C60富勒烯对二苯基-N-(三氯乙酰基)酰胺磷酸酯-DNA结合与人白血病细胞细胞毒性的调控研究

摘要

合成了碳酰胺磷酸酯新代表——二苯基-N-(三氯乙酰基)酰胺磷酸酯（HL），含磷酰基附近两个苯氧基取代基，经元素分析、红外和核磁共振光谱鉴定，并作为细胞毒性剂单独及与C₆₀富勒烯联用测试。

分子模拟显示，C₆₀富勒烯与HL可与DNA相互作用形成刚性复合物，由HL苯基与C₆₀及DNA G核苷酸的堆积作用、HL的CCl₃基团与C₆₀的离子-π键及与DNA G核苷酸的静电键稳定。

MTT实验显示HL对人白血病CCRF-CM细胞有细胞毒性，72 h处理IC₅₀为10 μM。联合16 μM C₆₀富勒烯与HL作用时，IC₅₀降至5 μM HL且提前至48 h，且HL在2.5 μM低浓度下单独无细胞毒性时也表现出细胞毒性。C₆₀富勒烯与HL结合DNA小沟形成稳定复合物，推测为其协同抑制CCRF-CEM细胞增殖的可能原因之一。

C₆₀富勒烯联合2.5 μM HL对血液红细胞膜结构稳定性无有害影响。因此，C₆₀富勒烯与低浓度HL联用增强了对人白血病细胞的细胞毒性，且不伴随溶血作用。

背景

碳纳米结构代表C₆₀富勒烯展现出独特理化性质和生物活性，不仅作为抗氧化剂或光敏剂，还能因穿透细胞并充当药物载体而调节抗癌药物毒性效应[1–4]。C₆₀分子可与多柔比星、顺铂、紫杉醇等化疗药物相互作用形成复合物，增强治疗效果[5–8]。

碳酰胺磷酸酯（CAPh）因其特殊结构、生物活性和生物医学应用前景受关注[9–12]。分子中肽基和磷酰胺基结合的C(O)N(H)P(O)片段决定其与生物分子和细胞膜的相互作用。磷酰基和羰基附近取代基的变化可调控CAPh立体化学和药理特性。特别是，不同CAPh代表显示抗肿瘤活性[13, 14]。

近期我们证实，CAPh代表二甲基-N-(苯甲酰基)酰胺磷酸酯在毫摩尔浓度范围降低白血病L1210细胞活力，且其毒性效应被C₆₀富勒烯促进[15]。我们还表明，在CAPh结构中引入额外芳香取代基和电负性CCl₃基团增强了其毒性[16]。对人不同来源白血病细胞，二吗啉基-N-三氯乙酰基磷酰胺显示显著毒性，但有效浓度仍高且联合C₆₀富勒烯未增强毒性。为延续研究，我们合成了新CAPh代表二苯基-N-(三氯乙酰基)酰胺磷酸酯（HL），其磷酰基附近为两个苯氧基取代基而非吗啉基（图1）。

图1. 二苯基-N-(三氯乙酰基)酰胺磷酸酯（HL）结构。

研究旨在通过硅分析其与DNA相互作用及体外研究对人白血病细胞系细胞毒性效应，评估HL单独或联合C₆₀富勒烯的生物活性。

方法/实验

化学试剂

RPMI 1640液体培养基、胎牛血清（FBS）、青霉素/链霉素和L-谷氨酰胺（德国Biochrom）、二甲基亚砜（DMSO，德国Carl Roth）、MTT [3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物]（美国Sigma-Aldrich）、HCl（乌克兰Kharkivreachim）。

化合物表征

为增加溶解性，按以下反应制得HL钠盐（图2）。

图2. 二苯基-N-(三氯乙酰基)酰胺磷酸酯（HL）钠盐溶解度方案。

0.035 M三氯磷氮三氯乙酰溶液（200 ml氯仿）缓慢加入充分搅拌的0.106 M苯酚钠悬浮液（12.3 g，150 ml氯仿）中（图2阶段1）。混合物温度不超40–50°C。继续搅拌约1 h，然后加热至70°C搅拌20 min。所得产物三苯氧基磷氮三氯乙酰蒸干。加入40 ml 1 M NaOH回流90 min（图2阶段2）。所得混合物蒸干。固体沉淀用乙醚洗涤三次，从异丙醇重结晶得白色结晶粉末（收率80%）。用i-PrOH:H₂O (9:1 v/v)缓慢蒸发得适合X射线分析的无色NaL·3H₂O晶体。化合物空气稳定，极易溶于水和醇类。熔点215°C。

