软骨素硫酸酯增强明胶/聚己内酯纳米纤维：具有卓越内皮亲和力的抗血栓支架用于血管组织工程

摘要

电纺聚合物纳米纤维在血管组织工程领域备受关注。然而，传统纳米纤维材料存在内皮化缓慢和血栓形成等缺陷，难以有效促进血管组织修复与再生。本研究利用电纺技术制备了掺入不同量软骨素硫酸酯（CS）的仿生明胶（Gt）/聚己内酯（PCL）复合纳米纤维，系统考察其抗血栓性和内皮细胞亲和力。不同浓度的CS显著影响PG纳米纤维的形态和直径。CS/Gt/PCL纳米纤维具有适宜的孔隙率（~80%）和PBS溶液吸收率（高达650%）。CS的引入大幅增强了Gt/PCL纳米纤维的抗凝性能，延长凝血时间，并促进细胞响应。特别是10%CS/Gt/PCL纳米纤维表现出优异的细胞附着、伸长和增殖能力。因此，含适量CS的Gt/PCL纳米纤维有望成为血管修复与再生的理想组织工程支架候选材料。

引言

纳米纤维材料因其独特的理化特性——如细胞外基质（ECM）样的超细纤维结构、优异的力学性能、巨大的比表面积和高度互联的孔隙率——在组织修复与再生的仿生支架应用中备受瞩目。研究表明，纳米纤维结构通过接触引导在调节细胞粘附、形态（铺展、排列、伸长等）、排布、迁移、增殖、表型及分化等细胞响应中发挥关键作用。虽然纳米切削、模板合成、相分离等多种纳米制备技术可制造纳米纤维材料，但电纺技术因能以工业化规模从金属、陶瓷、聚合物及复合材料等多种材料制备纳米纤维，成为最高效的方法之一。

除了物理信号，生物材料的选择也显著影响细胞活性及组织修复再生。生物相容性、生物可吸收性、力学性能和生物功能等关键特性均需考量。与天然/天然或合成/合成复合材料相比，天然聚合物与合成聚合物复合的纳米纤维材料因兼具天然聚合物的优异生物学特性和合成聚合物的力学强度而更受关注。其中，明胶（Gt）/聚己内酯（PCL）组合是研究最具代表性的天然-合成混合体系之一，广泛应用于血管组织工程。然而，Gt/PCL复合纳米纤维仍存在内皮化缓慢、易形成血栓等局限。近期研究发现，软骨素硫酸酯（CS）作为一种含糖胺聚糖和半乳糖胺的硫酸化多糖，具有高内皮细胞粘附性、与蛋白质和血小板的弱相互作用，以及对带负电血液成分的静电排斥作用。此外，CS还能抑制细胞凋亡、促进血管创面愈合。因此，掺入CS的Gt/PCL（PG）电纺纳米纤维有望成为血管修复再生的生物指导性组织工程支架。

本研究通过一步法电纺制备了含不同CS比例的仿生PG复合纳米纤维，利用多种表征技术考察其形貌、化学特性、孔隙率及降解行为；评估其抗凝血性能；并以人主动脉内皮细胞（HAECs）为模型，探究不同CS比例复合纳米纤维对细胞响应的影响。

材料与方法

材料

软骨素硫酸酯（牛气管，A型，纯度95%）购自上海麦克林生化科技有限公司；PCL购自阿拉丁生化科技有限公司；明胶（牛皮，B型）购自Sigma-Aldrich生化科技有限公司；活化部分凝血活酶时间（APTT）试剂盒购自雷根生物科技有限公司；冰乙酸（纯度99.5%）购自国药集团化学试剂有限公司；人主动脉内皮细胞（HAECs）来源于青岛大学附属医院；培养基DMEM/F-12、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶-EDTA购自Biological Industries（以色列）；其余试剂均购自Sigma Aldrich（中国）；实验用水均为去离子水。

纳米纤维电纺制备

PCL（10% w/v）于室温下在机械搅拌中溶于乙酸4小时；明胶（10% w/v）溶于90%乙酸并恒定搅拌2小时。将不同浓度的CS加入明胶溶液中，室温轻柔搅拌1小时，制得相对于总聚合物浓度含5%、10%、15 wt.% CS的均相溶液。随后将上述两溶液按50/50（w/w）重量比混合搅拌2小时，制得PG溶液，分别标记为5%CS@PG、10%CS@PG、15%CS@PG。

