C60 富勒烯对二苯基-N-（三氯乙酰基）-氨基磷酸酯在硅胶中与 DNA 相互作用的影响及其对体外人白血病细胞系的细胞毒活性

二苯基-N-(三氯乙酰基)-氨基磷酸酯(HL)的结构

该研究的目的是评估二苯基-N-（三氯乙酰基）-酰胺基磷酸酯 (HL) 单独或与 C60 富勒烯组合的生物活性，并使用计算机分析它们与 DNA 的相互作用以及体外细胞毒性作用研究人白血病细胞系。

二苯基-N-(三氯乙酰基)-氨基磷酸酯(HL)在钠盐中的溶解度示意图

将在 200 毫升氯仿中的三氯磷杂三氯乙酰溶液 (0.035 M) 缓慢加入到充分搅拌的 150 毫升氯仿中的苯酚钠悬浮液 (0.106 M，12.3 克) 中（图 2；阶段 1）。不允许混合物温度升至 40-50°C 以上。继续搅拌约 1 小时，然后将溶液加热至 70°C 并在这些条件下搅拌 20 分钟。蒸发所得产物三苯氧基磷杂三氯乙酰。然后，加入 40 毫升 1 M NaOH 并回流 90 分钟（图 2；阶段 2）。蒸发所得混合物。 HL钠固体沉淀物用乙醚洗涤3次，用i重结晶 -丙醇为白色结晶粉末（产率80%）。 i得到适合X射线分析的无色NaL·3H2O晶体 -PrOH:H2O (9:1 v /v ) 溶液缓慢蒸发。该化合物在空气中稳定，极易溶于水和醇。国会议员215°С。

通过元素分析和 IR 和 NMR 光谱鉴定 HL：使用 EL III 通用 CHNOS 元素分析仪进行元素分析（C、H、N）。在分辨率为 2 cm ^{− 1} 的 Perkin-Elmer Spectrum BX FT-IR 光谱仪上对 KBr 颗粒样品进行红外光谱测量 和 8 次扫描的累积，将其组合以平均 4000–400 cm ^{− 1} 光谱范围内的随机吸收伪影 . ¹ 在 AVANCE 400Bruker NMR 光谱仪上在室温下记录 DMSO-d6 溶液中的 H NMR 谱。

HL：红外（cm ⁻¹ ):1639 vs, sh (νCO); 1353 s，sh（酰胺 II）； 1194 秒，sh (νPO)； 941 秒，sh (νPN)。

¹ H NMR（DMSO-d6）：7.05（t，2H，γ-CH2）； 7.205, 7.255 (dt, 8H, α-和β-CH2).

对于 CCl3C(O)N(Na)P(O)(OC6H5)2，测定元素组成，%：C 40.58，H 2.35，N 3.15；并计算，%：C 40.37，H 2.42，N 3.36。

C60 富勒烯的合成与表征

如 [17, 18] 所述，在伊尔梅瑙工业大学（德国）合成了高度稳定的 C60 富勒烯胶体水溶液（200 μM，纯度> 99.5%，纳米颗粒平均尺寸高达 50 nm）。

细胞文化

实验是在人急性 T 细胞白血病 CCRF-CM 细胞系上进行的。细胞系购自莱布尼茨研究所 DSMZ-德国微生物和细胞培养物保藏中心：CCRF-CM (ACC 240)。使用 25 cm ² 在补充有 10% FBS、1% 青霉素/链霉素和 2 mM 谷氨酰胺的 RPMI 1640 培养基中培养细胞 在 37°C 和 5% CO2 的加湿培养箱中培养瓶。

RPMI 1640 培养基中的细胞分别与 C60 富勒烯 (16 μM) 或 HL (2.5、5 和 10 μM) 一起孵育 24、48 和 72 小时。未添加 HL 或 C60 富勒烯的细胞存活率为 100%（对照样品含有 0.05 M DMSO）。

