二氧化钛纳米颗粒对小鼠的潜在肝脏、大脑和胚胎毒性

背景

纳米级二氧化钛（nano-TiO2）广泛应用于食品工业。它已用于生产包衣糖果、果脯、口香糖、碳酸饮料、粉状饮料（无糖剂型或浓缩）、牛奶和乳制品以及其他食品类别 [1, 2]。食品中纳米 TiO2 的浓度高达 0.5–9 g/kg [1, 3]，许多声称不含纳米 TiO2 的食品都含有纳米 TiO2 [2]。纳米二氧化钛还广泛应用于生物医学、有机污染物处理、材料工程和化妆品等领域[4,5,6]。然而，纳米TiO2暴露的安全性尚不清楚。

研究表明，纳米二氧化钛可通过腹腔给药或吸入等多种方法进入人体后，在多个器官中富集并产生毒性[7, 8]。纳米二氧化钛可能对多种类型的细胞有毒，例如人类淋巴母细胞和肝癌细胞 [9, 10]。它可以诱导小鼠大脑神经胶质细胞发生急性应激反应，导致神经元损伤和功能障碍 [11]。暴露于纳米二氧化钛颗粒的神经元细胞系的存活率以典型的时间和剂量依赖性方式显着降低[12]。

研究揭示了这些纳米颗粒引起毒性的几种机制。纳米二氧化钛颗粒可能通过改变分子复合物的结构和细胞膜的通透性而引起遗传毒性[13,14,15]。纳米二氧化钛可能会产生氧化应激。在氧化应激期间，会产生活性氧 (ROS)，例如羟基自由基，并导致 DNA 氧化，产生 8-OHG，从而导致 DNA 复制错误和突变 [16, 17]。此外，ROS 可能诱导炎症和氧化应激与炎症之间的相互前馈​​相互作用，导致 DNA 损伤和细胞凋亡 [18, 19]。然而，关于纳米二氧化钛毒性的综合系统数据仍然有限。我们的目的是揭示纳米二氧化钛暴露对人体健康的影响和潜在机制。

在这项研究中，我们使用小鼠模型评估了纳米 TiO2 暴露的影响和潜在机制。我们的研究结果表明，纳米二氧化钛可能通过产生氧化还原失衡和基因表达紊乱，在肝、肾、脾、心、肺和脑等多个器官中富集并引起毒性。这也可能对胚胎发育造成损害。我们的研究可能为评估纳米二氧化钛暴露对人体健康的潜在风险提供数据。

方法

化学品和试剂

微米级 TiO2 (micro-TiO2) 和 5 nm 锐钛矿型 TiO2 购自 Sigma-Aldrich（中国上海），10、60 和 90 nm TiO2（锐钛矿型）购自润禾有限公司。 （上海，中国）。甲醛、硝酸、过氧化氢和肝素钠均为试剂级，购自 Sigma-Aldrich（中国上海）。磷酸盐缓冲液 (PBS)、青霉素和链霉素购自 Gibco（美国圣地亚哥）。总 RNA 提取试剂盒购自 Takara（中国大连）。活性氧检测试剂盒购自建辰有限公司（中国南京）。 Hank 溶液中的储备 TiO2 悬浮液 (1%) 在 121°C 下灭菌 30 分钟。使用前将悬浮液超声并稀释至所需浓度。

动物和模型

为了研究肝和脑毒性，从中国医科大学动物中心购买了 ICR（印记控制区）小鼠（22 ± 3 g，一半雄性和一半雌性）。所有涉及动物的实验程序均经天津科技大学伦理委员会预先批准，并按照国际实验动物护理和使用指南进行。为了研究小鼠胚胎毒性，ICR 小鼠（45 只雌性，20-35 克；15 只雄性，35-40 克）购自北京威通利华有限公司（中国北京）。所有小鼠都健康且性成熟。治疗前五天，将小鼠饲养在通风良好、12 小时光照/黑暗循环、20 ± 2 °C、60 ± 10% 相对湿度且可随意获取食物和水的房屋中的单独笼子中。

