通过电子激发能量转移研究聚苯乙烯-二苯基恶唑-聚（N-异丙基丙烯酰胺）杂化纳米系统对氯 e6 光敏剂的吸收

背景

癌症光动力疗法的主要缺点是激发光束穿透组织的深度较低 [1]。因此，提出了用于癌症治疗的放射动力疗法（其中敏化剂可以被能够深入身体的 X 射线有效激发）[2]，并且在过去几年中得到了深入研究 [3,4,5]；研究范围之一是开发在 X 射线激发下产生单线态氧的敏化剂 [5,6,7,8]。这种 X 射线敏化剂的关键过程是其闪烁和敏化成分之间的电子激发能量转移 (EEET) [2, 6, 9, 10, 11]。所提到的 X 射线敏化剂的另一个重要组成部分是将闪烁和敏化部分保持在一起的方式，其距离最适合 EEET；可以提到化学共轭 [2, 3]、静电引力 [8, 12]、表面活性剂 [11] 或聚合物壳 [4]。早些时候，在设计用于单线态氧 X 射线激发敏化的纳米系统 (NS) 的框架中，我们研究了聚苯乙烯 (PS)-二苯基恶唑 (PPO)-二氢卟酚 e6 NS 中的 EEET，其中光敏剂二氢卟酚 e6 与 PS-PPO 纳米颗粒结合（可用作闪烁体[13, 14]）通过表面活性剂（十二烷基硫酸钠）壳[15]。

聚（N-异丙基丙烯酰胺）（PNIPAM）属于刺激响应材料，可根据内部或外部刺激改变其特性[16]。已知线性 PNIPAM 在加热时会发生构象转变，即聚合物在低于临界溶解温度 (LCST) 的温度下收缩（由于变得疏水并因此排出水分子），线性 PNIPAM 等于 32°C [17] .在 [17] 中，PS-PNIPAM 纳米颗粒在 LCST 上的温度转变后 PNIPAM 壳宽度显着减小。同时，对于与葡聚糖缀合的 PNIPAM 链，由于 PNIPAM 链之间的空间相互作用阻碍了构象，与具有相似分子量和多分散性的线性 PNIPAM 相比，构象转变的温度显示出高 2-4°C过渡[18]。

在这项工作中，获得了由交联 PNIPAM 壳覆盖的 PS-PPO 纳米粒子（图 1 和 2），从而形成了 PS-PPO-PNIPAM 混合 NS。研究了使用交联的 PNIPAM 将二氢卟酚 e6 敏化剂连接到 PS-PPO NP 闪烁体的可能性。该聚合物在生理温度下具有构象转变（对于交联的 PNIPAM，LCST 应高于 32°C）。因此，在激发下加热后交联的PNIPAM网络收缩会导致PS-PPO供体和二氢卟酚e6受体之间的距离减小，从而提高EEET的效率，从而提高肿瘤破坏的效率。

PS-PPO-PNIPAM杂化纳米体系和二氢卟酚e6的组分结构

所得PS-PPO-PNIPAM杂化纳米系统的TEM图，放大倍数为低（左）和高（右）

实验

材料

苯乙烯 (ST, 乌克兰) of p.a.在聚合前直接通过标准方法纯化质量。 N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM，Sigma-Aldrich Inc.），N,N'-亚甲基双丙烯酰胺（BIS，Sigma-Aldrich Inc.），过硫酸钾 K2S2O8（KPS，乌克兰），磷酸二氢钠脱水 NaH2PO4 × 2H2O（乌克兰），和阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS，Sigma-Aldrich Inc.）为试剂级，无需进一步纯化即可使用。 Chlorin e6 (Frontier Scientific Inc.) 由 T.Y. Ohulchanskyy（纽约州立大学布法罗分校激光、光子学和生物光子学研究所）。溶剂为 50 毫摩尔 TRIS-HCl 缓冲液（pH 7.2）。

