DNA四面体纳米载体增强多柔比星诱导HT-29结肠癌细胞凋亡

摘要

作为具备可修饰性和良好生物相容性优势的纳米级药物载体，DNA四面体（DNA tetra）有望提升非靶向抗癌药物抑制效率。本研究通过点击化学将多柔比星（Dox）组装至叶酸修饰DNA四面体，制备靶向抗肿瘤制剂。通过荧光成像测定细胞摄取效率；经MTT实验、细胞增殖曲线、Western blot和流式细胞术评估细胞毒性、抑制效率及机制。DNA四面体本身无细胞毒性，但显著提升细胞摄取率，促进跨膜渗透。叶酸-DNA四面体-Dox显著增强抗肿瘤效率并提高凋亡水平。具体而言，100 μM为有效浓度，6小时孵育可诱导凋亡。结论：纳米级DNA四面体是Dox安全高效的递送系统，显著增强抗癌效能。

研究背景

多柔比星（Dox）是应用最广泛的抗肿瘤药物之一，大量临床研究证实其通过抑制RNA和DNA合成，在各生长周期显著阻碍肿瘤细胞生长。既往研究显示Dox在特定浓度下有效阻滞肿瘤细胞G1期增殖并抑制转移，且有效剂量相对其他抗癌药较低。然而，Dox缺乏肿瘤细胞特异性靶向、非选择性抑制DNA/RNA合成导致严重副作用，严重限制临床应用。同时，低细胞内摄能力降低Dox在肿瘤细胞富集。因此，亟需开发高效Dox递送系统，实现特异性靶向、易封装、优异摄取能力和生物相容性。

纳米药物载体如脂质体、无机纳米颗粒可促进Dox穿透肿瘤细胞膜、提升靶向效率。但脂质体靶向性差难减轻正常细胞副作用；中空二氧化硅等无机载体体内难完全生物降解，阻碍后续药物摄取、带来潜在生物毒性。这些功能递送系统因制备复杂、纳米结构不均一、封装效率低而阻碍临床推广。作为纳米药物载体，DNA基结构如DNA四面体可通过规避带负电DNA与质膜静电排斥实现跨膜渗透。药物和靶向分子均可共价连接于DNA四面体。DNA四面体序列易吸收生物降解，避免长期滞留。富鸟嘌呤适配体药物AS1411成功递送至A549肿瘤细胞并发挥靶向抑制作用。免疫调节因子CpG和siRNA也可经DNA四面体载体递送至肿瘤细胞调节免疫应答。凭借低毒性、良好生物相容性、可调靶向性，DNA四面体展现生物安全性和Dox递送潜力。

本研究设计合成表征以Dox为抗癌药、叶酸为特异性识别分子的DNA四面体功能颗粒。考虑结肠癌细胞膜表面叶酸受体显著上调，在HT-29细胞系评估抗癌效能。具体测定细胞摄取水平、Dox诱导凋亡程度、细胞增殖抑制。

实验方法

试剂与设备

DNA寡核苷酸链购自TAKARA（大连）。DMEM培养基和胎牛血清购自Gibco（美国纽约）。青霉素和链霉素购自Beyotime（上海）。叶酸、多柔比星、MTT、琼脂糖购自Sigma-Aldrich（美国密苏里）。抗体购自Abcam（上海）。其他试剂购自国药集团化学试剂（上海）。

UV-Vis分光光度计（Thermo Evolution 201）、恒温培养箱购自Thermo Fisher（美国）；离心机（GT10-1）购自北京时代贝离心机；荧光分光光度计（UV-1800）购自岛津；共聚焦激光扫描显微镜购自徕卡；PCR仪（T100）、蛋白/核酸电泳仪购自Bio-Rad；动态光散射粒度仪购自贝克曼；96/24孔细胞培养板购自道康宁；HPLC（Agilent 1200，C18柱）购自安捷伦。

人结肠癌细胞系HT-29维持于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的DMEM中，37°C、5% CO₂、95%空气湿润环境培养。

DNA四面体合成与纯化

按图1示意流程合成，单链DNA（ssDNA）序列见图1。各ssDNA溶于0.5×TE缓冲液，UV分光光度计260 nm测定OD值，补足TE使四链浓度一致。四条ssDNA按1:1:1:1混合，终浓度1 μM，总体积100 μL。PCR仪反应条件：95°C 10 min，自然冷却至4°C。所有单链DNA经HPLC（260 nm特征吸收峰）纯化。HPLC谱图中DNA四面体保留时间快于单链，对应时刻收集产物。

图1 叶酸-DNA四面体-Dox、DNA四面体-Dox、叶酸-DNA四面体示意图。给出DNA四面体单链序列。描绘肿瘤细胞靶向、跨膜渗透、DNA插入过程。

叶酸-DNA四面体-Dox合成与表征

Dox和叶酸自由氢基经叠氮基修饰，再通过点击化学反应与ssDNA 3′-OH偶联。通过加入不同量官能团标记ssDNA，利用侧链特异性杂交可化学计量控制官能团比例。叶酸-DNA四面体合成设叶酸:DNA四面体=1:1；DNA四面体-Dox设Dox:DNA四面体=4:1；叶酸-DNA四面体-Dox设叶酸:DNA四面体:Dox=1:1:3。所有合成微摩尔级、37°C进行，4°C保存。