HL经元素分析、红外和核磁共振光谱鉴定：元素分析（C、H、N）用EL III通用CHNOS元素分析仪。红外光谱测KBr压片，Perkin-Elmer Spectrum BX FT-IR光谱仪，分辨率2 cm⁻¹，累积8次扫描平均，光谱范围4000–400 cm⁻¹。¹H NMR（DMSO-d₆）在AVANCE 400 Bruker NMR光谱仪室温下记录。

HL：IR (cm⁻¹)：1639 vs, sh (νCO)；1353 s, sh (酰胺II)；1194 s, sh (νPO)；941 s, sh (νPN)。

¹H NMR (DMSO-d₆)：7.05 (t, 2H, γ-CH₂)；7.205, 7.255 (dt, 8H, α-和β-CH₂)。

CCl₃C(O)N(Na)P(O)(OC₆H₅)₂元素组成：测定%：C 40.58, H 2.35, N 3.15；理论%：C 40.37, H 2.42, N 3.36。

C₆₀富勒烯合成与表征

高稳定性水溶胶体C₆₀富勒烯溶液（200 μM，纯度>99.5%，纳米颗粒平均尺寸≤50 nm）在德国伊尔梅瑙工业大学按文献[17, 18]合成。

细胞培养

实验用人急性T细胞白血病CCRF-CM细胞系。从德国DSMZ微生物与细胞培养物集购买：CCRF-CM (ACC 240)。细胞在含10% FBS、1%青霉素/链霉素、2 mM谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中培养，25 cm²培养瓶，37°C、5% CO₂、饱和湿度培养箱。

细胞在RPMI 1640中分别与C₆₀富勒烯（16 μM）或HL（2.5、5、10 μM）单独及联合孵育24、48、72 h。未加HL或C₆₀富勒烯的细胞存活率设为100%（对照含0.05 M DMSO）。

细胞活力（MTT）测定

用MTT还原测定评估细胞活力[19]。指定孵育时间点，取100 μl混悬液（0.5×10⁴细胞）接种96孔板（德国Sarstedt），每孔加10 μl MTT溶液（5 mg/ml PBS），37°C再孵育2 h。更换培养基为100 μl DMSO，用微孔板读数仪（瑞士Tecan Infinite M200 Pro）在570 nm测定二甲臜形成吸光度。

实验动物

实验用Wistar雄性大鼠，体重170±5 g。标准条件饲养于基辅国立大学生物医学研究所实验动物中心。自由饮食饮水。所有实验遵循欧洲保护脊椎动物公约国际原则，经上述机构生物伦理委员会监管。

红细胞溶血测定

从Wistar大鼠肝素抗凝血获取红细胞，0.85% NaCl稀释至630 nm处0.700 o.u.（德国Scinco分光光度计）。0.001 N HCl诱导溶血。每10 s分光光度法（λ=630 nm）测动力学2 min。溶血红细胞百分比按文献[20]计算。红细胞在0.85% NaCl中与C₆₀富勒烯（16 μM）或HL（2.5、10 μM）单独及联合孵育1 h。无添加组设为100%（对照含0.05 M DMSO）。

硅模拟研究

用PDB（蛋白质数据库）中双螺旋DNA分子作模板。研究DNA与HL单独及联合C₆₀富勒烯的相互作用。考虑DNA结构：2MIW (CCATCGCTACC - 化合物插入DNA螺旋小沟)、1XRW (CCTCGTCC - 插入小沟)、2M2C (GCGCATGCTACGCG - 结合大小沟)。应用QXP包内置系统对接算法（SDOCK+），展示所有可能构象且均方根偏差（RMSD）最小[21]。生成300个潜在DNA复合物，用QXP内置评分函数选最优10个进入下阶段[22]。

DNA与HL单独及联合C₆₀富勒烯相互作用按以下参数表征：(1)氢键数，(2)DNA与对接结构接触面积，(3)DNA与对接结构距离，(4)结合结构总能量。

为评估化合物与C₆₀富勒烯复合物稳定性，用Gromacs软件[23]按Nosé-Poincaré-Anderson算法（NPA）[24, 25]基于OPLS-AA力场[26, 27]进行短分子动力学（MD，100 ps）。