细胞活力 (MTT) 检测

通过MTT [3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑]还原测定[19]评估细胞活力。在指定的孵育时间点，100 μl 等分试样 (0,5 × 10 ⁴ 细胞）置于 96 孔微孔板 Sarstedt（Nümbrecht，德国）中，将 10 μl MTT 溶液（PBS 中 5 mg/ml）加入每个孔中，并将板在 37°C 下再孵育 2 小时。然后用 100 μl DMSO 替换培养基；通过使用酶标仪 Tecan Infinite M200 Pro（Männedorf，瑞士）测量 570 nm 处的吸收来确定二甲脒的形成。

动物

该研究是在体重为 170 ± 5 克的“Wistar”系的白色雄性大鼠上进行的。这些动物被保存在基辅国立塔拉斯舍甫琴科国立大学 ESC“生物学和医学研究所”的动物饲养室的标准条件下。动物可以自由获得食物和水。所有实验均按照上述机构生物伦理委员会控制下的欧洲保护脊椎动物公约的国际原则进行。

估计红细胞溶血

从“Wistar”系大鼠的肝素化血液中获得红细胞，并在 0.85% NaCl 溶液中稀释至 0.700 o.u。 Scinco 分光光度计（德国）上的 630 nm。红细胞溶血是由 0.001 N HCl 引起的。溶血动力学通过分光光度法 (λ =630 nm) 在 2 分钟内每 10 秒一次。如 [20] 中所示计算溶血红细胞的百分比。红细胞在 0.85% NaCl 溶液中与 C60 富勒烯 (16 μM) 或 HL (2.5 和 10 μM) 分别并一起孵育 1 小时。未添加 HL 或 C60 富勒烯的红细胞为 100%（对照样品含有 0.05 M DMSO）。

计算机研究

双螺旋 DNA 分子用作来自 PDB（蛋白质数据库）基础的模板。已经研究了 DNA 分子与 HL 单独和与 C60 富勒烯组合的相互作用。我们考虑了 DNA 分子的以下结构：2MIW（CCATCGCTACC - 化合物插入 DNA 螺旋的小凹槽）、1XRW（CCTCGTCC - 化合物插入 DNA 螺旋的小凹槽）和 2M2C（GCGCATGCTACGCG - 结合与 DNA 螺旋的大小凹槽复合）。我们应用了系统对接算法 (SDOCK+)，内置于 QXP 包中（该方法以均方根偏差 (RMSD) 的最小值证明了所研究结构的所有可能构象）[21]。我们生成了 300 种可能的 DNA 复合物，其中最好的 10 种被选择用于下一阶段，使用内置 QXP 包 [22] 的评分函数。

DNA 分子与 HL 单独和与 C60 富勒烯结合的相互作用由以下参数表征：(1) 氢键的数量，(2) DNA 和相应结构的接触表面面积，(3) DNA与对接结构之间的距离，以及(4)结合结构的总能量。

为了评估化合物与 C60 富勒烯的复合物的稳定性，我们根据 Nosé-Poincaré-Anderson 算法 (NPA) [24, 25] 使用 Gromacs 软件工具 [23] 进行了短分子动力学（MD，100 ps）基于OPLS-AA力场[26, 27]。

计算是根据以下参数进行的：温度（开尔文）- 300；压力（千帕）- 100；涉及氢原子或配体的结合受算法限制[25]。

统计分析

数据表示为超过四个独立实验的平均值 ± SD。计算每组的平均值 (M) 和标准偏差 (SD)。使用双向方差分析和 Bonferroni 后检验进行统计分析。 p 的值 <0.05 被认为具有统计学意义。数据处理和绘图由 IBM PC 使用专用应用程序 GraphPad Prism 7（GraphPad Software Inc.，USA）进行。

二苯基-N-(三氯乙酰基)-氨基磷酸酯(HL)与DNA分子的相互作用：a , b 与小凹槽和大凹槽结合； c 插入小沟。使用的 PDB 数据库中的 DNA 结构：a , b —2M2C 和 c —1XRW

HL 与主要 DNA 凹槽的结合通过 TCG-AT 核苷酸发生（图 3b）。在这种情况下，HL的CO基团与A核苷酸的含氮碱基之间形成氢键，HL苯基与C和G核苷酸的含氮碱基之间发生堆叠相互作用。此外，HL CCl3基团与AT核苷酸的含氮碱基之间存在静电键合的可能性。