纳米系统的合成和表征

聚苯乙烯-聚（N-异丙基丙烯酰胺）杂化纳米系统，掺杂了 PPO（PS-PPO-PNIPAM 杂化 NS），合成如下。首先，通过微乳液聚合制备掺杂 PPO 的 PS-co-PNIPAM 核纳米粒子 [13, 14, 19, 20]。简而言之，将 0.2 g NIPAM、0.2 g 十二烷基硫酸钠和 0.01 g NaH2PO4 × H2O 溶解在 90 g H2O 中。然后，将 0.09 克 PPO 溶解在 1.8 克苯乙烯中，并在 30 分钟内滴加所得混合物。以 700 rpm 搅拌混合物，并将 Ar 鼓泡到混合物中 30 分钟。温度升至 70°C 后，注入溶解在 1 ml H2O 中的 0.01 g K2S2O8 以引发聚合。其次，PNIPAM 壳层是在 70°C 下加热 4 小时后制造的。为此，使用注射器将单体 NIPAM (0.69 g) 和交联剂 N,N'-亚甲基双丙烯酰胺 (BIS) (0.06 g) 的水溶液添加到反应器中。使反应在 70°C 下继续 3 小时，并在 90°C 下再继续 1 小时。将混合物冷却至室温并使用 MWCO 3500 Da 的纤维素膜透析 48 小时。

获得的纳米系统的过渡电子显微镜 (TEM) 图像显示在图 2 中。对于样品制备，通过辉光放电处理 (Elmo, Cordouan Technologies Bordeaux France) 使具有普通碳膜的 400 目 Cu 网格变得亲水。沉积 5 μl 液滴并使其吸附 1 分钟，然后用一张滤纸除去过量的溶液。 PS-PPO-PNIPAM 纳米系统的观察是在两个 TEM 上进行的，Tecnai G2 或 CM12（FEI，埃因霍温，荷兰），并使用 Tecnai 上的 ssCCD Eagle 相机和 CM12 上的 Megaview SIS 相机获取图像。从图 2 中可以看出，获得的混合纳米系统由几个结合的球形 PS-PPO NP 组成；我们相信它们是由交联的 PNIPAM 聚合物网结合而成的。由此获得了PS-PPO-PNIPAM杂化纳米系统。

光谱测量和样品制备

使用 Specord M40 分光光度计 (Carl Zeiss, Germany) 测量吸收光谱。在 Cary Eclipse 荧光分光光度计（Varian，澳大利亚）的帮助下记录荧光激发和发射光谱。在室温下在 1 × 1 cm 石英池中进行吸收和荧光测量。 50 毫摩尔 TRIS-HCl 缓冲液，pH 7.2，用作溶剂。对于光谱测量，将获得的 PS-PPO-PNIPAM 混合 NS 溶液在缓冲液中溶解 100 次。在 DMF 中制备浓度为 10 mM 的二氢卟酚 e6 储备溶液，并在缓冲液中进一步稀释至 1 mM 浓度。然后将这种 1 mM 二氢卟酚 e6 溶液的小等分试样加入 100 倍溶解的 NS 缓冲溶液中；二氢卟酚 e6 的终浓度为 2 μM，因此 DMF 混合物为 0.02%。在将二氢卟酚 e6 添加到 PS-PPO 溶液后的 0、5、10、20、40、60、80 和 100 分钟内，测量了含有二氢卟酚 e6 的 PS-PPO-PNIPAM 混合 NS 溶液的荧光激发和发射光谱-PNIPAM 混合 NS。在将近 80 分钟内达到饱和。

对于温度依赖性测量，将 PS-PPO-PNIPAM 混合 NS 在二氢卟酚 e6 存在下的溶液放入恒温池支架 (T =23°C）。在样品制备后 88 分钟内，在 PS-PPO-PNIPAM 杂化 NS 对二氢卟酚 e6 的吸收达到饱和后，打开水浴中的水流，将样品加热至 39°C（此温度应超过 LCST交联的 PNIPAM)。然后在加热开始后的不同时间间隔内测量二氢卟酚 e6 的荧光激发光谱（在 680 nm 处发射）。实验结果表明，构象转变在加热开始后约 3 分钟内开始。应该提到的是，在加热开始后约 18 分钟内，NS 发生凝结，产生宏观凝块（但在溶液冷却后消失，因此凝结是可逆的）。温度实验进行了3次，均得到了相似的趋势。