将制备好的均相溶液进行电纺：采用1 mL注射器配21 G针头，收集器覆盖铝箔。收集板与针尖距离固定约18 cm，电压设定23 kV，进液速率1 mL/h。在室温、湿度<40%条件下使用电纺设备（Technology, Tk602TH, 中国）进行电纺。实验前所有样品在真空干燥箱中干燥至少72小时以去除残留溶剂。

扫描电镜（SEM）与透射电镜（TEM）

利用SEM（VEGAS, TESCAN, 捷克）在20 kV加速电压下观察CS@PG纳米纤维支架形貌。采用Image J软件对SEM图像中的纳米纤维直径进行测量（n=100）。TEM观察及能谱分析（EDS）使用JEOL JEM-2100 plus（日本）完成。

傅里叶变换红外光谱（FTIR）

使用Nicolet iN10 FTIR光谱仪（Thermo Fisher Scientific, 美国）以透射模式在4000–500 cm⁻¹波数范围、分辨率2 cm⁻¹下测定CS、PG纳米纤维及CS@PG纳米纤维的特征官能团。

孔隙率与PBS溶液吸收测试

采用液体置换法测定孔隙率：称取干重W₁，纳米纤维浸泡乙醇2小时（25°C）称重W₂，滤纸吸干表面乙醇称重W₃。孔隙率（%）= (W₃ - W₁)/(W₃ - W₂) × 100。PBS吸收测试：干燥称重Wd，PBS浸泡24小时（25°C）除去表面液体后称湿重Ww。PBS吸收率（%）= (Ww - Wd)/Wd × 100。所有实验均重复3次，结果以均值±标准差表示。

体外降解行为

将纳米纤维浸入含溶菌酶（500 μg/mL）的PBS（pH 7.4）中，37°C孵育。预设时间点（1、4、7、10、14天）取出，去离子水洗涤、冻干称重Wf。溶菌酶溶液每周更换3次。质量残留率（%）= [1 - (Wi - Wf)/Wi] × 100%。第7天降解后的形貌用SEM观察。

血液相容性分析

凝血时间测定

采用APTT法评估内源性及共同凝血途径活性。取抗凝全血约10 mL，3000 rpm离心20分钟获取贫血小板血浆（PPP）。各样品与200 μL PPP于37°C孵育10分钟，按APTT试剂盒说明书检测凝血时间（n=3）。

溶血率测试

将样品置于24孔板中，37°C浸泡2 mL PBS 30分钟。阴性对照仅含PBS，阳性对照用去离子水诱导最大溶血（各组n=3）。加入40 μL新鲜抗凝全血，37°C孵育60分钟，100×g离心5分钟，取上清于微孔板读数仪（SynergyH1/H1M, BioTek, 中国）570 nm处测吸光度。

血栓形成性评估

制备富血小板血浆（PRP，1500 rpm离心20分钟，弃上层一半血浆）。纳米纤维与100 μL PRP于37°C孵育2小时，PBS轻柔漂洗3次。将孵育后纳米纤维置于含10% FBS的DMEM中继续培养2小时和24小时，用CCK-8试剂盒检测血小板活性：加入20 μL CCK-8至200 μL无血清DMEM中，37°C孵育1小时，450 nm处测吸光度。

细胞培养与活性检测

HAECs于含10% FBS、1%链霉素/青霉素的DMEM中培养（37°C, 5% CO₂），每周换液3次。0.05%胰蛋白酶/EDTA消化3分钟，1000 rpm离心，重悬于新鲜培养基中传代或接种。

细胞接种前，纳米纤维材料经紫外照射1小时、75%乙醇浸泡1小时灭菌，PBS冲洗4次，含DMEM于CO₂培养箱预浸泡12小时。细胞接种密度1×10⁴ cells/well，每日换液。共培养24小时后，PBS洗涤3次，用Calcein-AM/PI双染试剂盒染色：PI染死细胞，Calcein-AM染活细胞。

纳米纤维上细胞形态观察

共培养24小时后，荧光显微镜（Nikon A1 MP, 日本）观察细胞粘附形态。4%多聚甲醛固定30分钟，0.5% Triton X-100渗透5分钟，DAPI染核，罗丹明-鬼笔环肽染F-肌动蛋白。Image J进行细胞密度、单细胞面积、细胞伸长度定量分析。