给药方案 1 设计用于一般毒性和脑毒性试验。将小鼠随机分为六组和一个额外的对照组，每组10只。每天注射一次纳米级二氧化钛（纳米二氧化钛）悬浮液（腹膜内 (i.p.)，5、10、50、100、150 和 200 毫克/公斤），持续 14 天。对照组小鼠注射生理盐水。每天观察小鼠，在研究期间没有动物死亡。在第 15 天，从眼眶窦收集血样。所有小鼠单独称重，用 2% 苯巴比妥 (60 ml/kg, i.p.) 麻醉，然后通过颈椎脱臼处死。收集所有组织样本（从皮质和海马体中分离出的脑组织）并储存在 -80°C。每个心、肝、脾、肺和肾被切成两部分。一份浸泡在 4°C 的福尔马林 (10%) 溶液中进行病理检查。另一部分储存在-20°C，用于测定钛含量。

给药方案 2 设计用于肝毒性试验。将小鼠分为三个实验组和一个对照组。纳米二氧化钛（5、10、50 毫克/千克）每天通过管饲给药一次，持续 60 天。对照组小鼠接受 0.5% CMC（羧甲基纤维素）。每天观察小鼠，在研究期间没有动物死亡。第60天，小鼠用2%苯巴比妥（60ml/kg，ip）麻醉，颈椎脱臼处死，立即取肝，电镜检查，测定ROS和脂质氧化, 以及基因表达分析。

测定靶组织中的钛含量

将一块 0.1–0.5 克冷冻组织样品切下并在室温下解冻，然后在 HNO3 (0.5 mL) 和 H2O2 (0.5 mL) 中在 160 °C 下消化。用 3% 硝酸稀释至 3 mL 后，使用电感耦合等离子体质谱 (ICP-MS) 测定溶液中钛的浓度。然后计算靶组织中的钛含量。

血液生化测试和器官/体重比的计算

通过自动生化分析仪（TBA-2000FR，Toshiba，Tokyo，Japan）分析血清样品中酶的水平。这些酶是与肝肾功能相关的生物标志物。

基于器官和身体的重量计算器官/体重比。在麻醉和处死前测量体重。从麻醉并处死的小鼠中分离器官后称重。

病理检查和透射电子显微镜

苏木精染色后，在光学显微镜下对福尔马林浸泡的肝脏或脑组织进行病理检查。对于透射电子显微镜 (TEM)，将肝组织包埋在环氧树脂 EPON 812 中，并在戊二醛和锇酸固定后切成薄至 <500 μM 的切片。切片用饱和醋酸铀溶液 (pH 3.5) 和柠檬酸铅 (pH 12) 染色 1-2 小时。染色切片进行透射电镜检查。

测定活性氧种类、代谢酶活性和神经递质水平

对于肝组织，超氧阴离子（O2 ^– ) 水平使用 XTT 确定。过氧化氢酶 (CAT) 的活性使用 240 nm 处的 OD 值确定，遵循公开的程序 [20]。脂质过氧化水平由丙二醛 (MDA) 含量按照已发表的程序 [21] 确定。

脑组织在分离后用预冷的 1% 聚乙烯聚吡咯烷酮溶液（pH 7.6 PBS 中 50 mM）匀浆。在 15,000 rpm 离心 20 分钟后收集上清液（Eppendorf 5418，Hamburg，Germany），用于随后分析超氧化物酶（SOD）、CAT、抗坏血酸过氧化物酶（APX）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）的活性。使用 NBT（硝基四唑氯化物蓝试验）测定 SOD 活性。使用试剂盒（CAT测定试剂盒，A007-2，南京建成生物工程研究所，南京，中国）测定过氧化氢酶活性。使用试剂盒（APX检测试剂盒，A123，南京建成生物工程研究所，南京，中国）测量APX的活性。使用试剂盒（GSHPx 检测试剂盒，A005，南京建成生物工程研究所，南京，中国）测定 GSHPx 活性。组成型一氧化氮合酶（cNOS）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和乙酰胆碱酯酶（ACh）的活性采用商业试剂盒（ACh 检测试剂盒，A024，南京建成生物工程研究所，南京，中国）测定。

