326-5p agomir、STAT3 shRNA 或 miR-326-5p agomir 和 pcDNA-STAT3 转染到原代大鼠神经元中，并通过逆转录定量检测转染效果48小时后聚合酶链反应（RT-qPCR）或蛋白质印迹。

3-(4, 5-Dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-Diphenyltetrazolium Bromide (MTT) 检测

使神经元悬浮于 1 × 10 ⁶ 细胞/mL，分别培养 0、24 和 48 小时。在无菌环境中，将神经元在 10% MTT 溶液中孵育 2-4 小时，并加入 150 μL 福曼赞溶解溶液（二甲基亚砜）直至晶体充分溶解。光密度（OD）值在酶标仪上于 570 nm 处测量。

流式细胞术凋亡检测

神经元用 0.25% 胰蛋白酶分离，以 2000 rpm 离心并重悬于 PBS 中。然后，将神经元以 2000 rpm 离心，用结合缓冲液重悬沉淀，依次与 5 μL Annexin V-FITC 和 5 μL 碘化丙啶 (PI) 孵育。流式细胞仪检测细胞凋亡率。

JC-1 线粒体膜电位检测

6孔板细胞用PBS漂洗，加入1 mL细胞培养基和1 mL JC-1染色工作液（50 μL JC-1、8 mL超纯水和2 mL JC-1染色缓冲液）（SolarbioScience ，北京，中国）并孵育 15 分钟。 1 × JC-1染色缓冲液由4 mL蒸馏水和1 mL JC-1染色缓冲液构成。孵育后，细胞被胰蛋白酶消化，重新悬浮在 JC-1 缓冲液中，并在流式细胞仪上进行测试。计算绿色荧光的相对比例。

氧化应激检测

通过 2,7-二氯荧光素二乙酸酯 (DCF-DA) 检测试剂盒 (Abcam) 测量细胞内 ROS 水平。简而言之，神经元用 0.25% 胰蛋白酶分离，重新悬浮并与 10 μm DCF-DA 孵育 30 分钟。之后，通过荧光光谱法（BD Biosciences）测量激发/发射光为495 nm/529 nm的DCF荧光。

使用商业化验试剂盒（Beyotime Biotechnology Co.，Shanghai，China）通过化学比色法检测细胞内丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性。 OD值由酶标仪测定。

大鼠模型建立

大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(50 μg/kg)麻醉。在颈部做中线切口，结扎外颈动脉，用动脉夹阻塞颈总动脉。将一根 3-0 硅酮涂层尼龙单丝缝线小心地插入颈内动脉直至耐光。短暂脑缺血90分钟后，撤线，再灌注24小时。假手术组除缝线不进入颈内动脉外接受相同处理。术中采用恒温床将直肠温度维持在37 ± 0.5℃[19]。

将大鼠分为6组（n =6），在建立MCAO模型前向侧脑室注射质粒或miR，包括sham组、MCAO组（模型大鼠）、NC组（模型大鼠侧脑室注射5 μL 乱序寡核苷酸 [100 μM]）、miR-326-5p agomir 组（模型大鼠侧脑室注射 5 μL miR-326-5p agomir [100 μM]）、sh-STAT3 组（模型大鼠侧脑室注射 5 μL STAT3 干扰载体 [100 μM]）和 miR-326-5p agomir + oe-STAT3 组（模型大鼠侧脑室注射 5 μL miR-326-5p agomir [100 μM] 和 5 μL STAT3 过表达载体 [100 μM]) [20, 21]。

标本集

对大鼠进行麻醉安乐死，心脏灌注，并获得整个大脑。将脑损伤组织切成1 × 1 × 1 mm ³ 用于石蜡切片制备、RT-qPCR、蛋白质印迹分析和线粒体膜电位检测的组织块。