细胞增殖检测

CCK-8法检测复合纳米纤维上细胞增殖活性。HAECs接种密度8×10³ cells/well，每两天换液。共培养1、4、7天时，PBS洗去非贴壁细胞，加入CCK-8与完全培养基（1:10）孵育1小时，酶标仪450 nm测吸光度。荧光显微镜下DAPI与罗丹明-鬼笔环肽双染直观观察共培养2天和6天细胞数量变化。

统计学分析

所有实验三重复。数据以均值±标准差（SD）表示。单因素方差分析（ANOVA）比较差异，p<0.05为显著性差异。

结果与讨论

CS@PG纳米纤维的制备与表征

图1展示了CS@PG纳米纤维支架电纺制备工艺及体外抗凝、细胞相容性评价示意图。为开发促进内皮细胞增殖的工程血管支架，将不同比例CS（5、10、15 wt%）掺入PG（10%, v/v）溶液，经电纺制备复合纳米纤维。

SEM观察CS@PG电纺纳米纤维结构。图2显示PG、5%CS@PG、10%CS@PG、15%CS@PG纳米纤维均呈现致密纤维结构，纤维连续、平滑、纳米级。PG纳米纤维（图2a）电纺过程中出现大量不规则珠状结构，平均直径406.01±146.28 nm，可能因10% w/v电纺液粘度较低导致纤维不均匀。随CS含量从5%增至10% wt.，溶液粘度增加，可获得无珠状均匀纳米纤维（图2b, c）。相应地，5%CS@PG和10%CS@PG平均直径分别减小至382.35±152.99 nm和300.29±100.85 nm，主要因CS含量增加提高了电纺液电导率。当聚合物浓度达15%时，溶液粘度过高难以在电场中拉伸，同流速（1 mL/h）和电压（23 kV）下出现针尖堵塞、泰勒锥消失，故将流速调至0.9 mL/h、电压降至20 kV，成功制得15%CS@PG纳米纤维，平均直径266.92±105.43 nm。

图3a显示CS在5%CS@PG和10%CS@PG纳米纤维中均匀分布，但15%CS@PG纤维中检测到CS聚集。图3b能谱元素分析显示，随纤维中CS浓度增加，硫元素含量相应升高，证实CS成功掺入。

FTIR光谱分析

FTIR表征纳米纤维支架化学基团特征吸收峰。以PG和CS光谱为对照对比CS@PG纳米纤维组。PG光谱中3300 cm⁻¹和2935 cm⁻¹处强吸收峰分别归属于-NH₂/-OH伸缩振动和CH₂不对称伸缩振动；1652 cm⁻¹（酰胺I，C=O伸缩）、1542 cm⁻¹（酰胺II，N-H弯曲）、1441 cm⁻¹（CH₂伸缩）、1267 cm⁻¹（酰胺III，C-N伸缩）为特征峰。CS光谱在1245 cm⁻¹处呈现特征吸收带，代表SO₄²⁻中S=O伸缩振动。

图4显示5%CS@PG、10%CS@PG、15%CS@PG纳米纤维FTIR谱图同时呈现PCL、明胶、CS特征峰。与PG组相比，CS@PG组均出现CS特征带（1245 cm⁻¹），且随CS含量增加该吸收峰强度增强，证实不同含量CS成功掺入CS@PG电纺纳米纤维中。

纳米纤维孔隙率、溶胀比及降解性

高孔隙率意味着材料具有良好互联互通性，利于氧气和营养物质扩散及细胞浸润。图5a显示不同CS比例纳米纤维膜孔隙率均约80%。电纺纳米纤维形成的高孔隙结构可模拟天然ECM，为细胞提供有利的三维微环境。据报道，孔隙率达80%的组织工程支架有利于营养物质和代谢产物转运。

PBS吸收比对比评价CS对膜材PBS吸水性的影响。图5b显示PG支架PBS吸收率为586.34±49.44%，5%CS@PG和10%CS@PG分别为492.86±21.99%和510.04±69.55%。15%CS@PG组（665.07±59.81%）显著高于其他两组，表明CS含量增加可提高复合纳米纤维PBS吸收性能，归因于CS分子中含亲水基团（羧基、羟基）。

体外降解实验数据见图5c。随CS比例增加，CS@PG纳米纤维支架降解速率加快，可能因SO₄²⁻基团存在。第7天后大多数支架降解速率开始加快，第14天降解率分别为：PG 8.45%、5%CS@PG 11.39%、10%CS@PG 13.97%、15%CS@PG 15.10%。SEM图像（图5d）显示PBS浸泡7天后纳米纤维轻微溶胀，表明制备纳米纤维前7天稳定性足够，避免严重降解膨胀影响体内外细胞响应。