通过在脑组织匀浆中加入 2', 7' 二氯荧光素二乙酸盐至终浓度为 10 μM 并在 37°C 下孵育 30 分钟来测定脑组织中的 ROS 水平；然后使用流式细胞术对组织进行分析。

相对 mRNA 水平的测定

使用商业试剂盒（TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit，9767，Takara，大连，中国）从肝组织样本中提取总RNA。使用随机引物逆转录合成互补DNA。使用实时定量 PCR (qPCR) 试剂盒（一步 SYBR® PrimeScript™ RT-PCR 试剂盒，PR066A，宝，大连，中国）。所有引物（表1）均合成并购自上海生工有限公司

离体胚胎毒性测试

从颈椎脱位后的雌性小鼠中分离出 8.5 个胚胎天的胚胎，然后在含有 3 mL 大鼠立即离心血清 (ICS)、微二氧化钛或纳米二氧化钛（0.0、50.0、100.0、和 200.0 μg/mL），每瓶 3 个胚胎，持续 48 小时。

为了确定微 TiO2 或纳米 TiO2 暴露时间对胚胎的影响，将胚胎在含有 3 mL 大鼠 ICS、微 TiO2 或纳米 TiO2 (200.0 μg/mL) 的 50.0 mL Hank's 溶液中培养，其中含有 3胚胎在每个瓶子中放置 16、26 和 48 小时，然后用预热的 37°C 汉克氏溶液洗涤 48 小时，并在含有 3 mL 大鼠 ICS 的 50.0 毫升汉克氏溶液中培养。

胚胎发育使用 Maele-Fabry Van 评分进行评估 [22]。在解剖显微镜下检查卵黄囊直径、胚胎冠臀长度、头部长度和身体切片的数量。根据前脑、中脑、后脑、前肢芽、后肢芽、听觉和视觉系统以及心脏的形态学变化评分来评估发育胚胎的畸形率。在胚胎第10.5天，从2只ICR小鼠中分离出10多个胚胎作为对照。

统计分析

使用 SPSS 13 (IBM, Illinois, USA) 分析数据。使用Dunnett's t分析治疗组和对照组之间的差异 测试。使用ANOVA分析组间差异。使用 LSD 和 SNK 测试分析多个样本中的两个之间的比较。使用卡方检验和秩和检验分析分类数据。如果 P <0.05，差异被认为是显着的。

结果

纳米级二氧化钛暴露后小鼠体内钛的组织分布

我们用纳米二氧化钛（腹腔注射、5、10、50、100、150 和 200 毫克/千克）处理小鼠 14 天，并测定了小鼠器官中的钛含量。结果表明，钛在用不同剂量纳米二氧化钛处理的小鼠器官中积累（图1）。积累的幅度是剂量依赖性的（图 1）。肝脏是钛含量最多的器官，其次是肾脏。钛在脾、肺、脑和心脏中的积累量大致相同（图 1）。结果表明，纳米TiO2可通过胃肠道吸收，经循环系统分布至组织，沉积于肝、肾、脾、肺、脑、心脏等器官。

钛在暴露于纳米二氧化钛的小鼠器官中积累。小鼠用纳米二氧化钛悬浮液或盐水溶液处理，如所示通过腹腔内注射每天一次，共 14 天。 * 与对照相比，P <0.05，# 与对照相比，P <0.01

纳米二氧化钛对小鼠的一般毒性

我们用不同剂量的纳米二氧化钛治疗小鼠 14 天，发现用不同剂量治疗的小鼠组的体重增加没有差异（数据未显示）。腹腔注射后，低剂量的纳米二氧化钛（5 和 10 毫克/千克）不会改变小鼠肝脏、肾脏、脾脏、肺、心脏和大脑的器官/体重比。暴露 14 天（图 2）。然而，高剂量的纳米二氧化钛（50、100、150 和 200 毫克/千克）显着增加了小鼠肝脏、肾脏、脾脏和心脏的器官/体重比，并降低了肺和脑的器官/体重比。呈剂量依赖性（图2）。

