与 C60 富勒烯复合可提高阿霉素在体外对抗白血病细胞的效率

结果与讨论

C60-Dox 复合物的 HPLC-MS/MS 分析

对于色谱分离，我们使用反相条件，预计在分离过程中，疏水性 C60 分子在色谱柱上的保留能力比极性更强的 Dox [41] 强得多。用极性流动相洗脱应明显引起复合物分解并释放出对流动相具有较高亲和力并可被质谱检测到的游离Dox。

为了确认溶液中复合物的存在，选择 1 μM Dox 作为分析分析的最佳浓度。在等度流动条件下，游离 Dox 和作为 C60 复合物组分的 Dox 的保留时间不同——分别为 11.66 和 9.44 分钟（图 1）。此外，复合物释放的 Dox 色谱峰更宽，并观察到“峰拖尾”。检测到的保留时间偏移以及不同的拾取形状表明，C60-Dox 共轭物在对 C18 色谱柱具有更高亲和力的富勒烯分子上发生分解。因此，纳米结构占据了一部分活性结合位点，并适当干扰了 Dox 与这些位点的结合，从而影响了分离过程。这导致与游离药物相比，从复合物中释放的 Dox 的保留时间更短（Dox 通过色谱柱所需的时间减少）以及峰的边界和拖尾。 Lie 等人观察到了一个非常相似的现象。 [42] 在 C60 非共价复合物与支链淀粉的色谱分离过程中。游离Dox与复合物释放的色谱图的差异明显表明溶液中存在C60-Dox复合物。

游离 Dox (1 μM)、C60-Dox 1:1 和 C60-Dox 2:1（1 μM Dox 等效浓度）复合物在等度流（乙腈，0.1% 甲酸水溶液，80:20）下的多反应监测色谱图, v :v )，母离子→子离子跃迁：544.2 → 130.2和361.1 m/z； a.u.任意单位

光谱和荧光分析

Dox 的光学性质由其芳环和酮基团的 π 络合物系统中的电子跃迁决定 [43]。 Dox 的典型吸收光谱位于 λ <600 nm 的波长范围内，在 480 nm 处有一个宽带（图 2a）。原始 C60 水胶体溶液的 UV/Vis 吸收光谱具有三个典型的吸收带，最大值位于 220、265 和 350 nm，并且在可见光的红色区域有一条细长的宽尾 [34, 44]。因此，从复合物的光谱中减去游离 C60 的相应对照光谱。观察到的两种 50 μM 复合物的吸收光谱与游离的 50 μM Dox 的吸收光谱相似，但观察到 30% 的减色效应（图 2a），表明由于 π-π 堆积相互作用，Dox 固定在 C60 表面上。 <图片>

配合物的光学表征。游离 Dox 和 C60-Dox 复合物的光密度光谱 (a ）。游离 Dox 和 C60-Dox 复合物在 Dox 等效浓度为 3 到 50 μM 时的荧光发射光谱 (b ); a.u.任意单位

Dox的长波长吸收最大值（λ =480 nm）被用作追踪其荧光的激发波长。荧光光谱显示出一个宽带，由 560、594 和 638 nm 处的三个峰组成，最大值约为 594 nm（图 2b）[43]，而 C60 在该光谱带没有可检测的荧光。 C60-Dox 复合物的荧光在一系列稀释中进行评估，Dox 等效浓度为 3 到 50 μM。无论稀释如何，复合物中 Dox 的荧光（λex =480 nm，λem =594 nm）都被 C60 部分淬灭（图 2b）。因此，在 3 μM Dox 等效浓度下，两种复合物中 Dox 的荧光似乎都被淬灭了 50%。观察到的 Dox 荧光猝灭归因于 C60 [3] 的强电子接受能力和非共价 Dox 复合物典型的分子内激发态能量转移 [18, 36, 45]，表明组分在空间上非常接近。

动态光散射的尺寸分布分析

纳米颗粒抗癌药物的大小和稳定性基本上取决于细胞培养基组成、离子强度和蛋白质浓度。发现 1 μM C​​60-Dox 1:1 和 2:1 复合物在生理盐水溶液（0.9% NaCl）中的平均流体动力学直径分别为 135 ± 5 nm 和 134 ± 6 nm，与之前研究的数据相匹配 [ 20]。为了评估在细胞培养基中的稳定性，将 1-μM C60-Dox 复合物在补充有 10% FBS 的 RPMI 中在 37 °C 下孵育 72 小时。该介质中的粒径分布模式（图 3）归因于高蛋白质含量及其可能的聚集 [46, 47]。

