使用纳米尺寸的苯二胺薄膜提高电流传感器的选择性

背景

生物传感器是新颖的分析设备；其用途是色谱法、光谱法和比色法的替代品。与这些传统方法相比，生物传感器更便宜且更易于使用，但是，在分析特性方面往往不如它们。目前，生物传感领域的研究正在积极进行中[1]。

根据国际基础和应用化学研究人员协会的经典定义，生物传感器是一种基于受体和换能器的集成装置，能够利用生物识别元件进行定量或半定量分析[2]。根据换能器的类型，生物传感器分为几组（电化学、光学、压电等），其中电化学生物传感器是最大的一组，依次分为电流式、电位式、电导式和阻抗式 [3] .

生物传感器的重要分析特性之一是它们的选择性，即仅识别目标化合物的能力。生物传感器的选择性由生物材料的选择性和换能器的选择性决定。基本上，在电化学生物传感器中用作生物材料的酶和抗体具有很高的选择性，而用作传感器的电极则是非选择性的。在处理真实生物体液或其他复杂样品时，生物传感器的选择性尤为重要；因此，其研究是生物传感器发展的必要阶段。

在血清、尿液、脑脊液等中，有干扰物质会在换能器表面发生化学反应，从而导致生物传感器对目标物质的测量结果错误。生物样品中的主要干扰物为抗坏血酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、尿酸、多巴胺、谷胱甘肽等，其在人血清中的浓度见表1。

有两种主要的方法可以防止电极表面干扰物质的氧化——通过将额外物质引入生物选择性膜或沉积额外的半透膜来降低工作电位，这允许目标物质选择性地进入电极表面。 4]。半透膜的沉积方法简单，对生物传感器的功能影响较小。

在生物传感器中，过氧化氢在电极上氧化或还原，从而产生生物传感器信号。因此，一个实际的问题是开发纳米多孔薄膜，它可以渗透过氧化氢并阻止其他物质的渗透。在这些膜中，基于苯二胺（PD）的聚合物膜引起了相当多的关注[5]。基于聚苯二胺（PPD）的膜具有纳米孔；它们的大小足以使低分子量化合物（包括过氧化氢）通过膜渗透到电极表面。另一方面，该膜不允许较大物质如抗坏血酸或多巴胺通过或氧化。因此，该膜提高了对过氧化氢的选择性，进而提高了生物传感器的准确性。在几项工作中，研究了不同的 PD 异构体和 PD 聚合方法。特别是，在创建基于葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶和谷氨酸氧化酶的生物传感器时，通过在恒定电位 (+ 0.7 V) 下电沉积在镀钌碳纤维微电极上形成 PPD 膜 [6]。测试了三种PD异构体；间位异构体的结果最好。由于对抗坏血酸的某些敏感性仍然存在，因此添加抗坏血酸氧化酶以完全消除它。在 [7] 中，作者通过 CV 或恒电位安培法研究了沉积在 Pt-Ir 圆柱体上的 PPD 膜。基于在恒定电位氧化的间位和邻位异构体的膜，对抗坏血酸的敏感性显着降低，而对过氧化氢的敏感性仅降低 10%。用沉积在钯圆盘电极上的 PPD 膜获得的结果完全不同 [8]。 m的电沉积 -与m相比，CV的PD导致过氧化氢渗透性高三倍的薄膜的形成 -PD 在恒定电位下氧化。因此，m 在所有异构体中，-PD 被证明是优选的。最近报道的使用 CV 沉积 o 的过氧化氢传感器 带有 Au 纳米粒子的 -PD 薄膜 [9] 表现出良好的避免干扰效应。一般可以得出m -PD 在所有电极上都优于其他电极，而 PD 聚合过程应在每个特定情况下进行优化。此外，基于 PD 的膜也可用于没有生物元件的传感器。最近的研究表明，基于PD和其他芳香族化合物的共轭共聚物的传感器可以检测牛血清白蛋白（观察到与共聚物结合后蛋白质荧光的猝灭）[10]。

因此，目前工作的目的是比较 m 的不同方法 -苯二胺沉积并选择铂圆盘电极上PPD形成的最佳工艺。

方法

材料

抗坏血酸、半胱氨酸、尿酸、多巴胺、过氧化氢、m -苯二胺和 HEPES 购自 Sigma-Aldrich Chemie（美国）。所有其他化学品均为 p.a.等级。

