MicroRNA-326-5p 保护卒中神经元：抑制 STAT3 减少凋亡与线粒体损伤

摘要

研究已广泛探讨微小 RNA（miRNAs）在脑缺血/再灌注损伤（CI/RI）中的作用，但 miR-326-5p 在 CI/RI 中的具体机制仍不清晰。本研究旨在揭示 miR-326-5p/信号转导与转录激活因子-3（STAT3）轴在 CI/RI 中的机制。建立两种模型：原代大鼠皮质神经元氧-葡萄糖剥夺（OGD）模拟体外 CI/RI，Sprague-Dawley 大鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模拟体内 CI/RI。在 OGD 处理神经元和 MCAO 大鼠中进行功能丧失和获得实验。检测 OGD 神经元活力、凋亡、氧化应激、线粒体膜电位，及 MCAO 大鼠脑组织病理改变、凋亡、线粒体膜电位。检测 OGD 神经元和 MCAO 大鼠脑组织中线粒体融合因子-2（Mfn2）、miR-326-5p 和 STAT3 表达。结果显示：OGD 神经元和 MCAO 脑组织中 Mfn2 和 miR-326-5p 下调，STAT3 上调。miR-326-5p 靶向负向调节 STAT3 表达。恢复 miR-326-5p 或降低 STAT3 增强活力、抑制凋亡和氧化应激、提高线粒体膜电位、上调 Mfn2 表达（OGD 神经元）。上调 miR-326-5p 或下调 STAT3 改善病理改变、抑制凋亡、升高线粒体膜电位和 Mfn2 表达（MCAO 大鼠脑组织）。本研究阐明：上调 miR-326-5p 或下调 STAT3 通过上调 Mfn2 表达保护 CI/RI。

引言

脑缺血/再灌注损伤（CI/RI）是缺血性卒中后的一种脑损伤。脑缺血/再灌注最典型特征是初始短暂脑缺血后再灌注。CI/RI 激活神经元凋亡导致海马和皮质损伤。目前临床最常用溶栓治疗 CI/RI。但再灌注增加活性氧（ROS）产生，导致细胞内 DNA 损伤、氧化应激相关损伤、蛋白氧化和脂质过氧化，进一步恶化血脑屏障和水肿。因此，寻找 CI/RI 新靶向治疗方案刻不容缓。

微小 RNA（miRNAs）被广泛认为在 CI/RI 中具有潜在预后作用。例如，文献证实 miR-202-5p 减轻神经元损伤和神经功能缺损，以及 MCAO 模型大鼠缺血损伤中 OGD 诱导的细胞损伤。上调 miR-98 改善缺血/再灌注卒中小鼠神经预后；miR-451 过表达减轻 CI/RI 小鼠缺血性脑凋亡。具体而言，miR-326-5p 对内皮祖细胞有促血管生成能力，可改善急性心肌梗死后心功能。但 miR-326-5p 在 CI/RI 中的研究尚处起步阶段。信号转导与转录激活因子（STAT）是 CI/RI 激活的独特蛋白家族。生物信息学预测 STAT3 为 miR-326-5p 靶标，故研究 miR-326-5p 介导的 STAT3 在 CI/RI 中的作用。STAT3 通过释放促炎介质恶化缺血神经炎症过程和继发性脑损伤。特异性地，Janus 激活激酶 2（JAK2）/STAT3 通路在阻断 CI/RI 诱导的细胞凋亡中起功能作用。线粒体融合因子-2（Mfn2）是线粒体融合因子，可保护心脑血管缺血/再灌注损伤，改善缺血性脑损伤中缺氧诱导的神经元凋亡，也记录了 Mfn2 对 CI/RI 的保护作用。

总之，鲜有深入研究发现 miR-326-5p 和 STAT3 在 CI/RI 中的联合作用。基于此，本研究假设 miR-326-5p 通过靶向 STAT3 减轻 CI/RI 而展开。

材料与方法

伦理声明

实验经扬州大学附属医院动物护理与使用委员会批准；扬州大学，遵循扬州大学附属医院实验大鼠护理与使用指南。

实验动物

雄性成年 Sprague-Dawley 大鼠（6-8 周，250±30 g）来自扬州大学比较医学中心（扬州，中国），特定无病原体环境饲养，自由取食饮水，（24±1）°C，（50±5）%湿度，12 h 明暗循环。