暴露于纳米二氧化钛的小鼠的器官/体重比。小鼠用纳米二氧化钛悬浮液或盐水溶液处理，如所示通过腹腔内注射每天一次，共 14 天。 * 与对照相比，P <0.05； # 与对照相比，P <0.01

较低剂量（5、10、50 和 100 毫克/千克）的纳米二氧化钛没有改变任何血液生化指标（图 3）。高剂量的纳米二氧化钛（150 至 200 毫克/千克）可提高肝功能生物标志物碱性磷酸酶 (ALP) 和丙氨酸氨基转移酶 (ALT)、白蛋白 (ALB)、亮氨酸氨基肽酶 (LAP)、丁酰胆碱酯酶 (PChe)、总胆红素 (TBIL) ) 和总蛋白 (TP) 水平（图 3）。高剂量可降低血清尿酸 (UA) 和血尿素氮 (BUN) 水平，它们是肾功能的生物标志物。他们增加血清天冬氨酸转氨酶（AST）、肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）和α-羟基丁酸脱氢酶（HBDH）水平，这些都是心肌损伤的指标（图3）。

暴露于纳米二氧化钛的小鼠血液生化指数。小鼠用纳米二氧化钛悬浮液或盐水溶液处理，如所示通过腹腔内注射每天一次，共 14 天。 * 与对照相比，P <0.05； # 与对照相比，P <0.01。 一 肝功能生物标志物的生化指标。 b 肾功能生物标志物的生化指标。 c 心肌损伤生物标志物生化指标

这些结果表明，高剂量的二氧化钛会对肝脏、肾脏、心脏等器官造成剂量依赖性的严重损害。

纳米二氧化钛对小鼠的肝毒性

我们进一步评估了纳米二氧化钛的肝毒性。使用光学显微镜，我们发现暴露于低剂量（腹腔注射 14 天，5 毫克/千克）纳米二氧化钛的小鼠肝脏没有显着变化（图 4a、b）。我们观察到明显的血管阻塞和扩张（图 4c，50 毫克/千克），嗜碱性粒细胞增加（图 4d，100 毫克/千克），肝脏部分缺血（图 4e，150 毫克/千克）和阻塞暴露于纳米二氧化钛（ip）的小鼠中心静脉（图 4f，200 毫克/千克）。

用暴露于纳米 TiO2 的纳米 TiO2 处理的小鼠肝脏的组织学。小鼠用纳米二氧化钛悬浮液或盐水溶液处理，如所示通过腹腔内注射每天一次，共 14 天。 一 控制。 b 二氧化钛，5 毫克/公斤。 c 二氧化钛，50 毫克/公斤。 d 二氧化钛，100 毫克/公斤。 e 二氧化钛，150 毫克/公斤。 f 二氧化钛，200 毫克/公斤

然而，使用 TEM，我们发现在暴露于低剂量纳米二氧化钛（灌胃 60 天，5 mg/kg）的小鼠中，肝细胞中的线粒体轻微肿胀，肝组织中存在凝聚的染色质和凋亡细胞（图. 5a, b)我们观察到用 10 mg/kg 纳米 TiO2 处理的小鼠肝细胞线粒体中的纳米 TiO2、肿胀的线粒体和肝细胞线粒体中的空泡（灌胃 60 天，图 5c）。我们进一步观察到用 50 mg/kg 纳米二氧化钛处理的小鼠肝细胞中的核仁塌陷、染色质分散、明显的细胞凋亡和/或凋亡小体（灌胃 60 天，图 5d）。结果表明纳米TiO2可导致肝细胞亚细胞和细胞水平的病理损伤。