计算参数：温度300 K；压强100 kPa；涉及氢原子或配体的结合受算法限制[25]。

统计分析

数据为4次以上独立实验均值±SD。计算各组均值(M)和标准差(SD)。用双因素方差分析后Bonferroni事后检验。p<0.05为统计学显著。用IBM PC配合GraphPad Prism 7（美国GraphPad Software）处理绘图。

结果与讨论

硅模拟研究

HL与DNA相互作用

HL可插入DNA并在小沟结合形成稳定复合物，结合位点为AGC-GCTA核苷酸（图3a）。此时形成A核苷酸氮碱基与HL苯基的堆积作用，以及CCl₃基团与C核苷酸的静电相互作用。MD模拟后，DNA双螺旋和HL的RMSD分别为3.3和1.62 Å。HL核苷酸环境(GCA-CTA)部分改变，堆积作用消失，而HL羰基与G核苷酸形成氢键。

图3. 二苯基-N-(三氯乙酰基)酰胺磷酸酯（HL）与DNA分子相互作用：(a)、(b) 结合小沟和大沟；(c) 插入小沟。用PDB数据库DNA结构：(a)、(b)——2M2C，(c)——1XRW。

HL与大沟结合通过TCG-AT核苷酸（图3b）。形成HL羰基与A核苷酸氮碱基的氢键，两个HL苯基与C、G核苷酸氮碱基堆积。此外，HL CCl₃基团与AT核苷酸氮碱基出现静电键可能性。

MD模拟后，HL核苷酸环境无变化。DNA和HL的RMSD分别为2.77和1.58 Å。C核苷酸与苯基的堆积作用消失。

HL插入DNA时，环境为CG-CG核苷酸（图3c）。出现与CG核苷酸堆积：一个苯基夹在氮碱基间，另一个与C核苷酸堆积。

MD模拟后，DNA双螺旋和HL的RMSD分别为1.71和1.89 Å。HL核苷酸环境未变。一个苯基与G核苷酸氮碱基形成离子-π相互作用，后者位移1.12 Å。

获得的能量参数表明DNA与HL间及HL内部空间位阻能量微不足道（表1）。

我们比较分析了HL结合DNA小沟、大沟及插入小沟的能量参数。Bump值：插入DNA为6.2 kJ/mol，结合小沟和大沟为2.5 kJ/mol（表1）。Int值：插入DNA 8.7 kJ/mol，结合大沟 6.3 kJ/mol，结合小沟 3.6 kJ/mol。这些数据表明HL结合DNA小沟最稳定。

HL与C₆₀富勒烯联合作用于DNA

先前计算机模拟显示，C₆₀分子可与DNA相互作用，结合小沟形成稳定C₆₀+DNA复合物[15]。如图4所示，C₆₀富勒烯亦可与HL分子CCl₃基团形成离子-π键。

图4. 二苯基-N-(三氯乙酰基)酰胺磷酸酯（HL）与C₆₀富勒烯联合作用于DNA（HL+C₆₀或C₆₀+HL版本）：(a)、(b) 结合小沟和大沟，(c)、(d) 插入小沟和大沟。用PDB数据库DNA结构：(a)、(b)——2M2C，(c)——1XRW，(d)——2MIW。

我们采用文献[16]提出的两种HL、C₆₀富勒烯和DNA分子建模版本，经证实有利于MD模拟结果解释。用1XRW PDB DNA结构对应先HL后C₆₀插入DNA版本（HL+C₆₀）；用2MIW PDB DNA结构对应先C₆₀后HL插入版本（C₆₀+HL）。

HL+C₆₀版本小沟结合通过GCTA-GCAT核苷酸（图4a）。苯基填满小沟进入堆积：一个与C₆₀，另一个与G核苷酸氮碱基。CCl₃基团与G核苷酸氮碱基和C₆₀富勒烯产生静电相互作用。

MD模拟显示，DNA双螺旋活动性大（RMSD 3.08 Å），HL RMSD 2.04 Å，C₆₀几乎不动。结果HL+C₆₀结构核苷酸环境变为TGC-GCATG。此外，HL氨基与DNA形成氢键，GC碱基氮碱基与C₆₀出现堆积相互作用。