检测大脑皮层线粒体膜电位

分离SD大鼠大脑皮层并切成1 mm ³ .将组织块置于 300 目尼龙网上并加入 PBS。然后将细胞悬液1000r/min离心，加入70%乙醇，再次1000r/min离心。之后，将样品重悬于 1 mL PBS 中，悬浮液（1 × 10 ⁶ 细胞（100 μL）与罗丹明 123 染料溶液（10 μL，5 μg/mL）反应，并在流式细胞仪上于 488 nm 处分析。

HE 染色

大鼠脑组织在4%多聚甲醛中浸泡24 h，制备石蜡切片，切成4 μm，铺在40 ℃水中，60 ℃烘烤。石蜡切片常规脱蜡水化，HE染色液染色。 HE染色后，受损神经元表现为细胞核收缩、细胞水肿、空泡化和细胞核变暗。使用光学显微镜（日本尼康）获得图像，存活神经元数（mm ² )的缺血皮层计数。

TUNEL 染色

石蜡切片用100%、95%、80%和70%酒精脱蜡脱水。然后，将切片浸入 4% 多聚甲醛中，然后与 0.1% Triton X-100 柠檬酸钠缓冲液孵育 20 分钟，然后将 TUNEL 反应混合物孵育 1-1.5 小时。接下来，切片用过氧化物酶溶液和二氨基联苯胺（DAB）显色，苏木精复染，梯度酒精脱水，透化，中性树胶密封。在光学显微镜下观察切片以计数TUNEL阳性细胞。细胞核内棕黄色颗粒定义为TUNEL阳性细胞（凋亡细胞）。

免疫组织化学

切片经脱蜡、水化、柠檬酸抗原回收，3% H2O2封闭内源性过氧化氢酶。每个切片加入山羊血清（50 μL），与一抗（50 μL）孵育，并与二抗（50 μL）和辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素（50 μL）反应。切片经DAB显色，苏木精复染，梯度酒精脱水，二甲苯透化，中性树胶封孔。显微镜下观察切片（缺血脑组织细胞质或细胞核呈黄色或棕黄色颗粒）。测量OD值并取平均值。

RT-qPCR

从组织和细胞中提取总 RNA 由 Trizol (Invitrogen) 进行。使用 SYBR Green PCR Mix（Applied Biosystems，CA，USA）和 QuantStudio TM 6Flex 实时 PCR 系统（Applied Biosystems）通过 qPCR 分析 mRNA 表达。特异的茎环逆转录引物和正向/反向引物（BioTNT，上海，中国）被设计用来分析 miRNA 水平。表 1 列出了所有引物。 2 ^−△△CT 方法计算miRNA或mRNA水平。

Western Blot 分析

蛋白质样品通过 10% 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并电印迹到聚偏二氟乙烯 (PVDF) 膜上。之后，PVDF 膜用含 5% 脱脂奶粉的 Tris 盐水封闭，用一抗探测，用二抗重新探测 2 h。然后，用含有 Nitroblue 四唑氯化物和 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate 的碱性磷酸酶缓冲液分析蛋白质条带，并通过 ImageJ 软件（NIH，Bethesda，MD，USA）定量。主要抗体为 STAT3 (1:1000)、Mfn2（1:1000，Abcam，MA，美国）和 3-磷酸甘油醛脱氢酶 (GAPDH)（1：1000，Cell Signaling Technology，Beverly，MA，USA）。

双荧光素酶报告基因检测

将含有 miR-326-5p 野生型（WT）或突变型（Mut）结合位点的 STAT3 3'UTR 克隆到 pmirGLO 载体（Promega，WI，USA）中，命名为 STAT3-WT 和 STAT3-Mut。细胞以2 × 10 ⁴ 接种于24孔板 细胞/孔，并用 100 ng STAT3-WT 或 STAT3-Mut 荧光素酶载体和 50 nM miR-326-5p agomir 或 it agomir NC 在 70% 汇合处共转染。使用双荧光素酶报告基因检测系统（Promega Corporation，WI，USA）测量荧光素酶活性。