结果与讨论

图 3 显示了在 50 mM Tris-HCl 缓冲液（pH 7.2）中获得的 PS-PPO-PNIPAM 混合纳米系统的吸收、荧光激发和荧光发射光谱。吸收光谱包含对应于苯乙烯的带（最大接近 260 nm ) 和 PPO（最大接近 307 纳米）。同时，在 250 nm（苯乙烯吸收范围）激发时的荧光发射光谱导致光谱仅属于 PPO（最大在 367 nm），而苯乙烯的发射（应在 307 nm [15] ) 没有被观察到。因此，从苯乙烯到掺入 PPO 的 EEET 已接近完成。 PPO 发射的激发光谱 (380 nm) 也支持 EEET，其中可以清楚地观察到 260 nm 附近的苯乙烯带（图 3）。需要补充的是，在 PPO 发射光谱中可以观察到清晰的振动结构（在 PPO 水溶液中没有观察到 [14]），这也表明 PPO 掺入了 PS 基质中。

所获得的 PS-PPO-PNIPAM 混合纳米系统的吸收（黑色实线）、荧光激发（380 nm 发射，归一化；黑色短虚线）和发射（250 nm 激发，归一化；红色实线）光谱50 mM Tris-HCl 缓冲液 (pH 7.2)

此外，向获得的 PS-PPO-PNIPAM 混合纳米系统在 50 mM Tris-HCl 缓冲液 (pH 7.2) 中的溶液中加入光敏剂二氢卟酚 e6。与缓冲溶液相比，在混合纳米系统存在下，二氢卟酚 e6 的吸收光谱几乎没有变化，除了最大值处的光密度略有下降（图 4）。

不含二氢卟酚 e6 (2 μM)（黑线）和 PS-PPO-PNIPAM 混合纳米系统（红线）在 50 mM Tris-HCl 缓冲液中的吸收光谱，pH 7.2

同时，与吸收光谱相比，在 PS-PPO-PNIPAM 杂化 NS 中添加二氢卟酚 e6 对荧光光谱的影响要明显得多。首先，二氢卟酚 e6 的存在导致 PS-PPO-PNIPAM 杂化 NS 的 PPO 荧光发射猝灭，并且这种猝灭确实在大约一个小时内增强（图 5）。通常，这种猝灭可能是由于 EEET（这将导致在所有发射波长处的供体发射猝灭）或重吸收（这将导致在受体吸收波长处的供体发射猝灭）。 PPO 发射光谱的差异（图 5）表明，在加入二氢卟酚 e6 后，重吸收对 PPO 发射猝灭的贡献是显着的（但 EEET 也会发生）。同时，重吸收的贡献随着时间的推移进一步降低，EEET的贡献增加。

在 0 分钟（黑色短虚线）和 80 分钟（黑色点划线）内测量的 PS-PPO-PNIPAM 杂合体不含 NS（黑色实线）和添加二氢卟酚 e6 的荧光光谱。激发波长为 250 nm。 50 毫摩尔的 Tris-HCl 缓冲液，pH 7.2，用作溶剂。光谱的差异（实线、短虚线和虚线红线）表明重吸收和电子激发能量转移（EEET）对发射猝灭的贡献

将二氢卟酚 e6 添加到 PS-PPO-PNIPAM 杂合 NS 的另一个影响是，与游离二氢卟酚 e6 相比，二氢卟酚 e6 发射（在 250 nm 激发 PS 时）转移到长波长区域；强度和变化都随着时间增加并在大约一个小时内达到饱和（图 6）。这种转变表明周围的 PNIPAM 对二氢卟酚 e6 的结合分子有影响。同时，在 PS-PPO-PNIPAM NS 存在下，二氢卟酚 e6 在激发到自身吸收（400 nm）时的发射仅略有改变。加上二氢卟酚 e6 吸收的微小变化（图 4），这意味着只有一小部分二氢卟酚 e6 分子与 PS-PPO-PNIPAM NS 结合。