系列DNA四面体复合物经8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE，39% Acr-Bis）表征纯度和相对分子大小。样品与6×上样缓冲液2:1混合，110 V电泳90 min后染色分析。动态光散射（DLS）进一步测定粒径差异。

DNA四面体促进细胞摄取

比较不同偶联结构在HT-29细胞摄取率以评估递送效率。利用Dox特征荧光光谱（激发470 nm，发射590 nm）评估量化摄取效率。HT-29细胞（2×10⁵/mL）接种24孔板培养24 h。用10 μM各DNA四面体结构孵育24 h。弃液，PBS洗涤三次。4%多聚甲醛室温固定30 min，再洗三次。激光共聚焦显微镜观察发射光强度比较摄取效率。

细胞毒性与抗癌效能

MTT法评价细胞毒性与抗癌效能，MTT在DMSO中与细胞内琥珀酸脱氢酶发生氧化还原反应。HT-29细胞接种96孔板培养24 h。

DNA四面体载体细胞毒性：0-100 μM DNA四面体结构孵育24/48 h。加入100 μL MTT溶液（5 mg/mL），37°C孵育4 h。弃液，200 μL DMSO裂解溶解细胞。微量读数仪570 nm测吸光度。未处理HT-29为对照。

偶联叶酸或Dox的DNA四面体：考察稳定性、生物安全性、抑制效率；同时探究DNA四面体-Dox中Dox抗肿瘤性质是否保持。因此评价DNA四面体复合物细胞毒性和抗肿瘤效能。各复合物100 μM孵育HT-29细胞。每6 h收集样品经MTT检测评估孵育周期效应。重点关注结构差异导致的抗癌效能差别。进一步用0-200 μM叶酸-DNA四面体-Dox经MTT评估浓度效应。

Western Blot与流式细胞术

表征DNA四面体递送Dox诱导细胞凋亡：处理细胞蛋白样品热裂解，12% SDS-PAGE（100 V恒流）分离，转印至0.22 μm PVDF膜（1 h）。5%脱脂奶粉封闭1 h。PBST洗涤三次后，兔抗caspase-3一抗孵育过夜。羊抗兔IgG二抗孵育1 h，PBST洗涤后Bio-Rad蛋白成像系统成像。GAPDH作内参（表达稳定）。

流式细胞术进一步量化MTT筛选浓度和时间点的凋亡水平。HT-29细胞经抑制剂孵育后，Annexin V-PI双染法定量流式分析。

细胞增殖定量

细胞计数法量化增殖动态。100 μM叶酸-DNA四面体-Dox处理不同时间后，0.25%胰蛋白酶消化30 s，等体积完全培养基终止反应。1000 rpm离心3 min弃上清，完全培养基重悬细胞。血球计数板光镜下记录各时间点细胞数，绘制增殖曲线。

统计分析

Student's t检验（双尾、双样本等方差）判定差异显著性。P<0.05为组间显著差异。

结果

叶酸-DNA四面体-Dox制备

合成中Dox（分子量543.52）与DNA四面体不同比例混合完成负载组装，叶酸分子量441.4。图2a显示：Dox和叶酸作为单体分子量相近，DNA四面体单体与单官能团偶联物分子量大致相当。但Dox或叶酸与四面体四个顶点全偶联则分子尺寸显著增大。图2b显示：DNA四面体单体中位径<15 nm。随偶联基团增加，四面体对称结构被破坏，复合物粒径中位值显著增大。叶酸-DNA四面体-Dox中位径扩展至20 nm。

图2 不同组分DNA四面体表征。(a) 8% SDS-PAGE：左至右为DNA Marker、DNA四面体、叶酸-DNA四面体、叶酸-DNA四面体-Dox、DNA四面体-Dox。(b) DLS检测DNA四面体、叶酸-DNA四面体、叶酸-DNA四面体-Dox、DNA四面体-Dox粒径分布。

药物递送效率

不同DNA四面体结构孵育24 h后，利用荧光成像评估细胞内Dox效率。细胞内红色荧光为Dox特征荧光；DNA四面体孵育组无荧光信号（图3a）；叶酸-DNA四面体-Dox和DNA四面体-Dox组红色信号显著高于游离Dox，表明DNA四面体促进跨膜渗透及Dox-DNA四面体偶联物细胞内稳定性显著增强摄取效率。

图3 HT-29细胞不同复合物孵育24 h摄取效率。(a) 共聚焦显微镜（红色为Dox激发荧光，比例尺10 μm）。(b) 细胞荧光强度定量。**P<0.05 vs DNA四面体组。