MD模拟后，未检测到HL的核苷酸环境发生变化。 DNA 和 HL 的 RMSD 值分别为 2.77 和 1.58 Å。由于它，C核苷酸和苯基之间的堆积相互作用消失了。

在 HL 嵌入 DNA 的情况下，其环境由 CG-CG 核苷酸组成（图 3c）。出现与CG核苷酸的堆积相互作用：一个苯基被夹在含氮碱基之间，另一个与C核苷酸形成堆积相互作用。

MD 模拟后，DNA 双螺旋和 HL 的 RMSD 值分别为 1.71 和 1.89 Å。 HL的核苷酸环境没有改变。其中一个苯基与 G 核苷酸的含氮碱基形成离子-π 相互作用，似乎移动了 1.12 Å。

获得的能量参数证明DNA和HL之间以及HL内部的空间碰撞能量微不足道（表1）。

我们对 HL 与 DNA 小沟和大沟结合或其嵌入 DNA 小沟的能量参数进行了比较分析。在 HL 嵌入 DNA 的情况下，凸出值显示为 6.2 kJ/mol，在其与 DNA 小沟和大沟结合的情况下为 2.5 kJ/mol（表 1）。在 HL 嵌入 DNA 的情况下，Int 值为 8.7 kJ/mol，在其与 DNA 大沟结合的情况下为 6.3 kJ/mol，在其与 DNA 小沟结合的情况下为 3.6 kJ/mol。这些数据表明HL与DNA小沟的结合最为稳定。

HL 和 C60 富勒烯与 DNA 的联合相互作用

以前通过计算机模拟，我们已经证明 C60 分子可以与 DNA 相互作用并在与 DNA 小沟结合时形成稳定的 C60+DNA 复合物 [15]。如图4所示，C60富勒烯也可以与HL分子的CCl3基团形成离子-π键。

二苯基-N-（三氯乙酰基）-氨基磷酸酯 (HL) 和 C60 富勒烯与 DNA 的组合相互作用（HL+C60 或 C60+HL 版本）：a , b 结合小凹槽和大凹槽，c , d 插入小凹槽和大凹槽。 PDB数据库使用的DNA结构：a , b —2M2C，c —1XRW 和 d —2MIW

我们使用了 HL、C60 富勒烯和 DNA 相互作用的两种版本的分子建模，这些版本在 [16] 中提出并被证明可用于解释 MD 模拟结果。我们在版本中使用了 DNA 分子的 1XRW PDB 结构，当最初 HL 然后 C60 分子插入 DNA (HL+C60) 和 DNA 分子的 2MIW PDB 结构 - 在版本中，当最初 C60 分子然后 HL 插入 DNA 时(C60+HL).

在 HL+C60 版本的情况下，与 DNA 小沟的结合是通过 GCTA-GCAT 核苷酸发生的（图 4a）。苯基填充了一个小沟并进入堆叠相互作用：一组与 C60 富勒烯，另一组与 G 核苷酸的含氮碱基。 HL的CCl3基团与G核苷酸的含氮碱基和C60富勒烯之间产生静电相互作用。

根据 MD 模拟结果，这种情况下的 DNA 双螺旋具有相当大的迁移率（RMSD 值为 3.08 Å），HL 的 RMSD 值为 2.04 Å，而 C60 富勒烯几乎保持不动。结果，HL+C60结构的核苷酸环境被TGC-GCATG改变。此外，HL的氨基与DNA之间存在氢键，含氮GC碱基的核苷酸与C60富勒烯之间出现堆积相互作用。

HL+C60 与主要 DNA 凹槽的结合通过 C-ATCC 核苷酸发生（图 4b）。 HL CO基团与A核苷酸的含氮碱基之间形成氢键。苯基填充了一个主要的DNA凹槽并与C60富勒烯发生堆积相互作用。

根据 MD 模拟结果，HL+C60 结构的核苷酸环境没有改变：DNA 和 HL 的 RMSD 值分别为 3.14 和 2.24 Å，C60 富勒烯几乎保持不动。在这种情况下，HL 和 C60 富勒烯之间的所有相互作用都消失了，HL 仅与 DNA 发生空间相互作用。推测C60富勒烯和HL会因此被推出DNA大沟。