不含并添加到 PS-PPO-PNIPAM 混合 NS 中的二氢卟酚 e6 的荧光光谱（在添加后 0、5、10、20、40 和 80 分钟内测量）。激发波长为 250 和 400 nm； 50 mM Tris-HCl 缓冲液，pH 7.2，用作溶剂。短虚线箭头表示在 250 和 400 nm 激发的光谱。实线箭头表示在 250 nm 激发的光谱中加入二氢卟酚 e6 后增加的时间 (t)

最后，PS-PPO 带出现在添加到 PS-PPO-PNIPAM 混合 NS 中的二氢卟酚 e6 的激发光谱中（在 680 nm 处发射，其中 PNIPAM 结合的二氢卟酚 e6 对二氢卟酚 e6 的总发射的贡献接近最大值） ）。该条带起初很弱，但随着时间的推移，其强度显着增加（图 7）。同时，即使在添加二氢卟酚 e6 后 100 分钟后，该 PS-PPO 带在 660 nm 处发射时（即游离二氢卟酚 e6 光谱的最大值）在二氢卟酚 e6 的激发光谱中非常弱。

不含并添加到 PS-PPO-PNIPAM 混合 NS（在添加后 0、10、80 和 100 分钟内测量）和 PS-PPO-PNIPAM 混合 NS 本身的二氢卟酚 e6 的荧光激发光谱。二氢卟酚 e6 的发射波长为 660 nm（归一化强度）和 680 nm。 PS-PPO-PNIPAM NS 的发射波长为 380 nm（归一化强度）。 50 毫摩尔 Tris-HCl 缓冲液，pH 7.2，用作溶剂

因此，二氢卟酚 e6 与 PS-PPO-PNIPAM 杂合 NS 结合，导致 EEET 从 PS 基质和封装的 PPO 形成二氢卟酚 e6。 EEET 效率随着时间的推移而增强（在添加二氢卟酚 e6 后约 1 小时内），表明 PS-PPO-PNIPAM 杂种 NS 的 PNIPAM 网络在此期间仍会吸收二氢卟酚 e6。同时，溶液中存在的较小部分二氢卟酚 e6 与 PNIPAM 结合。

还应该提到的是，当用 X 射线激发时，PS-PPO NP 会发出 PPO [14] 或附着的卟啉 [13] 的荧光。因此，在 PS 的紫外激发下，在 PS-PPO-PNIPAM 杂化 NS 中观察到从 PS 到二氢卟酚 e6 的 EEET 意味着 X 射线的能量也可以转移到所研究的 NS 中的二氢卟酚 e6。同时，直接观察此类 NP 的 X 射线受激发射需要相当高浓度的 PS-PPO NP [13, 14]。增加这种NS对X射线敏感性的方法之一可能是添加含有重原子的成分。

已知 PNIPAM 在 LCST 等于 32°C 时会发生构象转变。对于交联聚合物，LCST 值应该更高。如果我们的 PS-PPO-PNIPAM 混合 NS 由围绕 PS-PPO NP 的交联 PNIPAM 网络组成，并且二氢卟酚 e6 与 PNIPAM 网络结合，我们可以预期 PPO-二氢卟酚 e6 距离的减少，从而提高 EEET 效率加热整个混合NS。