统计分析

SPSS 21.0 (IBM, NY, USA) 统计软件用于数据分析。数据表示为平均值 ± 标准偏差（SD）。通过Student's t-test分析两组之间的差异，而通过单向方差分析（ANOVA）分析多重比较，然后是Tukey的事后检验。 P 代表两侧检验，P <0.05 被认为具有统计学意义。

结果

上调 miR-326-5p 或下调 STAT3 减弱 OGD 处理的皮质神经元的凋亡

培养一周，大鼠皮层神经元分化成熟。镜下神经元呈较大的神经元体，细胞质较透明，细胞核大，密度低，折射率强。神经元体呈圆锥形或圆形，树突交错排列并粘附在壁上（图1a、b）。 NES是大脑神经元的特异性化学标志物，可通过免疫荧光法定位具有高特异性的神经元。发现神经元与NES特异性结合并显示绿色荧光（图1c）。

miR-326-5p 的上调或 STAT3 的下调减弱了 OGD 处理的皮质神经元的凋亡。 一 具有二维贴壁培养的脑神经元（比例尺：100 μm）； b 7 天贴壁培养的脑神经元（比例尺：100 μm）； c NES 免疫荧光法染色的 7 天贴壁培养的脑神经元（比例尺：50 μm）； d MTT 法测定 OGD 处理的皮层神经元的活力； e 流式细胞术检测OGD处理的皮层神经元凋亡； f OGD处理的皮质神经元的凋亡率； g OGD 处理的皮质神经元中 Bcl-2 和 Bax mRNA 的表达； *P 与对照组相比<0.05； #P 与NC组相比<0.05； &P <0.05与miR-326-5p agomir组相比

MTT测定用于检测皮质神经元活力（图1d）。结果表明，与对照组和miR-326-5p agomir组相比，OGD组和miR-326-5p agomir + oe-STAT3组大鼠皮质神经元活力受损，但在miR-326-5p中增强agomir 组和 sh-STAT3 组与 NC 组（所有 P <0.05).

通过流式细胞术测定大鼠皮质神经元凋亡，而通过 RT-qPCR 测定 Bcl-2 和 Bax mRNA 表达（图 1e-g）。结果说明与对照组和miR-326-5p agomir组相比，OGD组和miR-326-5p agomir + oe-STAT3组细胞凋亡率增加，Bcl-2表达降低，Bax表达增加（所有P <0.05)。与NC组相比，miR-326-5p agomir组和sh-STAT3组细胞凋亡率降低，Bcl-2水平升高，Bax水平受到抑制（均P <0.05).

上调 miR-326-5p 或下调 STAT3 可增加 OGD 损伤后皮质神经元的 Mfn2 和线粒体膜电位水平

通过蛋白质印迹分析检测 OGD 处理的皮质神经元中的 Mfn2 表达（图 2a，b）。与对照组和miR-326-5p agomir组相比，OGD组和miR-326-5p agomir + oe-STAT3组Mfn2蛋白表达降低，而miR-326-5p agomir组和sh组Mfn2蛋白表达升高-STAT3 组与 NC 组（所有 P <0.05).

miR-326-5p 的上调或 STAT3 的下调会增加 OGD 处理的皮质神经元中的 Mfn2 和线粒体膜电位水平。 一 , b OGD 处理的皮质神经元中的 Mfn2 蛋白表达； c OGD 处理的皮质神经元线粒体膜电位水平的 JC-1 流式细胞术； d 上调 miR-326-5p 或下调 STAT3 后 OGD 处理的皮质神经元中的 ROS 含量； e 上调 miR-326-5p 或下调 STAT3 后，OGD 处理的皮质神经元中的 GSH 活性； f 上调miR-326-5p或下调STAT3后OGD处理的皮质神经元中MDA含量； g 上调 miR-326-5p 或下调 STAT3 后神经元中的 SOD 活性； *P 与对照组相比<0.05； #P 与NC组相比<0.05； &P <0.05与miR-326-5p agomir组相比

JC-1检测线粒体膜电位发现（图2c、d）相对于对照组和miR-326-5p agomir组，OGD组和miR-326-5p agomir组线粒体膜电位水平降低+ oe-STAT3组（所有P <0.05)。相对于NC组，miR-326-5p agomir组和sh-STAT3组线粒体膜电位水平升高（均P <0.05).