HL+C₆₀大沟结合通过C-ATCC核苷酸（图4b）。HL羰基与A核苷酸氮碱基形成氢键。苯基填满大沟与C₆₀堆积。

MD模拟显示，HL+C₆₀结构核苷酸环境未变：DNA和HL RMSD分别为3.14和2.24 Å，C₆₀几乎不动。此时HL与C₆₀所有相互作用消失，HL仅与DNA空间位阻相互作用。推测结果C₆₀和HL会被挤出大沟。

HL+C₆₀插入小沟（图4c）结合CGT-GAG核苷酸。C₆₀嵌入小沟与其空间位阻相互作用。HL苯基与CG-CG核苷酸氮碱基堆积。MD模拟显示DNA和HL RMSD分别为2.29和2.13 Å，C₆₀几乎不动，HL的CCl₃基团与G核苷酸氮碱基静电相互作用。

C₆₀+HL版本小沟结合（图4d）通过CGC-GCC核苷酸。一个HL苯基与C₆₀堆积，另一个与G核苷酸堆积。HL的CCl₃基团与C核苷酸氮碱基形成静电键。MD分析显示DNA和HL RMSD分别为2.35和2.75 Å，C₆₀不动，C₆₀+HL结构核苷酸环境变为CGCT-GC。此外，C₆₀分子深入DNA与C核苷酸氮碱基堆积。

计算能量参数显示，C₆₀+HL插入小沟形成的复合物最刚性（Bump值20.0 kJ/mol）（表1）。对比HL+C₆₀与DNA相互作用，插入小沟Bump仅6.2 kJ/mol，结合小沟7.8 kJ/mol，结合大沟8.8 kJ/mol。此外，能量参数显示强氢键仅在HL+C₆₀大沟结合时可能（Hbnd −2.3 kJ/mol），其他类型为零或−1.0 kJ/mol（表1）。且MD结果显示此情况下C₆₀和HL均从大沟位移。

因此，C₆₀+HL结合DNA小沟被建议为C₆₀富勒烯、HL和DNA联合相互作用最可能版本。

HL生物学效应体外研究

CCRF-CEM细胞活力

体外实验用MTT测定估算二苯基-N-(三氯乙酰基)酰胺磷酸酯（HL）在2.5–10 μM范围对人白血病CCRF-CEM细胞活力的长期影响。细胞在RPMI 1640中分别与16 μM C₆₀富勒烯或HL单独或联合孵育24、48、72 h。无C₆₀或HL细胞活力设为100%。

24 h孵育未观察到HL对CCRF-CEM细胞活力影响（图5）。延长孵育后，5和10 μM HL细胞毒性显现，48 h分别抑制25%和33%，72 h继续下降。

图5. 不同浓度二苯基-N-(三氯乙酰基)酰胺磷酸酯（HL）孵育CCRF-CEM细胞活力。(M ± m, n=8)；*p<0.05 vs 对照细胞。

值得注意的是，72 h单独HL作用下10 μM浓度检测到CCRF-CEM细胞活力50%下降（IC₅₀）（图5）。近期我们显示另一CAPh代表二吗啉基-N-三氯乙酰基磷酰胺在72 h、1 mM浓度致CCRF-CEM细胞活力50%下降[16]。比较分析表明，将CAPh衍生物中吗啉基替换为苯氧基使其对白血病细胞的有效毒性浓度降低两个数量级。我们假设–P(O)(OC₆H₅)核心的构象柔性确保了该化合物与DNA更有效相互作用。

单用C₆₀富勒烯在孵育期内对细胞活力无影响（数据未示）。同时，图6结果显示C₆₀富勒烯增强HL对CCRF-CEM细胞细胞毒性。C₆₀富勒烯联合HL作用下，细胞活力50%下降出现在更低HL浓度（5 μM）和更早时期（48 h）。此外，72 h联合作用下，HL在2.5 μM低浓度表现出细胞毒性，而此时单独HL无影响（图6）。

图6. 单独HL或联合16 μM C₆₀富勒烯孵育CCRF-CEM细胞活力。(M ± m, n=8)；*p<0.05 vs 对照；#p<0.05 vs HL。

因此，C₆₀富勒烯增强HL细胞毒性，显著提高白血病细胞对其低浓度敏感性。考虑到C₆₀富勒烯能在24 h内积累于白血病细胞内[28]并定位于细胞内区室[29–31]，特别是细胞核[32, 33]，其与活跃增殖癌细胞核DNA相互作用不应排除。