暴露于纳米二氧化钛的小鼠肝细胞的超显微结构。小鼠用纳米 TiO2 处理，如通过每天灌胃一次，持续 60 天。对照组小鼠接受 0.5% CMC（羧甲基纤维素）。 一 对照（×8000）。 b TiO2 (5 mg/kg) (×8000)。 c TiO2 (10 mg/kg) (×10,000)。箭头表示线粒体和线粒体中的液泡。 d TiO2 (50 mg/kg) (× 10,000)

用 5 mg/kg 纳米二氧化钛处理小鼠 60 天并没有改变 ROS 的水平，例如 O ²⁻ 、H2O2、一氧化氮 (NO) 和 MDA（图 6），或肝组织中 SOD、CAT、GSHPx、MT、GST、HSP70、P53 和 TF 基因的 mRNA 水平（图 7）。用 10 或 50 毫克/千克纳米二氧化钛处理小鼠 60 天导致 O ²⁻ 水平显着增加 、H2O2、NO 和 MDA（图 6），SOD、CAT、MT、GST、HSP70、P53、TF 和 GSHPx 基因的 mRNA 水平降低，而肝脏中 CYP1A 基因的 mRNA 水平增加小鼠（图 7）。结果表明，高剂量纳米TiO2诱导氧化应激，暴露小鼠肝脏保护基因表达发生变化。

暴露于纳米二氧化钛的小鼠肝脏中的 ROS 产生率和脂质过氧化水平。小鼠用纳米 TiO2 处理，如通过每天灌胃一次，持续 60 天。对照组小鼠接受 0.5% CMC（羧甲基纤维素）。 * 与对照相比，P <0.05，标准化为总蛋白

暴露于纳米二氧化钛的小鼠肝脏中基因的相对表达水平。小鼠用纳米 TiO2 处理，如通过每天灌胃一次，持续 60 天。对照组小鼠接受 0.5% CMC（羧甲基纤维素）。 * 与对照相比，P <0.05； # 与对照相比，P <0.01，标准化为 β-肌动蛋白

纳米二氧化钛对小鼠的脑毒性

我们进一步评估了纳米二氧化钛的脑毒性。我们首先检查了暴露于纳米二氧化钛（腹腔注射 14 天）的小鼠的大脑/体重比。低剂量（5、10、50 毫克/公斤）没有改变大脑/体重的比例，而高剂量（100、150、200 毫克/公斤）显着降低了大脑/体重的比例，呈剂量依赖性方式（图2）。脑组织中Ti浓度呈剂量依赖性显着升高（图1）。

我们还使用苏木精染色检查了暴露于纳米二氧化钛（腹腔注射 14 天）的小鼠大脑的组织学变化。我们观察到低剂量的纳米二氧化钛 (50 毫克/公斤) 不会改变腹腔注射后小鼠脑组织的组织学。暴露 14 天（图 8a、b）。用 100 毫克/千克纳米二氧化钛处理小鼠导致脑组织中的神经细胞破裂和破裂（图 8c）。用 150 毫克/千克纳米二氧化钛处理小鼠导致脑组织中炎症细胞的侵袭（图 8d）。结果表明，高剂量的纳米TiO2可对脑组织造成形态学损伤，导致炎症反应。

纳米二氧化钛暴露小鼠脑组织病理变化[J].小鼠用纳米二氧化钛悬浮液或盐水溶液处理，如所示通过腹腔内注射每天一次，共 14 天。 一 控制。 b 50 毫克/公斤。 c 150 毫克/公斤。 d 200 毫克/公斤

我们确定了纳米 TiO2 对暴露于纳米 TiO2（腹腔注射 14 天）的小鼠脑组织中氧化还原状态和信号分子的影响。我们观察到低剂量 (5 mg/kg) 纳米二氧化钛没有改变 O ²⁻ 、H2O2 和 MDA 水平没有改变抗氧化酶 APX、CAT、GSHPx 和 SOD 的活性，或非酶抗氧化剂 ASA/DASA 和 GSH/GSSG 的水平。它也没有改变脑组织中的一氧化氮合酶 (NOS) 活性和 NO 水平（图 9 和 10）。更高剂量的纳米 TiO2 增加了 O ²⁻ 、H2O2 和 MDA 水平，降低抗氧化酶 APX、CAT、GSHPx 和 SOD 的活性，降低非酶抗氧化剂 ASA/DASA 和 GSH/GSSG 的水平，增加 NO 的水平和 NOS 的活性，并降低脑组织中 AchE 和血糖 (GLU) 的水平（图 9 和 10）。这些结果表明，纳米二氧化钛可能会在腹腔注射后对小鼠的大脑造成损害。曝光。