测定OGD处理的皮质神经元的ROS和MDA含量以及GSH和SOD活性，结果表明与对照组和miR-326-5p agomir组相比，OGD组和miR-326-5p agomir + oe -STAT3 组 ROS 和 MDA 含量增加，GSH 和 SOD 活性受损（所有 P <0.05)。与NC组相比，miR-326-5p agomir组和sh-STAT3组ROS和MDA含量降低，GSH和SOD活性增强（均P <0.05）（图2e-g）。

上调 miR-326-5p 或下调 STAT3 阻碍皮层神经元的病理损伤并抑制 CI/RI 大鼠的细胞凋亡

HE染色观察脑组织病理损伤（图3a、b），可见sham组神经元结构正常，排列整齐，胞质淡红色，细胞核蓝色，核仁清晰。在MCAO组、NC组和miR-326-5p agomir + oe-STAT3组中，观察到神经元排列紊乱，染色较深，核膜破裂，细胞结构消失，核固缩，深染色的细胞核和大量裂解。 miR-326-5p agomir组和sh-STAT3组神经元肿胀减轻，神经元排列有序，坏死细胞减少，与MCAO组和NC组相比状态更好。 <图片>

上调 miR-326-5p 或下调 STAT3 可阻止皮层神经元的病理损伤并抑制 CI/RI 大鼠的细胞凋亡。 一 HE染色观察MCAO大鼠脑组织病理损伤（比例尺：50 μm）； b 上调miR-326-5p或下调STAT3后MCAO大鼠脑组织完整神经元数量； c TUNEL染色检测MCAO大鼠脑组织神经元凋亡（比例尺：50 μm）； d 上调miR-326-5p或下调STAT3后MCAO大鼠脑组织TUNEL阳性率； e 上调miR-326-5p或下调STAT3后MCAO大鼠脑组织中Bcl-2和Bax mRNA的表达； *P <0.05 与假手术组比较； #P 与NC组相比<0.05； &P <0.05与miR-326-5p agomir组相比

TUNEL染色用于检测脑组织中的Bcl-2和Bax mRNA表达的神经元凋亡和RT-qPCR。结果显示（图3c-e）与假手术组和miR-326-5p agomir组相比，MCAO组TUNEL阳性率增加，Bcl-2 mRNA表达降低，Bax mRNA表达增加， miR-326-5p agomir + oe-STAT3组（所有P <0.05)。 miR-326-5p agomir和sh-STAT3组TUNEL阳性率和Bax mRNA表达低于NC组，Bcl-2 mRNA表达高于NC组（均P <0.05).

上调 miR-326-5p 或下调 STAT3 可增加 CI/RI 大鼠脑组织线粒体膜电位水平

采用免疫组化法检测大鼠脑组织中Mfn2蛋白表达，结果显示（图4a、b）在sham组和miR-326-5p agomir组与MCAO组和MCAO组检测到较低的Mfn2蛋白表达。 miR-326-5p agomir + oe-STAT3组，而在miR-326-5p agomir组和sh-STAT3组而不是NC组测量到更高的Mfn2蛋白表达（所有P <0.05).

上调 miR-326-5p 或下调 STAT3 会增加 CI/RI 大鼠脑组织中的线粒体膜电位水平。 一 免疫组化法检测大鼠脑组织中 Mfn2 的表达（比例尺：50 μm）； b 上调miR-326-5p或下调STAT3后MCAO大鼠脑组织中Mfn2阳性细胞数； c 上调miR-326-5p或下调STAT3后MCAO大鼠脑组织神经元线粒体跨膜电位； *P <0.05 与假手术组比较； #P 与NC组相比<0.05； &P <0.05与miR-326-5p agomir组相比