人血清样本来自Kyiv Municipal Science and Practical Centre of Nephrology and Hemodialysis（乌克兰）。

电流传感器的设计

在这项工作中，自制的铂圆盘电极用作电流传感器。直径 0.4 毫米、长 3 毫米的铂丝密封在外径为 3.5 毫米的玻璃毛细管的一端。导线的开口端是换能器的工作面。铂丝的内端用伍德合金焊接到毛细管内的银丝的一端；它的另一端连接到恒电位仪。电极反复使用；使用前，其工作表面用盐酸处理30秒，用乙醇清洗，用砂纸P1500 PS 8A研磨。

测量方法

样品的 UV-vis 吸收光谱在 Thermo Evolution 600 光谱仪上使用积分球在 200-900 nm 波长范围内以漫反射模式测量。 Spectralon漫反射标准品和铂盘作为m的空白样品 -苯二胺粉末和Pt电极表面的PPD层。

对于电化学测量，工作电极被放置在经典的电化学电池中，辅助（铂丝）和参考（饱和 KCl 中的 Ag/AgCl）电极连接到 PalmSens 恒电位仪（Palm Instruments BV，荷兰）。使用八通道多路复用器（来自同一生产商），连接到恒电位仪，允许同时监测来自八个电极的信号；然而，在我们的工作中，由于工作单元尺寸小，我们通常使用三个电极。

计时电流测量（“电流检测”技术）在室温下在开放的 3-mL 玻璃池中进行，通过磁力搅拌器进行永久搅拌，并在相对于 Ag/AgCl 参比电极的 0.6 V 恒定电位下进行。在所有实验中，10 毫摩尔 HEPES，pH 7.4，用作工作缓冲液。工作细胞中的底物浓度通过添加等份的储备溶液（50 mM 过氧化氢、20 mM 抗坏血酸、3 mM 半胱氨酸、4.5 mM 尿酸、2.1 mM 多巴胺）获得。在实验前准备新的溶液。除尿酸外的所有电活性物质都溶解在工作缓冲液中；由于其溶解度小，将尿酸溶解在含有 5 mM NaBrO3 的蒸馏水中。苯二胺溶解在 40 mM 磷酸盐缓冲液中，pH 7.4。

循环伏安法在同一测量池中进行，无需搅拌。起始电位为 0 V，最终电位 +0.9 V，扫描速率（电位变化率）20 mV/s，电位变化步长 5 mV。

所有实验均重复进行 3 次。表中数据为实验平均值±标准差，采用OriginLab OriginPro 8.5程序计算。

结果与讨论

为了确定在电流换能器上沉积附加膜以提高其对过氧化氢的选择性的原因，有必要验证该换能器对可能干扰物的灵敏度和选择性。

生物传感器可用于测量未稀释和稀释的样品。稀释的选择取决于待分析物质的浓度和生物传感器的灵敏度：如果生物传感器可以在比样品中实际浓度低几十倍的浓度下识别目标物质，则应稀释后者以降低浓度。干扰物含量，从而提高阵列精度。此外，它允许测量所需的基板体积减少数十倍。

有时被分析物质的浓度太低，或者由于技术原因不需要稀释。为了更好地理解电流传感器的功能，使用了三种浓度的电活性材料：(1) 与血清相关，(2) 比 (1) 低 20 倍，即 20 倍稀释，以及 (3) 100-倍稀释。在 PPD 薄膜沉积之前使用裸换能器接收对三种浓度电活性物质的生物传感器响应，并计算换能器灵敏度（表 2）。如图所示，对多巴胺和抗坏血酸的敏感性最高，对半胱氨酸的敏感性最低。然而，抗坏血酸和尿酸可被视为主要干扰物，因为它们在生物样品中的浓度基本上较高。传感器对这些物质的响应比对目标物质过氧化氢的响应大一个数量级。因此，由于干扰物的显着影响，裸换能器不适用于生物样品中的测量。另一方面，稀释 100 倍后，对半胱氨酸和多巴胺的响应变得可以忽略不计，对所有干扰物的响应总计仅为对过氧化氢响应的 20% 左右，这意味着在某些情况下，传感器可以无需额外修改即可使用。

