PS-PPO-PNIPAM杂化纳米颗粒高效摄取氯化e6与增强能量转移

摘要

掺杂二苯并恶唑（PPO）的聚苯乙烯（PS）纳米颗粒，外覆交联聚N-异丙基丙烯酰胺（PNIPAM）壳层，形成PS-PPO-PNIPAM杂化纳米系统（NS）。荧光研究表明，添加氯化e₆后，PS核心和嵌入PPO向氯化e₆受体均发生高效电子激发能量转移（EEET）。EEET效率在氯化e₆添加后首小时内急剧增加，表明PNIPAM在此期间持续摄取致敏剂。将PS-PPO-PNIPAM-氯化e₆ NS从21 °C加热至39 °C进一步增强EEET，符合PNIPAM网络热致塌缩缩短给体-受体距离。尽管如此，仅有适度比例游离氯化e₆与PNIPAM结合，提示仍需进一步优化。

研究背景

光动力疗法（PDT）治疗癌症的主要局限是激发光在组织中穿透浅。X射线驱动光动力疗法（X-PDT）提供解决方案，X射线深穿透并能激活生成单线态氧的致敏剂。X-PDT关键在于闪烁组分与致敏剂间高效电子激发能量转移（EEET）。维持最佳给体-受体邻近策略包括化学共轭、静电吸引、表面活性剂层或聚合物壳层。前期工作我们考察了PS-PPO-氯化e₆纳米颗粒中EEET，其中氯化e₆通过十二烷基硫酸钠壳层连接PS-PPO。

聚N-异丙基丙烯酰胺（PNIPAM）是刺激响应聚合物，低临界溶解温度（LCST）32 °C以上发生构象转变，变得更疏水并收缩。交联PNIPAM的LCST更高，允许生理温度下温度驱动尺寸变化。我们制备了交联PNIPAM壳层包裹的PS-PPO纳米颗粒，得PS-PPO-PNIPAM杂化NS。研究该壳层能否锚定氯化e₆，以及PNIPAM温度依赖塌缩能否缩短给体-受体距离，从而增强EEET和肿瘤细胞杀伤功效。

实验部分

材料

苯乙烯（ST，乌克兰）p.a.级，聚合前标准纯化。N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM，Sigma-Aldrich）、N,N'-亚甲基双丙烯酰胺（BIS，Sigma-Aldrich）、过硫酸钾（K₂S₂O₈，KPS，乌克兰）、磷酸二氢钠一水合物（NaH₂PO₄·2H₂O，乌克兰）、阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS，Sigma-Aldrich）均为试剂级，无需进一步纯化直接使用。氯化e₆（Frontier Scientific Inc.）由T.Y. Ohulchanskyy慷慨提供（纽约州立大学布法罗分校激光、光子学与生物光子学研究所）。50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.2）作溶剂。

纳米系统合成与表征

掺PPO的PS-co-PNIPAM核纳米颗粒首先通过微乳液聚合制备。简述：0.2 g NIPAM、0.2 g SDS、0.01 g NaH₂PO₄·H₂O溶于90 g水。随后0.09 g PPO溶于1.8 g苯乙烯，30 min滴加。混合物700 rpm搅拌，氩气吹扫30 min，升温至70 °C。0.01 g K₂S₂O₈溶于1 mL水引发聚合。70 °C下4 h后，进行交联步骤：加入0.69 g NIPAM和0.06 g BIS水溶液，70 °C继续3 h，90 °C 1 h。产物冷却至室温，对纤维素膜（MWCO 3500 Da）透析48 h。