细胞分离与鉴定

大鼠颈椎脱离处死，脑组织切成 1 mm³ 配制细胞悬液，与 0.4% 台盼蓝按 9:1 混合（终浓度 0.04%），血球计数板计算细胞密度和存活率。细胞（1×10⁶ cells/mL）接种于 L-聚赖氨酸（0.1 mg/mL）预包被培养瓶，每瓶 5×10⁶ 细胞。贴壁后用更新培养基（NeurobasalA+B27+L-谷氨酰胺）培养 6-7 d，每 2-3 d 换半量培养基。

细胞鉴定：大鼠皮质神经元制片，孵育一抗兔抗大鼠 Nestin (NES) 多克隆抗体（1:200）和 FITC 标记羊抗兔 IgG（1:50，均来自 Cell Signaling Technology，美国马萨诸塞）。抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜观察。

OGD 模型建立

神经元在无葡萄糖 Earle 液培养，暴露于 95% N₂+5% CO₂ 混合气体。正压通气 30 min 形成缺氧环境，细胞孵育 90 min（体外 OGD 模拟缺血）。移除无糖 Earle 液，换维持培养基常规培养（体外氧-葡萄糖再灌注模拟再灌注）。常氧常规培养基作对照。

神经元分组：对照组；OGD 组；阴性对照（NC）组（OGD 神经元转染乱序寡核苷酸）；miR-326-5p agomir 组（OGD 神经元转染 miR-326-5p agomir）；sh-STAT3 组（OGD 神经元转染 STAT3 shRNA）；miR-326-5p agomir + oe-STAT3 组（OGD 神经元共转染 miR-326-5p agomir 和 pcDNA-STAT3 载体）。寡核苷酸和载体均由 GenePharma（上海）提供。

用 Lipofectamine 2000（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific）转染乱序寡核苷酸、miR-326-5p agomir、STAT3 shRNA 或 miR-326-5p agomir+pcDNA-STAT3 入原代大鼠神经元，48 h 后 RT-qPCR 或 Western blot 检测转染效率。

MTT 法检测活力

神经元制成 1×10⁶ cells/mL 悬液培养 0、24、48 h。无菌环境下 10% MTT 孵育 2-4 h，加 150 μL 甲酰胺溶解结晶（DMSO）。酶标仪 570 nm 测光密度（OD）。

流式细胞术检测凋亡

0.25% 胰蛋白酶消化神经元，2000 rpm 离心，PBS 重悬。再次 2000 rpm 离心，沉淀用结合缓冲液重悬，依次孵育 5 μL Annexin V-FITC 和 5 μL 碘化丙啶（PI）。流式细胞仪检测凋亡率。

JC-1 检测线粒体膜电位

6 孔板细胞 PBS 洗涤，加 1 mL 培养基和 1 mL JC-1 工作液（50 μL JC-1、8 mL 超纯水、2 mL JC-1 缓冲液）（SolarbioScience，北京）孵育 15 min。1×JC-1 缓冲液：4 mL 蒸馏水+1 mL JC-1 缓冲液。孵育后胰蛋白酶消化，JC-1 缓冲液重悬，流式细胞仪 488 nm 检测，计算绿色荧光相对比例。

氧化应激检测

细胞内 ROS 用 2,7-二氯荧光素二乙酸酯（DCF-DA）检测试剂盒（Abcam）测量。简述：胰蛋白酶消化神经元，重悬，10 μM DCF-DA 孵育 30 min。荧光光谱仪（BD Biosciences）495 nm/529 nm 激发/发射光测 DCF 荧光。

细胞内丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性用商业试剂盒（Beyotime Biotechnology，上海）化学比色法测定。酶标仪测 OD 值。

大鼠模型建立

大鼠腹腔注射戊巴比妥钠（50 μg/kg）麻醉。颈部正中切开，结扎外颈动脉，动脉夹夹闭总颈动脉。3-0 硅胶包裹单丝尼龙缝线小心插入内颈动脉至感轻微阻力。短暂脑缺血 90 min 后撤出缝线，再灌注 24 h。假手术组同等处理但缝线不入内颈动脉。手术中恒温床维持直肠温度 37±0.5 °C [19]。

大鼠分 6 组（n=6），建立 MCAO 模型前侧脑室注射质粒或 miR：假手术组；MCAO 组（模型大鼠）；NC 组（模型大鼠侧脑室注射 5 μL 乱序寡核苷酸 [100 μM]）；miR-326-5p agomir 组（注射 5 μL miR-326-5p agomir [100 μM]）；sh-STAT3 组（注射 5 μL STAT3 干扰载体 [100 μM]）；miR-326-5p agomir + oe-STAT3 组（注射 5 μL miR-326-5p agomir [100 μM] + 5 μL STAT3 过表达载体 [100 μM]）[20,21]。