目前，关于在换能器上沉积 PPD 膜的方法只有零散的信息。因此，在下一阶段的工作中，将评估两种最常见和最有前途的方法哪种更可行。

在第一种方法中，通过使用不同电位（循环伏安法）对单体苯二胺分子进行电聚合，将 PPD 膜沉积在铂圆盘电极的表面上。将带有参比电极和辅助电极的换能器置于装有苯二胺溶液的工作池中，并获得了许多循环伏安图 [7]。实验的一个例子如图 1 所示。在第一个循环伏安图 (CVA) 期间，由于苯二胺氧化，在 0.5 到 0.9 V 的电位下观察到电流显着增加。在第二次和随后的 CVA 期间，电流显着下降，表明电聚合速度较低。然而，正如下面的实验表明，PPD膜的形成持续了整个CV。

换能器表面苯二胺电聚合得到的循环伏安图

PPD 膜沉积的第二种方法包括在固定时间（40 分钟）内以 + 0.7 V 的恒定电位氧化苯二胺 [11]。使用两种沉积方法时换能器响应的比较显示在表 3 中。此后，对没有 PPD 膜的电活性物质的响应被视为 100%。通过两种方法沉积的膜非常有效地阻止了干扰物 - 仅观察到对半胱氨酸的弱敏感性。另一方面，伏安法后传感器对过氧化氢的灵敏度增加了 2.6 倍。这可以通过伏安法期间的铂电激活来解释，但不能通过 PPD 膜的影响来解释。在不含苯二胺的磷酸盐缓冲液中获得循环伏安图后，也观察到这种对过氧化氢敏感性的增加。在恒定电位下的膜沉积后，没有显示出电激活，并且对过氧化氢的反应没有改变。因此，由于三个原因，循环伏安法的使用被证明是更可取的——一次沉积的时间更短（20 分钟 vs. 40 分钟）、更有效地阻碍半胱氨酸以及增加对过氧化氢的反应。

然而，循环伏安法有一个缺点——伏安图只能在一个电极上同时获得（即使使用多路复用器），而在恒定电位下的膜沉积允许同时连接 8-16 个工作电极（取决于多路复用器类型）。因此，进一步的工作应侧重于循环伏安图条件的优化，以减少换能器预处理的时间。

CV 和恒电位安培法的 PD 电聚合应该通过相当复杂的机制通过不同的途径发生 [12]。因此，CV 涉及高施加电位，这导致产生较少共轭的 PD 低聚物。因此，假设在通过 CV 进行 PD 聚合时，与恒定电位下的聚合相比，孔隙更大，PPD 层渗透率更高 [8, 13]。然而，正如“背景”部分所述，不同的作者对 PD 沉积的优先方法得出了相互矛盾的结论，并且在许多情况下，CV 给出了良好的结果。在我们看来，CV 和恒电位安培法都可以提供具有良好渗透选择特性的 PPD 膜的生成，并且需要针对每个特定情况进行优化。

PPD 膜在电极表面清晰可见，呈均匀透明的金棕色薄膜。为了确认它确实是 PPD，还通过光谱学证实了 PD 聚合。薄膜的 UV-vis 漫反射光谱（图 2）在 222 和 315 nm 处显示出强烈的吸收带，类似于单体的吸收带并与芳环中的电子跃迁有关 [14]，而无特征的吸收带在 400–800 nm 处，随着波长不断减小，与 π 有关 − π * 导电PPD聚合物高共轭芳香体系中的电子跃迁。

m的紫外可见漫反射光谱 -苯二胺和PPD膜，在Pt电极上形成

为了更好地解释所获得的结果，估计由不同方法生产的 PPD 膜中孔的大小将是有用的。然而，直接测定 PPD 膜的孔径几乎是不可能的，因为膜由多层 PD 组成，底层的孔可以有不同的大小。 Killoran 和 O'Neill 从 m 确定有效膜的厚度 -PD 为 15 nm，由 del Valle 等人估计的一种低聚聚合物链的横截面积。是 1 nm [7, 15]。因此，PPD 膜包含大约 15 层聚合物。由于 PPD 膜具有疏水和隔离特性，因此膜应具有延伸到电极表面并允许过氧化氢分子通过的穿孔纳米孔，否则 H2O2 不能被氧化并产生电流信号。孔隙肯定是不均匀的，孔隙的最小直径应该小于1纳米，以排斥电活性分子，因此即使使用电子或原子力显微镜也很难分析孔隙。由于这些技术原因，通过评估不同分子的膜渗透性来估计 PPD 膜的有效性要容易得多。这种间接方法很普遍，可以比较不同膜的实际特性。