透射电镜（TEM）图像（图2）确认杂化NS由若干PS-PPO核经交联PNIPAM网络连接组成。

光谱测量与样品制备

吸收光谱用Specord M40分光光度计（蔡司，德国）记录。荧光激发发射光谱用Cary Eclipse荧光分光光度计（Varian，澳大利亚）获取。所有测量在1×1 cm石英比色皿室温下进行。PS-PPO-PNIPAM溶液在Tris-HCl缓冲液中稀释100倍。10 mM氯化e₆ DMF储存液稀释至1 mM缓冲液，终浓度2 µM氯化e₆加入NS溶液（DMF≤0.02%）。添加后0、5、10、20、40、60、80、100 min收集荧光激发发射光谱，≈80 min达饱和。

温度依赖研究中，含氯化e₆的NS溶液置于恒温池（T=23 °C）。≈88 min饱和后加热至39 °C（高于交联PNIPAM LCST）。加热后间隔记录荧光激发光谱（氯化e₆发射680 nm）。PNIPAM构象转变始于加热后≈3 min，≈18 min凝集——冷却可逆。实验重复三次，结果一致。

结果与讨论

50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.2）中PS-PPO-PNIPAM杂化NS吸收、荧光激发发射光谱见图3。吸收谱显示苯乙烯（≈260 nm）和PPO（≈307 nm）吸收带。250 nm激发（苯乙烯吸收）产生367 nm PPO发射，证实苯乙烯向PPO近完全EEET。PPO发射（380 nm）激发光谱进一步说明苯乙烯吸收带贡献。水溶PPO中无、PPO发射中有振动结构，确认其掺入PS基质。

加入氯化e₆（2 µM）后，其吸收光谱基本不变（图4），仅峰光密度轻微降低。相反，氯化e₆加入引起PPO荧光显著猝灭，随时间约1小时增强（图5）。猝灭源于EEET（给体-受体能量转移）和再吸收（给体发射与受体吸收重叠）。初期再吸收主导，随时间EEET成为主要贡献。

PS激发（250 nm）下氯化e₆发射随时间红移，≈60 min达饱和（图6）。红移表明PNIPAM环境对结合氯化e₆分子的影响。在氯化e₆自有Soret带（400 nm）激发下发射仅轻微变化，强调仅小部分氯化e₆游离于溶液中。

氯化e₆激发光谱（发射680 nm）初期PS-PPO带微弱，随时间增强（图7），反映给体向受体EEET增加。即使100 min后在氯化e₆发射（660 nm）激发光谱中PS-PPO带仍微弱，确认大部分能量转移通过PS-PPO给体发生。

这些结果共同表明氯化e₆渗透PNIPAM网络，实现PS和PPO向致敏剂EEET。EEET效率在孵育首小时上升，加热系统至交联PNIPAM LCST以上可进一步增强，聚合物网络收缩缩短给体-受体距离。

前期研究显示PS-PPO纳米颗粒X射线激发下发射PPO荧光，提示此处紫外光照观测的EEET在X射线照射下也应生效。但检测X射线诱导发射通常需高NP浓度；引入重原子基团可增加X射线吸收提高灵敏度。

温度依赖实验（图8-9），从23 °C加热至39 °C（饱和后）先致I_ex320/I_ex404比值略降（0.90→0.85），可能反映氯化e₆-PNIPAM亲和力降低。随后比值升至1.02，伴随光散射增加——指示PNIPAM塌缩使给体-受体更接近，从而增强EEET。

总之，PS-PPO-PNIPAM杂化NS促进氯化e₆摄取和EEET，效率经~1 h孵育上升，加热至LCST以上进一步提高。但仅有限氯化e₆结合PNIPAM，凸显未来优化需求。

结论

荧光分析确认氯化e₆掺入PS-PPO-PNIPAM杂化NS，PS基质和嵌入PPO向氯化e₆发生EEET。摄取约1小时达饱和。将系统从21 °C加热至39 °C进一步增强EEET，符合交联PNIPAM壳层热驱动塌缩使给体受体更接近。尽管仅适量氯化e₆结合PNIPAM，这些发现支持此类杂化NS在X射线驱动光动力疗法潜力，值得进一步研究提高致敏剂负载。