标本收集

大鼠麻醉处死，心脏灌注，取全脑。脑损伤组织切 1×1×1 mm³ 组织块制石蜡切片、RT-qPCR、Western blot、线粒体膜电位检测。

大脑皮层线粒体膜电位检测

SD 大鼠大脑皮层分离切 1 mm³。组织块置 300 目尼龙网，加 PBS。1000 r/min 离心，加 70% 乙醇再离心 1000 r/min。重悬 1 mL PBS，悬液（1×10⁶ 细胞，100 μL）与罗丹明 123 染料液（10 μL，5 μg/mL）反应，流式细胞仪 488 nm 分析。

HE 染色

大鼠脑组织 4% 多聚甲醛固定 24 h，制石蜡切片，4 μm 切片，40 °C 水铺展，60 °C 烘烤。常规脱蜡水合，HE 染色液染色。HE 染色后受损神经元核收缩、细胞水肿、空泡化、核深染。光学显微镜（Nikon，日本）成像，计数缺血皮层存活神经元数（个/mm²）。

TUNEL 染色

石蜡切片脱蜡，100%、95%、80%、70% 酒精梯度脱水。4% 多聚甲醛浸泡，0.1% Triton X-100 柠檬酸缓冲液孵育 20 min，TUNEL 反应混合液 1-1.5 h。过氧化物酶溶液和二氨基联苯胺（DAB）显色，苏木精复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光学显微镜观察计数 TUNEL 阳性细胞。核内棕黄颗粒定义为 TUNEL 阳性（凋亡细胞）。

免疫组化

切片脱蜡水合，柠檬酸抗原修复，3% H₂O₂ 封闭内源过氧化酶。每片加山羊血清（50 μL），孵育一抗（50 μL），反应二抗（50 μL）和辣根过氧化物酶标记链霉亲和素（50 μL）。DAB 显色，苏木精复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。显微镜观察（缺血脑组织细胞质或核呈黄/棕黄颗粒）。测定 OD 值取平均。

RT-qPCR

组织和细胞总 RNA 用 Trizol（Invitrogen）提取。SYBR Green PCR Mix（Applied Biosystems，美国加州）和 QuantStudio TM 6Flex 实时 PCR 系统（Applied Biosystems）分析 mRNA 表达。BioTNT（上海）设计特异性茎环反转录引物和正/反向引物分析 miRNA 水平。表 1 列出所有引物。采用 2^−ΔΔCT 法计算 miRNA 或 mRNA 水平。

Western Blot 分析

蛋白样品 10% SDS-PAGE 电泳，转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。5% 脱脂奶粉 Tris 缓冲盐水封闭，孵育一抗，再孵育二抗 2 h。碱性磷酸酶缓冲液含硝基蓝四氮唑氯化物和 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸显色，ImageJ 软件（NIH，美国马里兰）定量分析蛋白条带。主要抗体：STAT3（1:1000）、Mfn2（1:1000，Abcam，美国马萨诸塞）、GAPDH（1:1000，Cell Signaling Technology，美国马萨诸塞）。

双荧光素酶报告基因分析

含 miR-326-5p 野生型（WT）或突变型（Mut）结合位点的 STAT3 3'UTR 克隆入 pmirGLO 载体（Promega，美国威斯康星），命名 STAT3-WT 和 STAT3-Mut。细胞 24 孔板接种 2×10⁴ cells/well，70% 融合度时共转染 100 ng STAT3-WT 或 STAT3-Mut 荧光素酶载体和 50 nM miR-326-5p agomir 或其 agomir NC。双荧光素酶报告基因分析系统（Promega Corporation，美国威斯康星）测荧光素酶活性。

统计分析

SPSS 21.0（IBM，美国纽约）统计分析。数据表达为均值±标准差（SD）。两组比较用 Student's t 检验，多组比较用单因素方差分析（ANOVA）后接 Tukey 事后检验。P 为双侧检验，P<0.05 为统计学显著差异。

结果

上调 miR-326-5p 或下调 STAT3 减轻 OGD 处理皮质神经元凋亡

培养一周后大鼠皮质神经元分化成熟。显微镜下：神经元胞体大、胞浆透明、大核低密度、折射指数强；胞体圆锥或圆形，树突交错贴壁（图 1a、b）。NES 为脑神经元特异性化学标记，免疫荧光高特异性定位神经元。神经元特异性结合 NES 呈绿色荧光（图 1c）。

MTT 检测皮质神经元活力（图 1d）。结果：OGD 组和 miR-326-5p agomir+oe-STAT3 组活力较对照组和 miR-326-5p agomir 组受损；miR-326-5p agomir 组和 sh-STAT3 组活力较 NC 组增强（均 P<0.05）。