当 HL+C60 被插入到一个小 DNA 凹槽中时（图 4c），与 CGT-GAG 核苷酸的结合发生了。 C60 富勒烯发生在一个小的 DNA 凹槽中并与它发生空间相互作用。 HL苯基与CG-CG核苷酸的含氮碱基形成堆积相互作用。根据MD模拟，DNA和HL的RMSD值分别为2.29和2.13 Å，C60富勒烯几乎保持不动，HL的CC13基团与G核苷酸的含氮碱基发生静电相互作用。

在 C60+HL 版本的情况下，通过 CGC-GCC 核苷酸与小 DNA 凹槽（图 4d）结合。 HL 苯基中的一个与 C60 富勒烯形成堆叠，另一个与 G 核苷酸形成堆叠。 HL的CC13基团似乎与C核苷酸的含氮碱基形成静电键。根据MD分析，本例中DNA和HL的RMSD值分别为2.35和2.75Å，C60富勒烯保持不动，CGCT-GC改变了C60+HL结构的核苷酸环境。此外，C60分子更深地渗透到DNA中，并与C核苷酸的氮碱基形成堆积相互作用。

根据计算的能量参数，在 C60+HL 嵌入 DNA 小沟的情况下形成的复合物是最刚性的（Bump 值 20.0 kJ/mol）（表 1）。相比之下，在 HL+C60 与 DNA 相互作用的情况下，当 HL+C60 插入 DNA 小沟时，该参数仅为 6.2 kJ/mol，与 DNA 小沟结合时为 7.8 kJ/mol，8.8 kJ /mol 当它与主要的 DNA 凹槽结合时。此外，能量参数表明，HL+C60+DNA复合物内部形成强氢键只有在与DNA大沟结合的情况下才有可能，当Hbnd值为− 2.3 kJ/mol时，其他类型的相互作用它等于零或 - 1.0 kJ/mol（表 1）。此外，根据本例中的 MD 结果，C60 富勒烯和 HL 似乎都从主要的 DNA 凹槽中移位。

因此，C60+HL 与 DNA 小沟的结合被认为是 C60 富勒烯、HL 和 DNA 联合相互作用的最可能版本。

HL 生物学效应的体外研究

CCRF-CЕM 细胞活力

在体外实验中，通过 MTT 测试评估了 2.5-10 μM 范围内的二苯基-N（三氯乙酰基）-氨基磷酸酯 (HL) 对人类白血病 CCRF-CЕM 细胞活力的长期影响。将细胞在含有 16 μM C​​60 富勒烯或单独的 HL 或其组合的 RPMI 1640 培养基中孵育 24、48 和 72 小时。无 C60 或 HL 孵育的细胞活力被认为是 100%。

在孵育 24 小时时，未观察到 HL 对 CCRF-CЕM 细胞活力的影响（图 5）。在更长时间的孵育中，5和10 μM浓度的HL的细胞毒活性变得明显，48小时时的细胞活力分别被抑制了25%和33%，并在72小时时继续下降。

CCRF-CEM 细胞与不同浓度的二苯基-N-（三氯乙酰基）-氨基磷酸酯 (HL) 孵育的活力。 (M ± m, n =8); *p <0.05 与对照细胞相比

应该注意的是，在 10 μM 浓度的 HL 作用下，在 72 小时时检测到 CCRF-CЕM 细胞活力（IC50）降低了 50%（图 5）。最近，我们已经证明另一种 CAPh 代表二甲基叶酸-N-三氯乙酰磷酰胺在 1 mM 浓度下在 72 小时后导致 CCRF-CЕM 细胞活力降低 50% [16]。这些数据的比较分析表明，在 CAPh 衍生物的结构中引入苯氧基而不是 morfolido 基团，可以将其对白血病细胞的有效毒性浓度降低两个数量级。我们假设–P(O)(OC6H5)核心的构象灵活性确保了该化合物与DNA更有效的相互作用。