暴露于纳米二氧化钛的小鼠的脑 ASA/DASA 和 GSH/GSSG 比率。小鼠腹腔注射纳米二氧化钛悬浮液或生理盐水，每天一次，连续14天

暴露于纳米二氧化钛的小鼠大脑中 ROS、抗氧化酶、NO 信号、谷氨酸和 AchE 活性的变化。小鼠用纳米二氧化钛悬浮液或盐水溶液处理，如所示通过腹腔内注射每天一次，共 14 天。 N =10, * 与对照相比，P <0.05； # 与对照相比，P <0.01。 一 暴露于纳米 TiO2 的小鼠大脑中 ROS（O2-、H2O2 和 MDA）的变化。 b 暴露于纳米二氧化钛的小鼠大脑中抗氧化酶（SOD、CAT、APX 和 GSHPx）的变化。 c 暴露于纳米 TiO2 的小鼠大脑中 NO 信号成分（cNOS、iNOS 和 NO）的变化。 d 纳米TiO2暴露小鼠脑中谷氨酸含量和AchE活性的变化

纳米二氧化钛对离体小鼠胚胎的毒性作用

为了评估纳米二氧化钛的发育毒性，我们首先比较了体内胚胎和离体胚胎的生长发育。结果表明，离体胚胎的生长发育与体内胚胎相似（数据未显示）。因此，我们采用离体胚胎研究纳米TiO2对胚胎的毒性作用。

我们通过检查不同剂量（终浓度 0.0、50.0、100.0 和 200.0 μg/mL）和不同暴露时间的 micro-TiO2/nano-TiO2 对胚胎生长发育以及组织器官形态的影响胚胎 VXY 直径、头臀长、头长和体节数。结果表明，微量TiO2在任何剂量下均未改变这些指标（表2）。

对于不同尺寸的纳米二氧化钛，用 50.0 微克/毫升二氧化钛处理 5-10 纳米、60 纳米、90 纳米的胚胎对胚胎 VXY 直径、头臀长、头长和体节数没有影响（表 2）。较高的剂量（100.0 和 200.0 μg/mL）会降低 VXY 直径、头臀长、头长和身体部位的数量，并增加畸形率（表 2）。对于相同剂量，用不同尺寸的纳米二氧化钛、50.0 或 100 μg/mL 处理的组之间没有明显差异。用 200 μg/mL 纳米 TiO2 处理胚胎，随着纳米 TiO2 颗粒尺寸的增加，小鼠胚胎的 VXY 直径、头臀长、头长和体节数显着降低（表 2）。

用 micro-TiO2 (200.0 μg/mL) 处理小鼠胚胎 16、24 和 48 小时没有改变 VXY 直径、头臀长、头部长度和身体部分的数量（表 3）。用纳米二氧化钛（5-10 纳米和 60 纳米、90 纳米、200.0 微克/毫升）处理小鼠胚胎 16 小时也没有改变 VXY 直径、头臀长、头长和身体部分的数量（表3）。然而，用纳米二氧化钛（5-10 纳米和 60 纳米、90 纳米、200.0 微克/毫升）处理小鼠胚胎 24 和 48 小时会降低 VXY 直径、头臀长、头长、身体部分的数量，并增加了畸形率（表 3）。相同暴露时间，不同粒径纳米TiO2颗粒组间VXY直径、头臀长、头长、体节数或畸形率均无差异（表3）。

