具有抗血栓形成和增强内皮细胞亲和力的硫酸软骨素/聚己内酯/明胶电纺纳米纤维作为血管组织工程的潜在支架

摘要

静电纺聚合物纳米纤维在血管组织工程中备受关注。然而，传统的纳米纤维材料具有内皮化缓慢和血栓形成的缺陷，在促进血管组织修复和再生方面效果不佳。在此，通过静电纺丝技术开发了包含不同量硫酸软骨素（CS）的仿生明胶（Gt）/聚己内酯（PCL）复合纳米纤维，以研究它们对抗血栓形成和内皮细胞亲和力的影响。 PG 纳米纤维中不同的 CS 浓度会影响纤维形态和直径。 CS/Gt/PCL 纳米纤维具有合适的孔隙率（~ 80%）和 PBS 溶液吸收（高达 650%）。在 Gt/PCL 纳米纤维中引入 CS 极大地增强了它们的抗凝特性，延长了它们的凝固时间，并促进了细胞反应。特别是，10% CS/Gt/PCL 纳米纤维显示出良好的细胞附着、伸长和增殖。因此，含有一定量CS的Gt/PCL纳米纤维可作为血管修复和再生领域有前景的组织工程支架材料。

介绍

纳米纤维材料作为组织修复和再生中的仿生支架，由于其独特的（生物）物理化学特征，包括其细胞外基质（ECM）样超细纤维结构、优异的机械性能、大的比表面积和具有互连性的高孔隙率 [1, 2]。已经证明，纳米纤维结构在介导细胞反应中起着关键作用，例如细胞粘附、形态（例如，扩散、排列、伸长等）、排列、迁移、增殖、表型和通过接触引导的分化 [3] ,4,5]。虽然许多纳米制造策略（例如纳米切削、模板合成、相分离等）已经提供了一种制造纳米纤维材料的可用技术，但静电纺丝是从不同材料（金属、陶瓷、聚合物）制造纳米纤维的最有效方法之一。、复合材料等）的工业规模[6,7,8]。

除了（生物）物理信号外，选择合适的生物材料可以显着影响细胞活性以及组织修复和再生 [9]。应考虑一些关键特征，例如生物相容性、生物可吸收性、机械性能和生物功能 [9, 10]。与天然/天然和合成/合成复合材料相比，由天然和合成聚合物组成的复合纳米纤维材料由于结合了天然聚合物优异的生物学特性和合成聚合物的机械强度而受到更多关注[9]。其中，明胶（Gt）/聚己内酯（PCL）组合是最具代表性的天然-合成混合体系之一，广泛应用于血管组织工程[11,12,13,14]。然而，Gt/PCL复合纳米纤维仍存在一些局限性，如内皮化缓慢和血栓形成。最近，硫酸软骨素 (CS) 是一种含有糖胺聚糖和半乳糖胺的硫酸化多糖，已被证明对内皮细胞 (EC) 具有高粘附性，与蛋白质和血小板的相互作用较弱，以及对带负电荷的血液成分具有静电排斥作用 [15] ,16,17]。此外，CS可以抑制细胞凋亡并促进血管伤口的愈合[18, 19]。因此，结合CS的Gt/PCL（PG）电纺纳米纤维将成为血管修复和再生的生物指导性组织工程支架的理想候选者。

在目前的工作中，通过一步静电纺丝开发了含有不同 CS 比例的仿生 PG 复合纳米纤维。通过不同的表征技术检测了 CS/PG 复合纳米纤维的形态、化学特征孔隙率和降解。评价了PG/CS复合纳米纤维的抗凝剂。此外，这些具有不同 CS 比例的复合纳米纤维接种人主动脉内皮细胞 (HAECs) 以研究它们对细胞反应的影响。

材料和方法

材料

CS（牛气管，A 型，纯度：95%）由上海麦克林生化科技有限公司（中国）提供。 PCL 购自 Aladdin Biochemical Polytron Technologies Inc.（中国）。 Gt（牛皮肤，B 型）购自 Sigma-Aldrich Biochemical Technology Co., Ltd.（中国）。活化部分凝血活酶时间（APTT）试剂盒购自雷根生物技术有限公司（中国）。乙酸（纯度：99.5%）购自国药集团化学试剂有限公司（中国）。人主动脉内皮细胞（HAEC）来自青岛大学（中国）附属医院。培养基 Dulbecco's Modified Eagle 培养基/营养混合物 F-12 (DMEM/F-12)、胎牛血清 (FBS)、0.25% 胰蛋白酶-EDTA 购自 Biological Industries（以色列）。除非另有说明，所有试剂均购自Sigma Aldrich（中国）。实验用水均为去离子水。

纳米纤维的电纺

PCL (10% w/v) 在机械搅拌下在室温下溶解在乙酸中 4 小时。 Gt (10% w/v) 溶解在 90% 乙酸中，持续搅拌 2 小时。将不同浓度的 CS 加入 Gt 溶液中，并在室温下轻轻搅拌 1 小时，以获得相对于总聚合物浓度含有 5、10 和 15 重量％的 CS 的均质溶液。然后，通过将上述两种溶液以 50/50 (w/w) 的重量比在搅拌下混合 2 小时来制备 PG 溶液，命名为 5%CS@PG、10%CS@PG 和 15%CS@PG .