未检测到单独使用 C60 富勒烯对培养期间细胞活力的影响（数据未提供）。同时，图 6 中显示的结果表明 C60 富勒烯增强了 HL 对 CCRF-CЕM 细胞的细胞毒活性。在 C60 富勒烯和 HL 的联合作用下，在较低的 HL 浓度 (5 μM) 和较早的孵育时间 (48 小时) 下，与单独 HL 的作用相比，观察到细胞活力降低了 50%。此外，在 C60 富勒烯和 HL 联合作用 72 小时时，在 2.5 μM 的低浓度下检测到 HL 的细胞毒作用，此时 HL 本身对细胞活力没有影响（图 6）。

CCRF-CEM 细胞与二苯基-N-（三氯乙酰基）-氨基磷酸酯 (HL) 单独或与 16 μM C​​60 富勒烯组合孵育的活力。 (M ± m, n =8); *p 与对照细胞相比<0.05； ^# p <0.05 与 HL 相比

因此，C60 富勒烯被证明可以增强 HL 的细胞毒性作用，并在低浓度下显着增加白血病细胞对其作用的敏感性。考虑到 C60 富勒烯能够在 24 小时内积聚在白血病细胞内 [28] 并定位在细胞内隔室 [29,30,31]，特别是在细胞核中 [32, 33]，它与细胞核 DNA 的相互作用不应排除增殖的癌细胞。

因此，体外获得的数据与计算机研究的结果一致，表明 C60 分子的初始结合，然后是 HL 与小 DNA 凹槽的初始结合并形成稳定的复合物可能是它们协同抑制CCRF-CЕM细胞增殖。

红细胞抗溶血性

在评估 HL 和 C60 富勒烯组合的抗癌潜力时，重要的是要考虑其对非恶性细胞，尤其是血细胞的可能影响。

研究红细胞对酸性溶血的抗性可以阐明药物在膜水平上的影响。溶血动力学反映了红细胞质膜破裂的动力学及其结构组织的稳定性。在图 7 中，溶血红细胞百分比的依赖性在没有添加物（对照）和单独或组合的 HL 或 C60 富勒烯的 NaCl 溶液中孵育 1 小时。未检测到 16 μM C​​60 富勒烯对红细胞溶血的影响（未显示）。 2.5 μM 浓度的 HL 单独或与 C60 组合影响红细胞对溶血的抵抗力（图 7）。同时，检测到在 10 μM 浓度的 HL 作用下，溶血加速，最大为 20 s。 10 μM HL 和 C60 富勒烯联合作用后，20 秒时 60% 的溶血红细胞进一步溶血强化。

在二苯基-N-（三氯乙酰基）-氨基磷酸酯 (HL) 单独存在和与 16 μM C​​60 富勒烯结合的情况下，红细胞对溶血具有抗性。 (M ± m, n =8)

获得的数据表明，C60 富勒烯与 2.5 μM HL 的组合应用对血红细胞膜的结构稳定性没有有害影响，同时允许在这种低浓度下显着增加 HL 对白血病细胞的细胞毒活性。尽管 10 μM 浓度的 C60 富勒烯和 HL 对白血病细胞具有协同细胞毒作用，但它们的组合应用似乎受到溶血作用增强的限制。

最后，在上述体外研究的背景下，重要的是要强调水/固体界面有密闭水，这也会影响纳米结构的传输、热力学特性 [34, 35] 以及它们与细胞膜的相互作用[36].

有关于氨基甲酰氨基磷酸酯衍生物的细胞内定位的文献数据，特别是氨基磷酸酯进入细胞的渗透。因此，氨基磷酸酯衍生物可以穿透 MDA-231 乳腺癌和肺癌（H460、H383 和 H2009）细胞系的膜 [37]。硝基苄基磷酰胺芥末被证明可以渗透细胞膜并定位在 NTR ⁺ 的线粒体中 哺乳动物细胞 [10]。不排除 C60 富勒烯能够通过被动扩散或内吞作用穿透癌细胞膜 [28, 30, 32] 并在细胞核和线粒体中积累 [30, 32, 33]，可能是一种抗肿瘤小分子转运体[38,39,40].