流式细胞术测神经元凋亡，RT-qPCR 测 Bcl-2 和 Bax mRNA 表达（图 1e-g）。对照组和 miR-326-5p agomir 组比较，OGD 组和 miR-326-5p agomir+oe-STAT3 组凋亡率升高、Bcl-2 下降、Bax 升高（均 P<0.05）。与 NC 组比，miR-326-5p agomir 组和 sh-STAT3 组凋亡率降低、Bcl-2 升高、Bax 降低（均 P<0.05）。

上调 miR-326-5p 或下调 STAT3 提高 OGD 损伤神经元 Mfn2 和线粒体膜电位

Western blot 检测 OGD 神经元 Mfn2 表达（图 2a、b）。对照组和 miR-326-5p agomir 组比，OGD 组和 miR-326-5p agomir+oe-STAT3 组 Mfn2 蛋白下调；miR-326-5p agomir 组和 sh-STAT3 组较 NC 组 Mfn2 上调（均 P<0.05）。

JC-1 测线粒体膜电位（图 2c、d）：对照组和 miR-326-5p agomir 组比，OGD 组和 miR-326-5p agomir+oe-STAT3 组线粒体膜电位下降（均 P<0.05）。较 NC 组，miR-326-5p agomir 组和 sh-STAT3 组线粒体膜电位升高（均 P<0.05）。

OGD 神经元 ROS、MDA 含量、GSH、SOD 活性测定（图 2e-g）：对照组和 miR-326-5p agomir 组比，OGD 组和 miR-326-5p agomir+oe-STAT3 组 ROS、MDA 升高、GSH、SOD 受损（均 P<0.05）。较 NC 组，miR-326-5p agomir 组和 sh-STAT3 组 ROS、MDA 降低、GSH、SOD 增强（均 P<0.05）。

上调 miR-326-5p 或下调 STAT3 减轻 CI/RI 大鼠皮质神经元病理损伤并抑制凋亡

HE 染色观察脑组织病理损伤（图 3a、b）：假手术组神经元结构正常、整齐排列、淡红胞浆、蓝核、清晰核仁。MCAO 组、NC 组、miR-326-5p agomir+oe-STAT3 组除坏死外，神经元排列紊乱、染色深、核膜破裂、细胞结构消失、核固缩、核深染、大量溶解。miR-326-5p agomir 组和 sh-STAT3 组神经元肿胀减轻、排列有序、坏死细胞减少，状态优于 MCAO 组和 NC 组。

TUNEL 染色检神经元凋亡，RT-qPCR 测脑组织 Bcl-2、Bax mRNA（图 3c-e）：假手术组和 miR-326-5p agomir 组比，MCAO 组和 miR-326-5p agomir+oe-STAT3 组 TUNEL 阳性率升高、Bcl-2 mRNA 降低、Bax mRNA 升高（均 P<0.05）。miR-326-5p agomir 组和 sh-STAT3 组 TUNEL 阳性率和 Bax mRNA 低于 NC 组，Bcl-2 mRNA 高于 NC 组（均 P<0.05）。

上调 miR-326-5p 或下调 STAT3 提高 CI/RI 大鼠脑组织线粒体膜电位

免疫组化检测大鼠脑组织 Mfn2 蛋白（图 4a、b）：假手术组和 miR-326-5p agomir 组 Mfn2 蛋白低于 MCAO 组和 miR-326-5p agomir+oe-STAT3 组；miR-326-5p agomir 组和 sh-STAT3 组 Mfn2 蛋白高于 NC 组（均 P<0.05）。

线粒体膜电位检测（图 4c）：假手术组和 miR-326-5p agomir 组比，MCAO 组和 miR-326-5p agomir+oe-STAT3 组线粒体膜电位下降；miR-326-5p agomir 组和 sh-STAT3 组较 NC 组升高（均 P<0.05）。

miR-326-5p 靶向 STAT3

RT-qPCR 和 Western blot 检测皮质神经元和脑组织 miR-326-5p 和 STAT3 表达。体外皮质神经元：OGD 组相对对照组 miR-326-5p 下降、STAT3 升高（均 P<0.05）。较 NC 组，miR-326-5p agomir 组 miR-326-5p 升高、STAT3 降低（均 P<0.05）；sh-STAT3 组 STAT3 降低（P<0.05）。较 miR-326-5p agomir 组，miR-326-5p agomir+oe-STAT3 组 STAT3 升高（P<0.05）（图 5a-c）。

