厚褶菇绿色合成蛋白包被金纳米颗粒：抗菌、凋亡诱导与基因递送潜力

摘要

我们首次报道利用食用外生菌根真菌 Tricholoma crassum (厚褶菇) 绿色合成蛋白包被金纳米颗粒 (AuNPs)。AuNPs 直径 5–25 nm、形状多样，28 °C 下 1 小时内形成。UV–vis 显示特征表面等离子共振 (SPR) 峰位于 552 nm，随反应时间和 pH 移动。SEM、TEM、AFM、XRD 和 DLS 详细表征确认单分散性和天然 40 kDa 蛋白质冠层。颗粒对革兰氏阴性、阳性菌及真菌病原体 (含多药耐药菌株) 呈强效抗菌活性，并抑制孢子萌发。彗星实验揭示植物细胞剂量依赖性凋亡诱导，而 40 kDa 蛋白冠层促进高效基因递送至肉瘤 180 细胞，GFP 表达证实。溶血测试显示 20 µl mL⁻¹ 以下血液毒性可忽略，指示安全治疗窗口。发酵罐大规模生产可行，定位这些 AuNPs 为抗菌、抗癌和基因递送的多功能药剂。

背景

纳米颗粒在农业、医药和消费品中的快速应用加剧了对其安全性的关注。绿色合成利用生物体或其酶，提供环保、成本效益高的路线，消除有害化学品。丝状真菌凭借高酶分泌能力，特别擅长制备胞外金属纳米颗粒。虽然多种真菌产出金纳米颗粒 (AuNPs)，但鲜有报道描述这些颗粒上的天然蛋白冠层，而这对胶体稳定性和功能化至关重要。金纳米颗粒因不诱导耐药性且可通过增强渗透和滞留 (EPR) 效应靶向肿瘤细胞，成为治疗应用的吸引人选。蛋白包被 AuNPs 增强细胞摄取并提供药物或基因结合位点，免除了额外化学包被步骤。尽管如此，临床应用前仍须仔细评估生物相容性、细胞毒性和团聚风险。

方法

真菌、细菌与植物生长条件

Tricholoma crassum 用于纳米颗粒合成。抗菌测试用 E. coli (DH5α)、A. tumefaciens (LBA4404) 及其多药耐药衍生株，以及植物病原体 M. oryzae 和 A. solani。番茄和烟草幼苗在受控条件下生长 (28 ± 1 °C, 16:8 h 光/暗, 50 µmol m⁻² s⁻¹)。

AuNPs 合成

菌丝体在马铃薯葡萄糖肉汤 (PDB) 中 28 °C 培养 7 天。24、48 或 72 h 后，1 g 菌丝体与 10 mL 去离子水振荡 24 h (50 RPM)。滤液 (pH 5.2) 与 1 mM HAuCl₄ 混合，28 °C 黑暗搅拌 1 h。通过调节滤液 pH (3.5–9) 和反应温度 (0–100 °C) 调控颗粒尺寸和形状。改变滤液体积 (×0.5–×2) 和 Au³⁺ 浓度 (0.5–2 mM) 进一步优化合成。

表征技术

• UV–Vis 光谱 (450–750 nm) 分析 SPR。
• SEM、TEM、AFM 观察形貌和尺寸分布。
• XRD 确认晶相。
• DLS 测定水动力学尺寸。
• SDS‑PAGE 鉴定蛋白冠层。

抗菌与抗真菌测定

纸片扩散法和生长曲线法定量细菌和真菌菌株抑制。不同 AuNPs 浓度评估真菌孢子萌发。采用标准孵育和显微镜观察。

凋亡评估

烟草和番茄叶核经 AuNPs 暴露后彗星实验测定 DNA 断裂。测试不同浓度 (0–30% v/v) 和孵育时间 (15–30 min)。

肉瘤 180 细胞基因递送

质粒 pCAMBIA1302 (GFP 标记) 与 AuNPs 复合孵育肉瘤 180 细胞。GFP 表达确认成功转染。人红细胞溶血实验评估血液相容性。

结果与讨论

AuNPs 形成与光谱特征

1 小时内从淡黄变紫指示 AuNPs 形成。UV–Vis 谱显示 24 h 滤液 SPR 峰 552 nm，随延长孵育红移、升高 pH 蓝移。最佳合成在 28 °C、1 mM HAuCl₄ 下，产生单分散颗粒，稳定 >30 天。

合成参数影响

增加滤液体积或 Au³⁺ 浓度增强颜色强度和吸光度，×2 滤液轻微蓝移。高温 (75–100 °C) 产生更大、稳定性较差颗粒。光照增大颗粒尺寸并拓宽 SPR 峰。

形貌与尺寸分布

SEM 和 TEM 显示 5–22 nm AuNPs，形状从球形、菱形到六边形和三角形。AFM 确认亚 10 nm 高度，XRD 证实面心立方金，主导 {111} 衍射峰 38.23°。

抗菌活性

AuNPs 对 E. coli、A. tumefaciens 和 M. oryzae 呈剂量依赖性抑制圈。多药耐药菌株同样被抑制，显示广谱功效。生长曲线分析显示 AuNPs 处理延缓对数期并降低细胞密度。

真菌孢子萌发

增加 AuNPs 浓度渐进降低 A. solani 孢子萌发率和萌发管长度，展示抗真菌效力。

凋亡特性

彗星实验揭示 >20% AuNPs 暴露显著 DNA 损伤，而 5–10% 致凋亡可忽略。因此存在抗菌或基因递用治疗窗口，无细胞毒性。

蛋白冠层鉴定

煮沸纳米颗粒 SDS‑PAGE 显示单一 40 kDa 条带，与 T. crassum 胞外蛋白一致。蛋白外壳稳定颗粒并提供 DNA 结合位点。

基因递送与溶血

AuNP-质粒复合物在肉瘤 180 细胞实现 GFP 表达，裸质粒则否。浓度至 20 µl mL⁻¹ 溶血率 <8%，确认低血液毒性。

结论

食用外生菌根真菌 Tricholoma crassum 实现蛋白包被 AuNPs 快速绿色合成，形状多样，具备强效抗菌、凋亡诱导和基因递送性能。天然 40 kDa 蛋白冠层保证胶体稳定性和功能化，溶血数据支持安全治疗应用。发酵罐大规模生产可行，为抗菌、抗癌和纳米医药应用提供可扩展平台。