血液相容性评价

APTT是通过内源性凝血机制检测血液或血浆的简便可靠方法。APTT检测电纺纳米纤维对血液凝固延迟的影响。APTT检测的凝血时间显示：对照PG与5%CS@PG、10%CS@PG纳米纤维间凝血时间统计学显著缩短；而15%CS@PG纳米纤维与PPP孵育后APTT延长，显示抗凝性能改善。图6a显示凝血影响取决于纳米纤维样品直径。5%CS@PG纳米纤维相互作用后APTT凝血时间最低，10%CS@PG电纺纳米纤维APTT最高，与溶血程度趋势相似。随CS比例增加，凝血时间延长。

按ASTM F756-00（2000）标准，生物材料溶血率要求<5%。本研究采用比色法测定红细胞释放血红蛋白计算溶血度：溶血率（%)=(ODsam - ODneg)/(ODpos - ODneg)×100%。图6b显示所有样品均无溶血性，溶血率均<5%。

血小板活性实验数据见图6c。孵育2小时后，贴附血小板代谢活性最高，特别是PG纳米纤维组达最大值。有趣的是，24小时后所有样品血小板活性均下降。这可能因纳米纤维结构诱导血小板快速激活，导致生长因子快速消耗释放，不同于光滑表面接触诱导的稳定长期血小板激活。血小板正常寿命约8-10天，激活后寿命缩短。

活/死细胞染色

通过HAECs在纳米纤维上6天的活性、粘附形态、增殖评价CS对纳米纤维细胞相容性的影响。Calcein-AM/PI双染试剂盒、DAPI染色、CCK-8试剂盒评估贴附细胞。

图7a-e展示不同纳米纤维上HAECs活/死细胞荧光图像。Calcein-AM（绿）染活细胞，PI（红）染死细胞。观察到活细胞均贴附于CS@PG复合纳米纤维上，表明不同CS比例纳米纤维对HAECs无毒性。Image J定量分析活/死细胞数量比例（图7f）。与PG纳米纤维相比，含不同CS比例的PG组（特别是10%CS@PG和15%CS@PG）活细胞比例更大，且随CS浓度增加而升高。结果表明CS存在有利于维持细胞活力。

纳米纤维上细胞粘附行为

良好生物相容性的纳米纤维支架是血管生成的首要要求。PCL良好生物降解性和天然明胶优异生物相容性使其广泛用于水凝胶、电纺纳米纤维、三维支架等组织工程结构。荧光显微镜观察HAECs在复合纳米纤维上24小时形态及细胞-材料相互作用。10%CS@PG和15%CS@PG细胞密度显著高于PG和5%CS@PG，表明较高水平CS添加促进细胞粘附。图8c显示5%CS@PG和15%CS@PG单细胞面积大于其他组；但10%CS@PG细胞伸长度显著高于PG、5%CS@PG、15%CS@PG（图8d）。这可能因10%浓度CS促进HAECs铺展。HAECs能在复合纳米纤维上良好贴附、铺展、生长，特别是10%CS@PG和15%CS@PG，可视为安全有前景的临床血管材料候选者。

细胞增殖

荧光显微镜和CCK-8法体外考察CS@PG纳米纤维上细胞生长活力（图9a-c）。电纺PG支架为阳性对照。CCK-8检测结果见图9c。培养2、4、6天时，所有组细胞数随培养时间增加。第6天，10%CS@PG纳米纤维OD值显著高于PG支架。5%CS@PG、10%CS@PG、15%CS@PG增殖对比显示，一定范围内CS含量增加促进细胞增殖速率。但细胞增殖能力也受纳米纤维材料表面形态影响。因15%CS@PG纳米纤维电纺液CS比例较高粘度大，可能影响细胞增殖。

结论

总之，利用电纺技术成功制备了仿生CS@PG复合纳米纤维。通过调节PG纳米纤维中CS浓度获得不同纤维形态和直径。CS@PG纳米纤维具有适宜孔隙率（~80%）和PBS溶液吸收率（高达650%）。CS掺入显著改善PG纳米纤维抗凝性能，延长凝血时间，增强细胞响应。特别是10%CS@PG纳米纤维表现出优异的细胞粘附、伸长和增殖。因此，掺入适量CS的PG复合纳米纤维兼具抗血栓形成性和促进内皮细胞响应，有望开发为血管修复再生的有前景组织工程支架。