为了验证这一想法，研究了在二氢卟酚 e6 存在下加热 PS-PPO-PNIPAM 杂化 NS 对二氢卟酚 e6 的荧光激发光谱的影响。加热实验进行3次；表现出类似的趋势。这些实验之一的结果显示在图1和2中。 8 和 9。因此，PS-PPO-PNIPAM 杂化 NS 在二氢卟酚 e6 存在下的溶液被加热到 39°C 的温度（对于交联的 PNIPAM，这个温度应该超过 LCST）；在 PS-PPO-PNIPAM 杂化 NS 吸收二氢卟酚 e6 达到饱和后开始加热。在加热过程中，在 320 nm (I ex320;这是由于 PPO 到二氢卟酚 e6 EEET）和 404 nm (I ex404;研究了激发到其自身的 Soret 带后的二氢卟酚 e6 发射（图 8 和 9）；我们认为这个比率反映了 PPO 与二氢卟吩 e6 EEET 的效率。因此，加热开始后的前 3 分钟，I ex320/I ex404 从 0.9 降至 0.85，这可能是由于温度升高时二氢卟酚 e6 与 PNIPAM 的结合亲和力降低。此外，I 的值 ex320/I ex404 比率增加到 1.02，伴随着光散射的增加（图 8；散射表现为 660 nm 附近的强度增加）。这可以通过 PNIPAM 中的构象转变导致交联 PNIPAM 网络体积的减少来解释。这导致PS-PPO供体和与PNIPAM网络结合的二氢卟酚e6受体分子之间的距离减小，从而提高EEET效率。

在 23°C（黑线）和 39°C（在加热开启后 14 分钟内；红线）添加到 PS-PPO-PNIPAM 混合 NS 中的二氢卟酚 e6 的荧光激发光谱（在 404 nm 处归一化）。发射波长 680 nm； 50 mM Tris-HCl 缓冲液，pH 7.2，用作溶剂

加热至 39°C 后的时间依赖于在 320 nm 激发后（被 PPO 与进一步的 EEET 吸收）添加到 680 nm 的 PS-PPO-PNIPAM 杂化 NS 中的二氢卟酚 e6 的发射强度之比二氢卟酚 e6) 到 404 nm 激发时的那个（二氢卟酚 e6 的直接激发）。误差棒解释了注册激发光谱的噪声

总之，在添加二氢卟酚 e6 的情况下，PS-PPO-PNIPAM 杂化 NS 溶液中的过程可描述如下。首先，将二氢卟酚 e6 添加到 PS-PPO-PNIPAM 混合 NS 在缓冲液中的溶液中（图 10，过程 1）导致小部分二氢卟酚 e6 渗透到混合 NS 的 PNIPAM 网络中；这导致从 PS 和 PPO 到二氢卟酚 e6 的 EEET。随着 EEET 效率的提高，这种渗透在大约一个小时内进行（图 10，过程 2）。将样品进一步加热到超过 LCST 的温度会导致 PNIPAM 网络的构象转变，从而导致 PS-PPO 与二氢卟酚 e6 分子之间的距离减小，从而使 PS-PPO-二氢卟酚进一步增加e6 EEET 效率（图 10，过程 3）。

加入二氢卟酚 e6（过程 1），经过约 1 小时（过程 2）并进一步从 23°C 加热至 39°C 后，在存在二氢卟酚 e6 的情况下，PS-PPO-PNIPAM 杂化 NS 溶液中的拟议流程（过程3）

结论

荧光研究揭示了 PS-PPO-PNIPAM 杂化 NS 对二氢卟酚 e6 的吸收以及从 PS 基质通过封装的 PPO 到二氢卟酚 e6 的电子激发能量转移；吸收在大约一个小时内达到饱和。

将 PS-PPO-PNIPAM-二氢卟酚 e6 NS 从 21°C 加热至 39°C 可提高 EEET 效率；这与减少PS-PPO供体和二氢卟酚e6受体之间距离的PNIPAM构象转变一致。

同时，溶液中存在的较小部分二氢卟酚 e6 与 PNIPAM 结合；因此，有必要在这方面进一步研究。

缩写

EEET：

电子激发能量转移

LCST：

降低临界溶解温度

NS：

纳米系统

PNIPAM：

聚-N-异丙基丙烯酰胺

PPO：

二苯基恶唑

附注：

聚苯乙烯

TEM：

透射电子显微镜