测试了使用不同数量的循环伏安图沉积的 PPD 膜的有效性（图 3）。

不同数量CVAs沉积PPD膜的效率

一张CVA沉积的PPD膜显然不足以消除干扰物的影响。然而，在这里，铂电活化的效果最强。随着伏安数的进一步增加，对干扰物的响应降低，但同时换能器对过氧化氢的灵敏度也降低，这可能是由于 PPD 层太厚，阻碍了物质的扩散。三个 CVA 足以完全消除对多巴胺和尿酸的反应，并显着降低对抗坏血酸和半胱氨酸的反应。因此，取3个CVA为最佳，并增加苯二胺浓度直至完全消除干扰影响（图4）。

不同苯二胺浓度下PPD膜的沉积效率

值得注意的是，使用 5 mM 苯二胺足以消除对样品稀释后残留的小浓度干扰物的响应，但不足以处理未稀释的样品。苯二胺浓度增加到 20 mM 和三个 CVA 证明足以完全消除半胱氨酸的影响，并将抗坏血酸的反应降低到最低水平（对没有 PPD 膜的抗坏血酸的反应的 0.1%）。使用更高（高达 100 mM）苯二胺浓度导致传感器对过氧化氢的灵敏度降低两倍，这可能是因为 PPD 层太厚。因此，在 30 mM 苯二胺中使用三个 CVA 沉积 PPD 膜是最佳程序。由于一个伏安图持续约 2 分钟，因此在一个传感器上的膜沉积需要 6 分钟。

接下来，研究了 PPD 膜的稳定性。在 PPD 膜沉积后，将传感器置于工作缓冲液中 2 小时，并测量对过氧化氢、抗坏血酸和半胱氨酸的响应以评估膜选择性渗透率的变化（图 5）。发现在工作期间对过氧化氢的反应略有增加，而对干扰物的小反应变得更小。可能是因为抗坏血酸和半胱氨酸逐渐堵塞了 PPD 层中的几个大孔。该实验表明，在使用 PPD 膜时，其对过氧化氢的选择性至少在 2 小时内没有显着损失。

PPD 膜在 2 小时内的稳定性。对三种物质的响应归一化为 PPD 沉积后对相应物质的初始响应

研究了 PPD 膜的储存稳定性。带有沉积 PPD 膜的传感器在 - 18°C 下干燥储存 8 天；定期解冻传感器并测量对过氧化氢、抗坏血酸和半胱氨酸的响应（图 6）。在此期间，传感器对过氧化氢的灵敏度提高了 2.5 倍；对抗坏血酸和半胱氨酸的敏感性没有改变。这种效应可以通过 PPD 膜的缓慢溶胀来解释，这导致过氧化氢通过 PPD 层的扩散得到改善。

PPD 膜的储存稳定性。在第一天将反应标准化为对 H2O2 的反应

最后，在分析真实生物样品时验证了 PPD 膜的有效性。由于存在电活性化合物，没有膜的换能器在将血清添加到工作细胞后显示出微弱的信号。然而，在膜沉积之后，没有获得响应。用神经元的裂解物获得了类似的结果。这些实验表明，所开发的在铂圆盘电极上沉积 PPD 的方法是有效的，并且改进后的换能器可用于处理复杂的生物样品。

将本工作中开发的 PPD 沉积方法与之前报道的方法进行比较（表 4）很有用。

可见，所提出的方法是最快的一种方法，所得膜的阻隔性能优于或至少不差于其他PPD膜。

结论

我们研究了半透性聚苯二胺基膜的沉积条件，旨在减少干扰物质对生物传感器操作的影响。结果表明，与恒定电位下的电聚合相比，通过循环伏安法进行的苯二胺电聚合更容易并提供更好的膜性能。研究了 PPD 膜有效性对循环伏安图数量和苯二胺浓度的依赖性。结果表明，在 30 mM 苯二胺中使用三个循环伏安图可以完全消除干扰物质对传感器操作的影响。另一方面，当处理稀释的样品时，即较低浓度的电活性物质时，将苯二胺浓度降低到 5 mM 是合理的，由于 PPD 层较薄，这会导致传感器对过氧化氢的敏感性更高。 PPD 膜可以在连续运行至少 2 小时期间不会显着降低其对过氧化氢的选择性，并且可以储存至少 8 天。结果表明，带有PPD膜的换能器对生物样品中存在的电活性物质不敏感，可用于生物传感器的构建。