使用多功能 GaN/Fe 纳米颗粒靶向内皮细胞

背景

近年来，已经采取了许多努力来使用纳米技术对抗癌症和相关疾病。最常见的方法之一是基于可用作药物载体的纳米颗粒 [1, 2]。然而，这种方法的局限性在于必须用识别配体涂覆纳米颗粒以进行药物吸附和共价结合，或者由于需要将药物封装在纳米颗粒内。另一种治疗方法是利用纳米粒子进行直接细胞治疗，即以生物学方式治疗疾病的目标部位[3]。例如，装载有磁性纳米颗粒的内皮细胞可以通过外加磁场引导至动脉损伤部位。除了治疗应用外，纳米粒子辅助细胞引导还可用于体外细胞分离和三维结构的细胞涂层 [4]。在本文中，我们证明内皮细胞吸收GaN/Fe基纳米颗粒，并且这种现象可用于控制体外细胞的空间分布。

方法

纳米粒子合成

通过 HVPE 在与 Fe2O3 合金化的 ZnO 纳米粒子上分两步生长薄层 GaN。最初，成核层在 600 °C 下沉积 5 分钟。随后，将温度升至 800 °C 并在此温度下保持 10 分钟。第二个温度范围对于 ZnO 核分解和 GaN 晶体质量的提高是必要的。我们小组之前已经详细描述了 GaN 的生长 [5, 6]。简而言之，我们使用金属镓、氨 (NH3) 气、氯化氢 (HCl) 气和氢气 (H2) 作为载气。在GaN生长过程中，HCl、NH3和H2的流速分别为20、600和3500sccm。

细胞培养

通过用手术刀轻轻刮掉内皮细胞层，从主动脉中分离出猪主动脉内皮细胞。细胞在标准培养箱中于 37 °C 和 5% CO2 的 EGM™-2（内皮生长因子培养基 2，Lonza）中培养。使用 TrypLE™Select(1X) (Gibco®) 进行细胞分裂。对于所有实验，使用第 3 代和第 8 代之间的细胞。如别处所述，通过慢病毒转导用绿色荧光蛋白（GFP）标记细胞[7]。

XTT 检测

当添加补充有纳米颗粒的新培养基时，在培养基更换后 24 小时开始 XTT 测定。然后将培养基更换为具有 2:1 比例的 XTT 试剂的新鲜 EGM2 培养基。 XTT 试剂由 5 ml XTT 中的 0.1 ml 电子偶联试剂组成。在 37 °C 和 5% CO2 下孵育 4 h 后，在 Paradigm 多模式读板机上测量吸光度。

细胞计数

将细胞与不同浓度的纳米颗粒孵育 2 天后，将细胞在 4% 多聚甲醛中固定 10 分钟，用 PBS 洗涤，并用 DAPI（在 PBS 中稀释 1:7500）染色 10 分钟。使用安装在荧光显微镜（蔡司）上的高分辨率相机从六个独立的孔中拍摄随机视野。计算机辅助软件DotCount v1.2 [8]用于定量每孔细胞的相对数量并与对照进行比较。

透射电子显微镜

将细胞与纳米颗粒孵育 1 天后进行透射电子显微镜检查。在细胞达到 50% 汇合后，将培养基更换为补充有 50 μg/ml GaN/Fe 纳米颗粒的培养基，并将细胞再孵育 24 小时。然后用 PBS 洗涤细胞，在室温下在 2% 戊二醛和 2% 甲醛中固定 2 小时，然后在 4°C 下孵育过夜。将样品在 0.1 M 甲胂酸钠中洗涤，并在 0.1 M 甲胂酸钠中的 1% OsO4 中后固定 1 小时。固定后，样品在梯度丙酮系列中脱水并嵌入 EPON。聚合在 60°C 下进行 2 天。约 50 nm 厚的薄片收集在涂有 formvar 的铜槽网格上，并用 4% 醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色。使用透射电子显微镜 FEI Tecnai 20 在 200 kV 加速电压下对细胞切片进行详细研究。

结果与讨论

通过在与 Fe2O3 合金化的 ZnO 牺牲纳米粒子上生长 GaN 层，已经制造出多功能磁性纳米粒子。在使用氢化物​​气相外延 (HVPE) 生长 GaN 层后，ZnO 核被分解。所得化学稳定纳米粒子主要由 GaN 壳组成，其磁性归因于沉积的 GaN 中铁原子的扩散以及 GaN 内表面上与 Fe2O3 合金化的 ZnO 薄膜中存在的 Fe 原子壳。使用电子显微镜研究这些纳米颗粒。在 GaN 的 HVPE 生长过程之后，横向尺寸范围为 20 到 100 nm 的单晶纳米粒子在空间上保持分离（图 1）。 GaN 生长前后纳米颗粒的 X 射线衍射和拉曼光谱表征（图 1c、d）的结果证明了 ZnO 核的分解和 GaN 纳米颗粒的形成。通过使用能量色散 X 射线分析 (EDX) 对纳米粒子进行的化学分析证实了 GaN 层的生长和 ZnO 核的分解（图 1e、f）。请注意，与初始纳米粒子相比，所得材料显示出相对较高（约 50%）的 Fe 浓度。

纳米粒子的分析。 一 在与 Fe2O3 合金化的 ZnO 牺牲纳米粒子上生长的 GaN 纳米粒子的 SEM 图片。 b 所得 GaN/Fe 纳米颗粒的 TEM 图像。 c 初始 ZnFe2O4 纳米颗粒和所得 GaN/ZnFe2O4 纳米颗粒的 XRD 图。 d GaN 生长后初始和所得纳米颗粒的拉曼光谱。 e 与 Fe2O3 纳米颗粒合金化的 ZnO 的 EDX 分析。 f GaN层生长后所得纳米颗粒的EDX分析