线粒体膜电位水平检测发现（图4c）与sham组和miR-326-5p agomir组相比，MCAO组和miR-326-5p agomir + oe-STAT3线粒体膜电位水平降低组，而在 miR-326-5p agomir 组和 sh-STAT3 组与 NC 组相比增加（所有 P <0.05).

miR-326-5p 目标 STAT3

通过RT-qPCR和蛋白质印迹分析检测皮质神经元和脑组织中miR-326-5p和STAT3的表达。在体外皮层神经元中，与对照组相比，OGD 组中 miR-326-5p 表达降低和 STAT3 表达增加（均P <0.05)。与NC组相比，miR-326-5p agomir组miR-326-5p表达升高，STAT3表达降低（均P <0.05)； STAT3 表达降低 (P <0.05) 在 sh-STAT3 组中。与miR-326-5p agomir组相比，miR-326-5p agomir + oe-STAT3组中STAT3表达上调（P <0.05）（图5a-c）。

miR-326-5p 靶向 STAT3。 一 miR-326-5p 和 STAT3 mRNA 在体外 OGD 处理的皮质神经元中的表达； b , c 体外 OGD 处理的皮质神经元中 STAT3 蛋白的表达； d MCAO大鼠脑组织中miR-326-5p和STAT3 mRNA的表达； e , f MCAO大鼠脑组织中STAT3蛋白表达； g 通过生物信息学软件预测miR-326-5p与STAT3的结合位点； h 双荧光素酶报告基因检测验证miR-326-5p与STAT3的靶向关系；在图a –c , *P 与对照组相比<0.05； #P 与NC组相比<0.05； &P <0.05 与 miR-326-5p agomir 组相比。在图d –f , *P <0.05 与假手术组比较； #P 与NC组相比<0.05； &P <0.05与miR-326-5p agomir组相比

在体内脑组织中，与假手术组相比，MCAO 组出现较低的 miR-326-5p 和较高的 STAT3（均P <0.05)。相对于 NC 组，miR-326-5p 表达升高而 STAT3 表达在 miR-326-5p agomir 组中降低（均P <0.05)。 sh-STAT3 组中 STAT3 表达降低 (P <0.05)。与miR-326-5p agomir组相比，miR-326-5p agomir + oe-STAT3组中STAT3表达升高（P <0.05）（图5d-f）。

DIANA 和 miRDB 软件发现了 STAT3 3'UTR 上潜在的 miR-326-5p 靶向位点（图 5g）。构建包含WT miR-326-5p结合位点和Mut结合位点的STAT3 3'UTR并将其插入到pmirGLO质粒中。通过荧光素酶报告基因测定进一步验证了 miR-326-5p 与 STAT3 3'UTR 的结合。荧光素酶报告基因检测显示 miR-326-5p agomir 降低 STAT3-WT 的相对荧光素酶活性，但不降低 STAT3-Mut（图 5h），暗示 STAT3 是 miR-326-5p 的直接靶基因。

讨论

CI/RI 是脑血管死亡的主要原因 [22]。表明 miRNA 参与 CI/RI [23]。然而，对 miR-326-5p 相关机制的全面了解在 CI/RI 中仍然不足。因此，本研究旨在揭示 miR-326-5p 在 CI/RI 中的具体作用，重点是 miR-326-5p 和 STAT3 的联合倒数。富有成效的研究表明，miR-326-5p 的上调通过抑制 STAT3 减弱 CI/RI 并提高 Mfn2 的表达。

开始时，确定 miR-326-5p 表达在体内和体外在 CI/RI 中降低。随后，我们安排了一系列检测，发现上调 miR-326-5p 可增强神经元活力和线粒体功能，提高 Mfn2 表达并抑制氧化应激和细胞凋亡。 Furthermore, in vivo experiments in rats further verified the functional roles of restored miR-326-5p in CI/RI. As a matter of fact, high miR-326 is proved to correlate with long overall survival of patients with glioblastoma, the common type of brain tumor [24]. Also, miR-326 expression has been further evidenced to reduce in Parkinson's disease and miR-326 could suppress apoptosis of dopaminergic neurons and reduce inflammatory response [25]. Except for that, the reduction in miR-326-5p is manifested in endothelial progenitor cells in the course of myocardial infarction, and introduction of endothelial progenitor cells overexpressing could promote cardiac function recovery [11]. There has been a study illustrating that up-regulation of miR-326 improves the behavioral function, enhances neuronal viability and depresses neuronal apoptosis in mice with Alzheimer's disease [26]. Furthermore, it is documented that up-regulation of miR-326 by miR-326 mimic could suppress inducible nitric oxide synthase in dopaminergic neurons in Parkinson's disease [27].