1 μM С60-Dox 复合物在 RPMI 细胞培养基中的流体动力学大小（直径，nm），在 0 (a) 补充有 10% FBS ) 和 72 小时 (b ) 孵化。强度（%）占所有散射光强度的百分比

1 μM C​​60-Dox 1:1 和 2:1 纳米复合物在添加 FBS 的细胞培养物中的流体动力学直径分布的动态光散射数据表明，当立即测量时，它们的大小为 138 ± 6 nm 和 139 ± 5 nm（图 3a）和 146 ± 4 nm 和 144 ± 5 nm，分别在孵育 72 h 后（图 3b）。

检测到的最大值（约 140 nm）的稳定性表明 C60-Dox 复合物在添加 FBS 的细胞培养基中长时间孵育期间没有额外的聚集，这证实了它们适用于体外研究。

细胞活力

在 C60-Dox 复合物以及等浓度的游离 Dox 存在下分别孵育 24、48 和 72 小时时，通过 MTT 测试评估不同系的人类白血病细胞的生存力。与复合物中浓度相当的 C60 单独使用对白血病细胞活力没有影响（数据未显示）。

图 4 显示了在 Dox 处理下白血病细胞生存力的时间和浓度依赖性降低。该药物显示出在纳摩尔范围内对白血病细胞的毒性。发现白血病细胞对 Dox 的敏感性遵循 Molt-16 ˃ THP1 ˃ Jurkat ˃ CCRF-CEM（不太敏感）的顺序。

CCRF-CEM、Jurkat、THP1 和 Molt16 白血病细胞的活力，用等剂量的游离 Dox 或 C60-Dox 复合物处理 24、48 和 72 h (*p ≤ 0.05 与游离 Dox 相比，**p ≤ 0.05 与 C60-Dox 1:1 复合物相比，n =5)

在 100 nM Dox 的作用下，CCRF-CEM 细胞的存活率分别在 24、48 和 72 h 时分别降至 84 ± 7、50 ± 4 和 34 ± 7%。在 Jurkat 细胞中发现了 100 nM Dox 毒性效应的类似模式。发现用 100 nM Dox 细胞处理后 THP1 细胞的存活率分别为 50 ± 4、47 ± 5 和 13 ± 4%，分别为 24、48 和 72 h。 CCRF-CEM、THP1 和 Jurkat 细胞在孵育 72 h 时的半最大抑制 Dox 浓度 (IC50) 估计分别为 80 ± 9、43 ± 5 和 38 ± 6 nM。这些数据对应于文献数据 [48, 49]。 Molt-16 细胞似乎对药物最敏感，因为在细胞培养的所有时期内都检测到其毒性作用范围为 1 到 25 nM。 5 nM Dox处理后的Molt-16细胞在24、48、72 h分别下降到75 ± 4、28 ± 4和18 ± 4%，IC50为72 h仅等于 2.0 nM。 Cai 等人 先前报道了 Molt-16 细胞具有相似的高敏感性，与在草药生物碱处理下的 Jurkat 细胞相比，其凋亡诱导强度高 10 倍。 [50].

使用游离 Dox 处理的细胞作为对照，以评估 C60-Dox 复合物在药物等效剂量下的活性。计算每个时间点和细胞系的游离 Dox 和 C60-Dox 复合物的 IC50 值，并在图 4 中列出。

结果表明，与游离 Dox 相比，两种 C60-Dox 复合物对人白血病细胞系都具有更高的毒性（图 4）。

总之，我们的大量实验表明，对于四种细胞系，各种增强的毒性高达 3.5 倍。与 2:1 复合物相比，C60-Dox 1:1 复合物显示出更高的毒性。 2:1 复合物的不太明显的效果（与游离 Dox 相比，IC50 降低≥ 2.5 倍）可归因于作为其组分的 C60 浓度较高。由于其抗氧化活性 [11, 13]，过量的 C60 可以保护细胞免受 Dox 相关的氧化应激 [27]。

游离 Dox 和 C60-Dox 复合物的细胞内积累

为了研究 C60-Dox 复合物增强的毒性作用与更有效的细胞内药物积累之间的潜在相关性，研究了游离 Dox 和 C60-Dox 的细胞摄取。由于 Dox 在可见光谱区域具有强吸收和荧光 [43, 45]（图 2），因此可以使用基于非侵入性直接荧光的技术跟踪 Dox 复合物。 CCRF-CEM 细胞在药物等效浓度的 1 μM Dox 或 C60-Dox 复合物存在下孵育，用荧光显微镜检查并进行流式细胞术以量化细胞内积累的药物水平 1、3 和 6 -h 处理（图 5）。每个样品的平均荧光强度通过各自的 Dox 红色荧光信号值（λex =488 nm，λem =585/29 nm）从对数 FACS 直方图计算，并列于表 2。未处理细胞的自发荧光用作阴性对照（图 5a）。