荧光强度定量分析（图3b）佐证直观结果。叶酸-DNA四面体-Dox与DNA四面体-Dox间无显著差异（P<0.05）。药物-细胞共孵育方法阻碍叶酸靶向能力完全展现。高浓度下确证叶酸受体特异识别，理论上在体内复杂循环系统中靶向优势更显著。简言之，DNA四面体递送保障了Dox抗癌效能。

细胞毒性与抗癌效能

首先MTT检测不同浓度DNA四面体共孵育HT-29细胞活力。0-100 μM、24/48 h下DNA四面体无明显细胞毒性（图4a），确证纳米DNA四面体提供生物安全药物载体平台。

图4 Dox复合物与DNA四面体对HT-29细胞毒性和抗肿瘤效能。(a) HT-29细胞孵育不同浓度DNA四面体24/48 h活力。(b) 100 μM Dox复合物抗肿瘤效能。(c) HT-29细胞孵育不同浓度叶酸-DNA四面体-Dox 24/48 h活力。

其次，因Dox递送效率差异，叶酸-DNA四面体-Dox和DNA四面体-Dox在48 h内展现更显著抑制效率（图4b）。缺乏有效抗癌成分，叶酸-DNA四面体48 h共孵育致活力微降（<10%）。游离Dox因难穿透膜，诱导活力下降低于其他组。特别地，叶酸-DNA四面体-Dox在孵育6 h后呈现更早显著活力下降，证明叶酸靶向助药物定位膜面、使Dox更及时生效。对比DNA四面体-Dox在12 h后才显现明显效果，凸显靶向基团重要性。

进一步，HT-29细胞经0-200 μM叶酸-DNA四面体-Dox处理检测有效浓度（图4c）。细胞活随浓度升高（0-100 μM）快速下降，但100-200 μM间无显著差异，表明叶酸-DNA四面体-Dox呈剂量依赖性，100 μM为抗肿瘤有效浓度。此外，10、20、50 μM组24至48 h活力显著变化，表明孵育时间也影响抗癌效能。

叶酸-DNA四面体-Dox诱导凋亡

Western blot（图5a）显示：叶酸-DNA四面体-Dox和DNA四面体-Dox显著上调caspase-3表达，证实凋亡为Dox诱导细胞死亡主途径。

图5 不同复合物处理后细胞凋亡相关caspase-3表达 (a) 及HT-29细胞孵育DNA四面体、Dox、DNA四面体-Dox、叶酸-DNA四面体-Dox后流式细胞术 (b-e)。

流式细胞术（图5b-e）进一步证实：100 μM叶酸-DNA四面体-Dox孵育6 h诱导68.7%凋亡。同条件下游离Dox和DNA四面体-Dox诱导凋亡仅32.8%和60.5%。

细胞增殖抑制

基于MTT，100 μM为凋亡诱导有效浓度，选用于增殖实验。细胞增殖曲线（图6）显示：因细胞摄取耗时，共孵育早期增殖抑制不完全。叶酸-DNA四面体-Dox孵育超6 h后呈现显著抑制效应，证明存在DNA四面体增强内吞作用。而6 h与图4b检测有效时间窗一致。

图6 100 μM叶酸-DNA四面体-Dox不同时间孵育诱导的细胞增殖抑制曲线。

讨论

作为DNA修饰常用手段，点击化学具高反应效率、良好可控性、操作简便优势。电泳图单一条带（图2a）表明点击化学共价偶联获得高纯度产物。Dox荧光特性使其体内外可追踪；肿瘤细胞内荧光间接证明叶酸-DNA四面体-Dox跨膜渗透过程稳定性。因此该复合物具备生物医学应用能力与稳定性。

DNA四面体具备将药物递送入细胞能力。本研究所有DNA序列不编码遗传信息，所有检测均未见基因表达和细胞代谢副作用。鉴于肿瘤细胞表面叶酸受体高表达，选叶酸为靶向分子增强DNA四面体复合物摄取效率。但DNA四面体较高浓度下，叶酸受体靶向优势体外未充分体现。因此体内应用中，叶酸有望在复杂循环系统增强靶向效率。

当前抗癌药常带意外副作用，增强肿瘤靶向能力和递送效率研究成热点。既往研究显示DNA四面体载药能力基于良好相容性。DNA四面体是具良好修饰性和生物相容性的人工容器。本研究成功偶联Dox和叶酸于DNA四面体，获得满意抑制效果并导致HT-29显著凋亡。得益于DNA四面体可修饰偶联药物和靶向分子，实现肿瘤细胞局部药物浓度富集。上述结果证实DNA四面体递送对肿瘤细胞良好识别及相应增强抑制效果，该纳米药物递送系统可更广泛应用。

结论

作为新开发药物递送策略，纳米DNA结构具低成本、高稳定性、易合成优势；因无外源免疫活性具生物安全性。DNA四面体偶联策略促进Dox靶向递送，增强其对结肠癌细胞抗癌效能，为药物设计提供有前景的启示和思路。