总之，这些结果表明纳米二氧化钛对小鼠胚胎的生长发育具有剂量依赖性和时间依赖性的毒性作用。纳米TiO2颗粒的大小可能会影响毒性，纳米TiO2颗粒越大，毒性越大。

讨论

纳米二氧化钛已广泛应用于工业和医药。然而，纳米二氧化钛暴露的安全性仍不清楚。在本研究中，我们使用小鼠模型研究了纳米二氧化钛的潜在毒性。我们发现纳米二氧化钛在暴露（腹腔注射）后以剂量依赖性方式积聚在小鼠的心脏、肝脏、肾脏、脾脏、肺和大脑中。高剂量的纳米二氧化钛显着增加肝脏、肾脏、脾脏和心脏的器官/体重比，并以剂量​​依赖性方式降低肺和脑的器官/体重比。此外，高剂量的纳米二氧化钛显着增加了肝功能指标 ALT、ALP、LAP、PChE、TP、ALB 和 TBIL 的水平。它们会降低作为肾功能指标的 UA 和 BUN 的水平。 Further, high doses significantly increase the activities of CK, LDH, AST, and HBDH, and significantly increase the levels of GLU, trigylceride, total cholesterol, and high-density lipoprotein. Low doses of nano-TiO2 do not change these biochemical parameters. Our data support that nano-TiO2 may be toxic and may affect the liver, kidney, heart, GLU, and lipid metabolism at high doses in a dose-dependent manner.

In the present study, we investigated the mechanism of liver toxicity of nano-TiO2. We find that high doses of nano-TiO2 may cause swelling of hepatocytes with obvious vacuoles in cells, and nuclear condensation in hepatocytes, and apoptosis and necrosis of hepatocytes in liver tissues. This is consistent with previous studies [7, 23, 24]. After the treatment of mice with high doses of nano-TiO2, we find that the levels of CAT, GSHPx, and SOD are significantly decreased, and there is nano-TiO2 in the mitochondria of hepatocytes, revealed by TEM. This is consistent with previous studies [7, 25,26,27,28] suggesting that nano-TiO2 generates excess ROS and reduces the antioxidant capacity of the cells through damaging the mitochondria. This is further supported by observation that nano-TiO2 can significantly decrease the mRNA levels of SOD, CAT, GSHPx, MT and HSP70, CYP1A1, p53, GST, and TF genes in the mouse liver. SOD, CAT, GSH PX, and MT are involved in liver cell detoxification, CYP1A1 is involved in toxic-substance metabolism and defense against invasion from harmful substances, and HSP70 and p53 are involved in repairing liver cell DNA damage [10, 29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39]. These findings support that the mechanisms for nano-TiO2 liver toxicity are damaging mitochondria, generating ROS, and causing expression disorders of protective genes.

In the present study, we investigated the mechanism of brain neurotoxicity of nano-TiO2. We find that high doses of nano-TiO2 can produce lipid peroxidation and decrease antioxidant capacity, including SOD, CAT, APX, and GSHPx activities, resulting in oxidative stress, which may damage unsaturated fatty acids and brain tissue [24, 26, 37, 40]. We observed rupture and cracking in nerve cells and the infiltration of inflammatory cells in the brain. We further found that the activities of cNOS and iNOS are increased, and NO is excessively released. Glutamic acid levels and AChe activity are decreased in the brain. This is consistent with the effect of Fe2O3 nanoparticles on olfactory bulb cells [40] and the effect of nano-TiO2 on mouse hippocampal neurons [31, 41]. Glutamate is the most abundant amino acid in excitatory neurotransmitters of the nervous system. It is critical for the brain’s development and function [42]. Acetylcholinesterase is a key enzyme for levels of acetylcholine, which is critical for the function of the peripheral and central nervous systems. Nitric oxide regulates many central nervous functions, such as synaptic plasticity, the sleep–wake cycle, and hormone secretion [43]. Therefore, nano-TiO2 may cause oxidative stress and may disrupt orders of neurochemical metabolism in brain tissue and therefore have neurotoxicity in the central nervous system.