1 μM 游离和 C60 复合的 Dox 的细胞内积累。流式细胞术 (a ) 和荧光显微镜图像 (b ) 的 CCRF-CEM 细胞与 Dox 和 C60-Dox 以 1:1 和 2:1 的比例孵育 1、3 和 6 h。比例尺 20 μM

通过荧光强度增强估计 1 μM Dox 的时间依赖性积累（图 5，表 2）。荧光显微镜图像表明 C60-Dox 复合物比游离药物更快地内化，这可以通过更亮的细胞内荧光来证明（图 5b）。用 1 μM Dox 等效浓度的 1:1 C60-Dox 复合物处理的 CCRF-CEM 细胞的平均荧光强度与游离 Dox 相比在 1、3 和 6 h 时分别增加了 1.5、1.7 和 2.2 倍. 2:1 C60-Dox 复合物表现出延迟的细胞内药物积累，在 6 h 时达到与 1:1 复合物相同的水平（图 5，表 2）。

获得的数据表明，Dox 与 C60 的复合促进了进入细胞，但不影响其定位。使用 DNA 结合染料 Hoechst 33342 对所研究细胞的对照染色显示其与 Dox 信号共定位（数据未显示）。显然，来自 C60 复合物和游离药物的 Dox 分子进入细胞核，反映了其通过 DNA 损伤的抗增殖作用 [26,27,28]。与 C60 复合后增加的药物细胞内摄取表明后者起到药物转运促进剂的作用。由于被动扩散 [51] 和/或内吞作用/胞饮作用 [52, 53]，C60 纳米结构被证明可以穿越细胞质膜，而像 Dox 这样的小分子只能通过被动扩散渗透。 C60 结构类似于网格蛋白 [54, 55] 的结构，网格蛋白是内吞过程中囊泡形成的主要外壳成分。因此，C60 可能充当小芳香族分子的转运蛋白 [56]。相反，载体和货物之间的共价键会导致药物分子的结构改变。因此，积累模式和与细胞内靶标的相互作用发生改变，导致药物功能完全或部分丧失。刘等人。 [15] 表明通过酰胺键结合的两个Dox分子的C60主要分布在细胞质中。

结论

测定了组分比例为1:1和2:1的C60-Dox复合物的理化性质，并评估了它们对人白血病细胞CCRF-CEM、Jurkat、Molt-16和THP1的毒性。

HPLC-MS/MS 分析揭示了游离 Dox 和从 C60-Dox 复合物释放的色谱图的明显区别。 C60 与 Dox 的络合通过 C60-Dox 复合物中的吸收减色效应和荧光猝灭得到证实。我们确定 C60-Dox 复合物的大小在 140 nm 附近保留在蛋白质存在下并在培养基中延长孵育时间。对人类白血病细胞系的研究表明，与同等浓度的游离药物相比，C60-Dox 复合物具有更高的细胞毒性。在细胞孵育 72 h 时，与游离药物的 IC50 相比，1:1 和 2:1 复合物的 IC50 值分别降低了≤ 3.5 和 ≤ 2.5 倍。与 C60 的复合促进了 Dox 进入白血病细胞。与游离 Dox 处理相比，CCRF-CEM 细胞用 1 μM Dox 等效浓度的 C60-Dox 复合物处理 6 h 后，细胞内药物水平增加 2.2 倍。

我们的结果证实了 C60 作为纳米载体的功能及其在优化 Dox 对抗白血病细胞效率方面的应用前景。由于 Dox 只是许多抗肿瘤药物的代表或模型物质，我们预计我们的研究结果可能会转移到其他药物上。增加药物对肿瘤细胞的吸收和/或其抗肿瘤特性可能指向新的治疗策略。药物与纳米载体的络合可能有助于降低其有效剂量率，从而减轻不必要的副作用。

更改历史

缩写

C60：

C60富勒烯

DMSO：

二甲亚砜

Dox：

阿霉素

ESI：

电喷雾电离

FBS：

胎牛血清

HPLC-MS/MS：

高效液相色谱-串联质谱

IC50：

半数最大抑菌浓度

细节层次：

检测限

LOQ：

定量限

MRM：

多反应监测

MTT：

3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑

PBS：

磷酸盐缓冲盐水