GaN/Fe 基纳米颗粒与原代猪主动脉内皮细胞一起孵育。如前所述，内皮细胞可以耐受浓度低于 100 μg/ml [5] 的 GaN 纳米颗粒。在孵育过程中，内皮细胞占据了周围培养基中的大部分纳米颗粒，同时保持细胞迁移和增殖。尽管如此，我们注意到随着培养基中纳米颗粒浓度的增加，活细胞的数量有所减少。图 2 中的 XTT 测定结果证实了这种趋势。

纳米粒子对细胞活力的影响。将细胞与不同浓度的纳米颗粒孵育 1 天后测量的浓度依赖性 XTT 减少。在 XTT 测定结束时计数的细胞数表示相对于未处理的细胞。数值表示为两次独立实验的平均值±标准偏差，重复六次

为了了解 GaN/Fe 纳米粒子如何与细胞相互作用并确定它们在细胞内的定位，我们使用透射电子显微镜 (TEM) 进行了彻底的形态分析。将猪主动脉内皮细胞与 50 μg/ml 纳米颗粒孵育 1 天后，纳米颗粒被证明位于细胞内的囊泡中（图 3a）。在细胞质或细胞核中未发现纳米颗粒。纳米颗粒的吸收过程如图 3b-d 所示。大多数纳米粒子通过经典摄取途径之一被细胞摄取，即通过微胞饮作用、网格蛋白介导的内吞作用或小窝蛋白介导的内吞作用 [9]。内化过程取决于细胞类型和局部细胞环境以及粒子本身的理化特性（例如，大小、形状、表面电荷）。就内皮细胞而言，据报道，由于这种细胞类型中存在大量的小窝蛋白，小窝蛋白介导的内吞作用对纳米颗粒摄取的影响比其他机制更大 [10, 11]。

从与 GaN/Fe 纳米颗粒一起孵育的单个内皮细胞拍摄的 TEM 图片。 一 细胞囊泡内的纳米颗粒分布。 b –d 纳米颗粒进入囊泡的过程。 红色箭头 表示与生物介质相比，由于原子密度高而在 TEM 中显得更暗的纳米颗粒

由于上述掺入了大量的 Fe，所得纳米颗粒表现出铁磁性，以及 GaN 半导体材料固有的压电性 [12, 13]。这两个基本特性可用于远程激活纳米粒子中的某些过程和/或它们在相关介质中的受控引导和空间分布。压电特性可用于在 GaN 纳米粒子中诱导电极化，例如通过施加的超声场。通过这种方式，人们可以向细胞传输电信号以激活或抑制特定的细胞过程。至于由铁含量赋予的磁性，它们使人们能够实现细胞空间位置的动态可视化和控制。为了通过实验证明后一种可能性，将内皮细胞在补充有 50 μg/ml GaN/Fe 纳米粒子的 EGM™-2 培养基中培养 3 天（直到细胞融合 70-80%）。随后，将细胞从表面分离并重新悬浮在 EGM™-2 中。请注意，使用 TrypLE™ Select 和离心分离细胞既不会影响细胞活力，也不会导致纳米颗粒从细胞中释放（数据未显示）。接种后立即将细胞在 37°C、5% CO2 的标准培养箱中培养，将培养板置于永磁体上。图 4 显示了在存在和不存在磁场的情况下载有纳米颗粒的内皮细胞的分布。图 4a 描绘了在没有磁场的情况下孵育的载有纳米颗粒的细胞，而在图 4b 中，没有纳米颗粒的内皮细胞在磁场中孵育。这些图片显示了两种情况下细胞的随机分布。根据磁场图，在磁场梯度中培养载有纳米颗粒的细胞会导致细胞在某些区域预先设计分布。图 4c 描绘了在由七个直径为 5 毫米、厚度为 1 毫米的稀土钕圆形磁铁产生的磁场中培养 1 天后培养板中的细胞。图 4d 说明了在由直径为 7 毫米、厚度为 1 毫米的单个环形磁铁产生的磁场中孵育后的细胞分布。在这两种情况下，磁铁都放置在培养板下方。

使用磁场引导载有纳米颗粒的内皮细胞。对照组显示a的空间分布 以纳米颗粒为靶点的内皮细胞在无磁场和b的情况下培养 在磁场中培养的无纳米颗粒的内皮细胞。 c , d 在磁场中培养 1 天后，纳米颗粒靶向的内皮细胞分布

结论

我们首次证明了具有磁性的 GaN/Fe 基纳米粒子被内皮细胞吸收并储存在囊泡内。可以使用外加磁场以受控方式引导载有 GaN/Fe 纳米颗粒的内皮细胞。这些结果为体外改造三维组织或在体内将细胞靶向组织损伤部位开辟了新的可能性。与此同时，具有固有压电特性的 GaN 纳米粒子在细胞中的存在为细胞生物过程的远程电刺激铺平了道路。我们的实验室正在研究这种有前景的方法。

缩写

EDX：

能量色散X射线分析

EGM™-2：

内皮生长因子培养基

铁：

铁

Fe2O3 :

氧化铁（III）

氮化镓：

氮化镓

GFP：

绿色荧光蛋白

H2 :

氢气

HCl：

氯化氢

NH3 :

氨

OsO4 :

四氧化锇

PBS：

磷酸盐缓冲盐水

SEM：

扫描电镜

TEM：

透射电子显微镜

XRD：

X射线衍射

氧化锌：

氧化锌