体内脑组织：较假手术组，MCAO 组 miR-326-5p 降低、STAT3 升高（均 P<0.05）。较 NC 组，miR-326-5p agomir 组 miR-326-5p 升高、STAT3 降低（均 P<0.05）。sh-STAT3 组 STAT3 降低（P<0.05）。较 miR-326-5p agomir 组，miR-326-5p agomir+oe-STAT3 组 STAT3 升高（P<0.05）（图 5d-f）。

DIANA 和 miRDB 软件预测 STAT3 3'UTR 潜在 miR-326-5p 结合位点（图 5g）。构建含 WT 和 Mut miR-326-5p 结合位点的 STAT3 3'UTR 插入 pmirGLO 质粒。荧光素酶报告基因分析验证 miR-326-5p 与 STAT3 3'UTR 结合。结果：miR-326-5p agomir 降低 STAT3-WT 相对荧光素酶活性，不影响 STAT3-Mut（图 5h），证实 STAT3 为 miR-326-5p 直接靶基因。

讨论

CI/RI 是脑血管死亡主要原因。miRNAs 涉及 CI/RI，但 miR-326-5p 相关机制在 CI/RI 中理解仍不足。本研究旨在挖掘 miR-326-5p 在 CI/RI 中具体作用，重点关注 miR-326-5p 和 STAT3 互作。研究表明：上调 miR-326-5p 通过抑制 STAT3 减轻 CI/RI 并上调 Mfn2 表达。

首先确定 miR-326-5p 在 CI/RI 体内外下调。随后系列实证：上调 miR-326-5p 增强神经元活力和线粒体功能、上调 Mfn2、抑制氧化应激和凋亡。大鼠体内实验进一步验证恢复 miR-326-5p 在 CI/RI 中功能作用。事实上，高 miR-326 与胶质母细胞瘤（常见脑肿瘤）患者总生存期长相关 [24]。miR-326 在帕金森病中表达降低，miR-326 可抑制多巴胺能神经元凋亡、减少炎症反应 [25]。此外，心肌梗死过程中内皮祖细胞 miR-326-5p 降低，过表达内皮祖细胞可促进心功能恢复 [11]。有研究证实上调 miR-326 改善阿尔茨海默病小鼠行为功能、增强神经元活力、抑制神经元凋亡 [26]。文献记载 miR-326 模拟物上调 miR-326 可抑制帕金森病多巴胺能神经元诱导型一氧化氮合酶 [27]。

本研究发现 STAT3 为 miR-326-5p 靶基因。先进研究支持：人子宫内膜癌干细胞中 STAT3 表达被 miR-326 负向调节 [28]。本研究测得 CI/RI 中 STAT3 表达上调。现有研究：I/R 损伤和 OGD 诱导 STAT3 表达增加 [29]。有趣的是，I/R 动物 STAT3 mRNA 趋势性增加 [30]。此外，CI/RI 中 STAT3 蛋白上调 [31]。本研究揭示下调 STAT3 对 CI/RI 大鼠和 OGD 神经元有治疗效果。支持研究：miR-326 诱导通过灭活 JAK/STAT3 通路抑制缺血性卒中氧化应激 [32]。JAK2/STAT3 通路抑制有益于 CI/RI 氧化应激损伤 [31]。敲低 JAK/STAT3 通路增强细胞活力、减少氧化应激和神经元凋亡 [33]。近期抑制 JAK/STAT3 信号通路缓解心肌梗死心肌 I/R 损伤 [34]。耗竭 STAT3 破坏白质损伤大鼠神经元凋亡 [35]。JAK2/STAT3 抑制归因于抑制神经元凋亡、减轻脑梗死体积 [36]。

最后聚焦 miR-326-5p 和 STAT3 对 Mfn2 表达影响：CI/RI 大鼠和 OGD 神经元中降低的 Mfn2 可通过恢复 miR-326-5p 或沉默 STAT3 升高。前人研究暗示：再灌注晚期 Mfn2 下降，Mfn2 低表达通过限制自噬体形成和自噬体-溶酶体融合加重 CI/RI [18]。此外，老年肝细胞 I/R 损伤中 Mfn2 降低甚至消失 [37]。但鲜有研究讨论 miR-326-5p 和 STAT3 调节 Mfn2 机制。

结论

总之，本研究阐明：上调 miR-326-5p 通过下调 STAT3 抑制神经元凋亡、减轻神经元病理损伤、上调 Mfn2 表达，从而保护 CI/RI。研究可能更新 miR-326-5p 和 STAT3 在 CI/RI 中潜在机制认知。但仍需更多研究进一步发展 CI/RI 分子机制。