We find that the micro-TiO2 and low doses of nano-TiO2 (5–10 nm and 60 nm and 90 nm) do not exhibit toxicity on ex vivo mouse embryos, while high doses of nano-TiO2 (100–200.0 μg/ml) exhibit toxicity on ex vivo mouse embryos, as revealed by evaluation of morphology of exposed embryos. Whole embryo culture is a useful tool to assess the developmental toxicity of chemicals [44, 45]. Previous studies show that exposure of 14-day pregnant mice to a single dose of nano-TiO2 in the nasal cavity increase the sensitivity of inflammatory response in F1 generation [46, 47]. Nano-TiO2 does not affect white pregnant Kunming mice but inhibits growth, increases the rate of stillbirth, and exhibits developmental toxicity [48]. These studies indicate the presence of the developmental and genetic toxicity of nano-TiO2. This is further supported by studies that show cleavage and oxidative damage of DNA by nano-TiO2, for example, in Zebra fish [16, 49, 50]. Additionally, another shows an increase in the sister chromatid exchange rates in Chinese hamster ovary cells [51]. Nano-TiO2 may also prevent chromosome formation during metaphase in the ovary when TiO2 concentration is high [51]. These studies consistently show that exposure to high doses of nano-TiO2 is linked with developmental and genetic toxicity. Furthermore, our data indicated that the size of nano-TiO2 particles may affect its toxicity, with the trend of increasing toxicity being associated with larger nano-TiO2 particles (Table 2).

In the current study, we found that titanium accumulates in a dose-dependent manner in the heart, liver, kidney, spleen, lung, and brain of mice after i.p. injection of nano-TiO2. This is consistent with published reports that absorption and distribution of nano-TiO2 is dependent on blood circulation. Nanoparticles can be absorbed in mesenchymal cells through being ingested by airway epithelial cells; they can then penetrate into the blood or lymph, thus gradually being distributed to the whole body [52, 53]. It is worth noting that nano-TiO2 in the abdomen cavity can be absorbed and transported to the brain by the circulatory system, and nano-TiO2 can enter directly into the central nervous system without crossing the blood–brain barrier. This is consistent with previous studies [41, 54]. Nanoparticles can also be absorbed by the terminal nerve cell in the respiratory tract and then be transferred to the ganglion through the axon, eventually entering central nervous cells [8, 55]. Nano-TiO2 can be absorbed in the nasal cavity through the olfactory epithelium, and then be transported to other parts of the brain, such as the hippocampus, through the olfactory nerve [41, 54]. Therefore, the brain may be directly exposed to nano-TiO2. Damage in the brain may be caused directly or indirectly by nano-TiO2.

结论

Ingested nano-TiO2 can be distributed to and accumulated in the heart, brain, spleen, lung, and kidney. It exhibits toxicity and causes disorders of the GLU and lipid metabolism. Nano-TiO2 causes liver and brain toxicity mainly through increasing oxidative stress, decreasing antioxidant levels, and changing the expression of the protective genes in the liver. In addition, nano-TiO2 has adverse effects on the growth and development of mouse embryos and the morphology of the tissues and organs. The size of nano-TiO2 particles may affect their toxicity, with a trend of increasing toxicity being associated with larger nano-TiO2 particles. These toxic effects are dose-dependent. Our study may provide data for the assessment of the risk of nano-TiO2 exposure on human health.

缩写

ALB:

Albumin

ALP:

Alkaline phosphatase

ALT:

Alanine aminotransferase

AST:

Aspartate aminotransferase

BUN:

Blood urea nitrogen

CK:

Creatine kinase

cNOS:

Constitutive nitric oxide synthases

HBDH:

Hydroxybutyrate dehydrogenase

ICR:

Imprinting control region

iNOS:

Inducible NOS

LAP:

Qleucine aminopeptidase

LDH:

Lactate dehydrogenase

Nano-TiO2 :

Nanoscale titanium dioxide

PChe:

Butyrylcholinesterase

ROS:

Reactive oxygen species

TBIL:

Total bilirubin

TP:

Total protein

UA:

Uric acid