对制备的均质溶液进行静电纺丝工艺，配备带有 21 G 针头的 1 mL 注射器和铝箔覆盖的收集器。在这项研究中，收集器板和针尖之间的距离固定在 18 厘米左右，电压设置为 23 kV，聚合物溶液以 1 mL/h 的速率泵出。所有溶液在室温和小心控制的湿度（<40％）下在静电纺丝仪器（Technology，Tk602TH，China）中静电纺丝。在进行任何进一步的实验之前，将样品放入真空干燥箱中至少 72 小时以去除任何残留的溶剂。

扫描电子显微镜 (SEM) 和透射电子显微镜 (TEM)

CS@PG 纳米纤维支架的形态通过 SEM（VEGAS，TESCAN，捷克）在室温下 20 kV 的加速电压下进行研究。纳米纤维的直径 (n =100) 使用图像分析软件 (Image J) 从 SEM 图像进一步测量。

TEM观察和能量色散X射线光谱（EDS）分析使用JEOL JEM-2100 plus（日本）进行。

傅立叶变换红外光谱 (FTIR)

FTIR 由 Nicolet iN10 FTIR 光谱仪（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）进行，以评估 CS、PG 纳米纤维和 CS@PG 纳米纤维的特征官能团。以透射模式记录样品的光谱，波长范围为 4000-500 cm^-1 分辨率为 2 cm⁻¹ .

磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 溶液的孔隙率和吸收

纳米纤维的孔隙率使用液体置换法进行。首先称取纳米纤维的干重为W1。然后，将四组纳米纤维在 25°C 下浸入乙醇中 2 小时并称重为 W2。用滤纸除去样品表面的乙醇，然后记下样品的重量为W3。纳米纤维的孔隙率由下式计算：

$${\text{孔隙度}}\left( \% \right) =\left( {W_{3} - W_{1} } \right)/\left( {W_{3} - W_{2} } \right) \times 100$$

对于PBS溶液吸收测试，将获得的纳米纤维在干燥状态下称重并记录为Wd。然后，将纳米纤维在 25°C 的 PBS 中浸泡 24 小时，去除样品表面多余的液体后，将湿态的重量记录为 Ww。溶胀率可由下式测量：

$${\text{PBS}}\;{\text{吸收}}\left( \% \right) =\left( {W_{{\text{W}}} - W_{{\text{d} }} } \right)/W_{{\text{d}}} \times 100$$

上述实验中的所有值均表示为平均值 ± SD (n =3).

体外降解行为

为了确定获得的纳米纤维对溶菌酶的抗性，在预定的时间（1、4、7、10 和 14 天）测量了样品的降解性。纳米纤维的初始重量记录为 Wi。然后，将样品浸入含有溶菌酶 (500 μg/mL) 的 PBS 溶液 (pH 7.4) 中，并在 37°C 下体外孵育。以预定的降解间隔取出每组样品，用去离子水洗涤，冷冻干燥，得到最终重量（W F）。溶菌酶溶液每周更换 3 次。纳米纤维支架的剩余质量（%）按以下公式计算：

$${\text{质量}}\;{\text{剩余}}\left( \% \right) =\left( {1 - \frac{{w_{i} - w_{f} }}{{ w_{i} }}} \right) \times 100\%$$

为了评估样品在 7 天后的降解行为，通过扫描电镜观察纳米纤维的形貌。

血液相容性分析

凝血时间

活化部分凝血活酶时间 (APTT) 用于通过在盖玻片上与电纺纳米纤维孵育后测试贫血小板血浆 (PPP) 的凝血时间来评估内在和共同凝血途径的活性。为此，收集抗凝血（约 10 mL）并以 3000 rpm 离心 20 分钟以获得贫血小板血浆 (PPP)。每个样品在 37°C 下与 200 μL PPP 孵育 10 分钟，并按照制造商的说明使用 APTT 试剂盒进行分析 (n =3).