体外数据与硅模拟结果一致，表明C₆₀分子先结合再HL结合DNA小沟形成稳定复合物，可能是协同抑制CCRF-CEM细胞增殖的原因之一。

红细胞抗溶血性

评估HL和C₆₀富勒烯联合抗癌潜力时，需考虑其对非恶性细胞（特别是血细胞）的可能影响。

研究红细胞抗酸性溶血可阐明药物在膜水平的影响。溶血动力学反映红细胞膜破坏动力学，即其结构组织稳定性。图7显示红细胞在NaCl溶液中无添加（对照）及单独HL或C₆₀富勒烯或联合孵育1 h后的溶血百分比依赖关系。单用16 μM C₆₀富勒烯未影响红细胞溶血（未示）。2.5 μM HL单独或联合C₆₀不影响红细胞抗溶血（图7）。而10 μM HL加速溶血，20 s达最大值。10 μM HL联合C₆₀富勒烯进一步增强溶血，20 s时60%红细胞溶血。

图7. 二苯基-N-(三氯乙酰基)酰胺磷酸酯（HL）单独及联合16 μM C₆₀富勒烯存在下红细胞抗溶血。(M ± m, n=8)

获得数据显示，C₆₀富勒烯联合2.5 μM HL对血液红细胞膜结构稳定性无有害影响，同时显著增强该低浓度下HL对白血病细胞细胞毒性。尽管C₆₀富勒烯与10 μM HL对白血病细胞有协同细胞毒性，但其联用受限于溶血效应增强。

最后，结合上述体外研究，重要的是强调水/固体界面存在限域水，也可影响纳米结构的输运、热力学性质[34, 35]及其与细胞膜相互作用[36]。

文献有碳酰胺磷酸酯衍生物细胞内定位数据，特别是磷酰胺酸酯进入细胞。磷酰胺酸酯衍生物可穿透MDA-231乳腺癌和肺癌(H460, H383, H2009)细胞系膜[37]。硝基苄基磷酰胺芥子穿透细胞膜定位于NTR⁺哺乳动物细胞线粒体[10]。不排除C₆₀富勒烯能被动扩散或内吞穿透癌细胞膜[28, 30, 32]，在细胞核和线粒体积累[30, 32, 33]，可作为小分子抗肿瘤分子转运体[38–40]。

结论

合成了磷酰基附近含两个苯氧基取代基的碳酰胺磷酸酯新代表——二苯基-N-(三氯乙酰基)酰胺磷酸酯（HL），测试其单独及联合C₆₀富勒烯的细胞毒性。分子模拟显示，当C₆₀富勒烯先结合再HL结合DNA小沟时，形成刚性复合物，由HL苯基与C₆₀及DNA G核苷酸堆积、HL CCl₃基团与C₆₀离子-π键及与DNA G核苷酸静电键稳定。

MTT测试显示HL对人白血病CCRF-CM细胞有细胞毒性，72 h处理IC₅₀为10 μM。C₆₀富勒烯促进HL细胞毒性。联合16 μM C₆₀富勒烯与HL作用下，IC₅₀降至5 μM HL且提前至48 h，且HL在2.5 μM低浓度下单独无影响时表现出细胞毒性。

先前我们显示二吗啉基-N-三氯乙酰基磷酰胺对不同来源人白血病细胞有显著毒性，但有效浓度高且联合C₆₀富勒烯未增强毒性[16]。我们假设将CAPh衍生物中吗啉基替换为柔性–P(O)(OC₆H₅)基团降低了其对人白血病细胞毒性浓度，确保其与C₆₀分子和DNA有效相互作用。C₆₀富勒烯与HL结合DNA小沟形成稳定复合物，推测为协同抑制CCRF-CEM细胞增殖的可能原因之一。

我们揭示C₆₀富勒烯联合2.5 μM HL对血液红细胞膜结构稳定性无有害影响，而C₆₀富勒烯联合10 μM HL受限于溶血效应增强。

因此，C₆₀富勒烯增强HL细胞毒性，显著提高人白血病细胞对其低浓度敏感性。C₆₀富勒烯与低浓度2.5 μM HL联合可能为进一步生物医学研究提供前景。

缩写

DMSO:

二甲基亚砜

DNA:

脱氧核糖核酸

FBS:

胎牛血清

HL:

二苯基-N-(三氯乙酰基)酰胺磷酸酯

IR:

红外光谱

MD:

分子动力学

MTT:

3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2-H-四氮唑溴化物

NMR:

核磁共振

RPMI - 1640 medium:

罗素公园纪念研究所培养基