In this study, we found that STAT3 was a target gene of miR-326-5p. Supported by an advanced study, it is indicated that STAT3 expression is negatively regulated by miR-326 in human endometrial carcinoma stem cells [28]. In the present study, we measured that STAT3 expression was enhanced in CI/RI. Currently, it has been found that I/R injury and OGD would induce STAT3 expression to increase [29]. Intriguingly, STAT3 mRNA expression trends to an increment in I/R animals [30]. Additionally, STAT3 protein expression is reported to up-regulate in CI/RI [31]. Next, our study revealed that down-regulating STAT3 had the therapeutic effects on CI/RI rats and OGD-treated neurons. As supported by a study, it is concluded that miR-31 induction discourages oxidative stress by inactivation of JAK/STAT3 pathway in ischemic stroke [32]. Also, inhibition of JAK2/STAT3 pathway is beneficial to oxidative stress impairment in CI/RI [31]. Furthermore, knockdown of JAK/STAT3 pathway is identified to enhance cell viability, and reduce oxidative stress and neuron apoptosis in ischemic brain injury [33]. Lately, inhibited JAK/STAT3 signaling pathway is witnessed to relieve myocardial infarction in myocardial I/R injury [34]. As demonstrated, depleted STAT3 undermines neuronal apoptosis in rats with white matter injury [35]. Moreover, the suppression of neuronal apoptosis, and alleviation of cerebral infarct size are attributed to JAK2/STAT3 inhibition in rats with CI/RI [36].

Finally, we focused on the effects of miR-326-5p and STAT3 on Mfn2 expression and discovered that the reduced level Mfn2 in rats with CI/RI and OGD-treated neurons could be elevated by either restoring miR-326-5p or silencing STAT3. As implicated by a previous study, it is documented that Mfn2 is decreased in the lately phase of reperfusion and poorly expressed of Mfn2 exacerbates CI/RI via restrained autophagosome formation and autophagosome and lysosome fusion [18]. Additionally, Mfn2 is implied to reduce even disappear in I/R injury in old hepatocytes [37]. However, few researches have discussed the regulatory mechanism of miR-326-5p and STAT3 for Mfn2.

Conclusion

In general, this study has elucidated the mechanisms that elevated miR-326-5p inhibits neuronal apoptosis, attenuates pathological damage of neurons and increases the expression of Mfn2 via STAT3 downregulation in CI/RI. The study may update the potential mechanism of miR-326-5p and STAT3 in CI/RI. However, more studies are still needed for further development of the molecular mechanism in CI/RI.

数据和材料的可用性

不适用。

缩写

miRNAs:

MicroRNAs

STAT3:

Signal transducer and activator of transcription-3

OGD:

Oxygen and glucose deprivation

MCAO:

Middle cerebral artery occlusion

ROS：

活性氧

STAT:

Signal transducers and transcriptional activator

Mfn2:

Mitofusin-2

FITC:

Fluorescein isothiocyanate

NES:

Nestin

NC：

阴性对照

Oe:

过度表达

RT-qPCR：

逆转录定量聚合酶链反应

OD：

光密度

PI：

碘化丙啶

MDA：

Malondialchehyche

GSH:

Glutathione

SOD：

超氧化物歧化酶

DAB:

Diaminobenzidine

PVDF：

聚偏二氟乙烯

WT:

Wild-type

Mut:

Mutant

标准差：

标准差

ANOVA:

单因素方差分析