溶血测试

通过测量暴露于电纺纳米纤维的稀释全血中红细胞释放到溶液相中的血红蛋白浓度来评估溶血率。将盖玻片上的样品单独放入 24 孔板中，并在 37°C 下浸入 2 mL PBS 中 30 分钟。阴性对照组仅含 2 mL PBS，而阳性对照组则由 2 mL 去离子水组成，目的是诱导红细胞最大裂解 (n =3 对于每个测试组）。然后，每孔加入40 μL上述抗凝新鲜全血，37°C孵育60分钟，然后将悬浮液移入离心管中，100× g离心 5 分钟。使用酶标仪（SynergyH1/H1M，BioTek，China）测量上清液在 570 nm 处的吸光度。

血栓形成性

将电纺样品与富含血小板的血浆 (PRP) 孵育后，在体外评估了血栓形成潜力。通过离心（1500 rpm，20 分钟）制备 PRP，弃去上半部分血浆。然后，将盖玻片上的纳米纤维在 100 μL PRP 中在 37°C 下孵育 2 小时，并用 PBS 轻轻冲洗 3 次用于后续实验。为了评估与 PRP 孵育后的血小板活性，将电纺纳米纤维保存在补充有 10% FBS 的 DMEM 中 2 小时和 24 小时，然后使用 CCK-8 检测试剂盒测量纳米纤维上的血小板活力。将 CCK-8 (20 μL) 添加到 24 孔板中的 200 μL 无血清 DMEM 培养基中并孵育 1 小时。最后，通过酶标仪在 450 nm 波长下测量悬浮液。

细胞培养和细胞活力

在补充有 FBS（10%，v/v）和链霉素/青霉素（1%，v/v）的 DMEM 中，在 37°C 和 5% CO2 的气氛中培养人主动脉内皮细胞 (HAEC)。培养基每周更换3次。细胞一般用0.05%胰蛋白酶/EDTA分离3 min，1000 rpm离心，悬浮于新鲜培养基中进行细胞传代或细胞接种。

在细胞接种之前，将 24 孔板中的所有纳米纤维材料在紫外线照射下消毒 1 小时，然后浸入 75% 乙醇 (v/v, %) 中 1 小时。然后，将纳米纤维用 PBS 溶液冲洗四次，并在 CO2 培养箱中的 DMEM 中浸泡 12 小时。细胞接种密度为1 × 10⁴ 纳米纤维上每孔一个细胞，培养基每天更换。共培养 24 h 后，用 PBS 溶液洗涤细胞 3 次，然后用 Calcein-AM/PI 双染试剂盒（YEASEN Biochemical Technology Co., Ltd, Shanghai, China）染色。 PI染色死细胞，Calcein-AM染色活细胞。

纳米纤维上的细胞形态

为了观察纳米纤维上的细胞粘附，通过荧光显微镜（Nikon A1 MP，日本）在共培养 24 小时后观察细胞的形态。首先，细胞在室温下用 4% 多聚甲醛固定 30 分钟。然后，使用 0.5% Triton X-100 溶液 5 分钟以渗透细胞膜。最后，4'6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）用于染色细胞核，罗丹明-鬼笔环肽用于染色 F-肌动蛋白。使用Image J进一步进行定量分析（细胞密度、单细胞面积、细胞伸长率）。

细胞增殖

使用 CCK-8 检测试剂盒进行复合纳米纤维的细胞增殖活性。 HAECs以8 × 10³ 的密度接种在纳米纤维上细胞/孔。每两天更换一次培养基。共培养 1、4、7 天后，用 PBS 溶液洗涤细胞以去除非贴壁细胞。然后，将 20 μL CCK-8 和完全培养基以 1:10 的体积比加入到 24 孔板中，在培养箱中培养 1 小时。 Elisa Reader 在 450 nm 处测试吸光度。

DAPI和罗丹明-鬼笔环肽细胞染色，荧光显微镜直接观察与不同纳米纤维共培养2天和6天后细胞计数的变化。

统计分析

实验中的所有样品均一式三份处理。所有数据均表示为平均值 ± 标准偏差 (SD)。通过单向分析方差 (ANOVA) 确定样本的统计分析，以比较差异与 p 指定的显着性 <0.05.

结果与讨论

CS@PG 纳米纤维的制备和表征

图 1 显示了 CS@PG 纳米纤维支架的静电纺丝过程示意图以及抗凝和细胞相容性的体外评估。为了开发用于促进内皮细胞增殖的工程血管组织支架，将不同比例的 CS（5、10 和 15 wt%）加入 PG（10%，v/v）溶液中，通过静电纺丝工艺制造复合纳米纤维。

结论

总之，使用静电纺丝技术成功制备了仿生 CS@PG 复合纳米纤维。通过改变 PG 纳米纤维中的 CS 浓度，可以获得改变的纤维形态和直径。 CS@PG 纳米纤维具有适当的孔隙率（~ 80%）和 PBS 溶液吸收（高达 650%）。 CS 在 PG 纳米纤维中的加入显着改善了它们的抗凝特性，延长了它们的凝固时间，并增强了细胞反应。特别是，10% CS@PG 纳米纤维表现出良好的细胞粘附、伸长和增殖。因此，掺入一定量CS的PG复合纳米纤维可抑制抗血栓形成并增强内皮细胞反应，可作为一种有前景的血管修复和再生组织工程支架。